Transcripción Iniciar asignación de sitios usando portadora de entrada súper baja-CAGE
26 de junio de 2019
Cap Analysis of Gene Expression (CAGE) es un método para la cartografía cuantitativa de los extremos de mRNA 5 para capturar sitios de inicio de transcripción de ARN polimerasa II con una resolución de un solo nucleótido. Este trabajo describe un protocolo de baja entrada (SLIC-CAGE) para la generación de bibliotecas de alta calidad utilizando nanogramos-cantidades de ARN total.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación genética, ya que permite el descubrimiento del promotor principal y potenciador utilizando cantidades bajas de material de partida. La principal ventaja de esta técnica es que permite un mapeo imparcial de resolución de nucleótido único en todo el genoma de los sitios de inicio transcripcional de ARN polimerasa II utilizando sólo 10 nanogramos de ARN total. CAGE está demostrando ser invaluable para descubrir sitios de inicio de transcripción asociados a la enfermedad que se pueden utilizar como marcadores de diagnóstico.
SLIC-CAGE extiende estos descubrimientos para escalar muestras como biopsias de tejido. SLIC-CAGE es ideal para el análisis promotor en profundidad y de alta resolución de tipos de células frágiles, incluidas las primeras etapas del desarrollo embrionario o el tejido embrionario de una amplia gama de organismos modelo. Dado que hay numerosos pasos en este protocolo, es crucial minimizar la pérdida de muestra en cada paso teniendo cuidado de recuperar tanto material como sea posible al transferir entre tubos.
Comience preparando la mezcla de PCR para cada plantilla. Combine buffer, dNTP, imprimación delantera única, plásmido de plantilla con el gen portador sintético y polimerasa de fusión de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Mezclar los reactivos por pipeteo.
Agregue 90 microlitros de la mezcla de PCR a 10 microlitros de cada imprimación inversa y mezcle. Consulte el manuscrito para conocer las condiciones de termociclismo. Realice la transcripción inversa o RT en el ARN de interés.
Combine un microlitro de imprimación de transcripción inversa, 10 nanogramos de ARN y 4. 990 nanogramos de mezcla portadora en un volumen total de 10 microlitros. Mezclar en pipeteando arriba y abajo. Calienta la mezcla a 65 grados centígrados durante cinco minutos y luego colóquela inmediatamente sobre hielo.
Preparar la mezcla RT de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y añadir 28 microlitros de la mezcla a 10 microlitros de ARN. Mezclar el contenido del tubo pipeteando hasta que sea homogéneo. Ejecute RT en un termociclador.
Una vez completada la transcripción inversa, purifique el producto con cuentas magnéticas SPRI libres de DNase y RNase. Agregue las perlas a la mezcla RT en una relación de volumen de 1.8 a uno y mezcle bien por pipeteo. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Luego, coloca las cuentas en un soporte magnético y deja que se separen durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 70% de etanol recién preparado a las perlas. No mezcle las perlas ni las quite del soporte magnético y retire el etanol inmediatamente después de añadirlo.
Mantenga el tubo en el soporte magnético y retire todos los rastros de etanol empujando las gotas restantes hacia fuera con una pipeta P10. Agregue inmediatamente 42 microlitros de agua, y pipetee hacia arriba y hacia abajo 60 veces para eluir la muestra, teniendo cuidado de no causar espuma. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante cinco minutos sin la tapa y luego separar las perlas en el soporte magnético.
A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos, teniendo cuidado de recuperar todo el sobrenadante, pero evitar el traspaso de cuentas. Después del tratamiento con RNase I, mezcle 45 microlitros de muestra con 105 microlitros de cuentas de estreptavidina preparadas e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, pipetear la muestra cada 10 minutos para mezclar.
A continuación, separe las perlas en el soporte magnético y retire el sobrenadante. Lave las perlas con los buffers A, B y C.A partir del buffer A, resuspender las perlas en 150 microlitros de tampón. Separe en el soporte magnético durante dos o tres minutos, y luego retire el sobrenadante.
Precaliente los tampones B y C a 37 grados Centígrados y repita los pasos de lavado. Para eliminar todo el ARN sin tapar, es crucial lavar a fondo las perlas de estreptavidina y las paredes del tubo y eliminar completamente el tampón de lavado antes de agregar el siguiente. Para liberar el ADNc, resuspender las perlas en 35 microlitros de 1X RNase I buffer e incubar a 95 grados Celsius durante cinco minutos.
Después de la incubación, coloque inmediatamente las cuentas sobre hielo durante dos minutos. Separe las perlas en un soporte magnético y transfiera el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos. Resuspender las perlas en 30 microlitros de 1X RNase I buffer y luego separar en un soporte magnético.
Combine el sobrenadante con el sobrenadante previamente recogido para un volumen total de aproximadamente 65 microlitros. Realice qPCR para determinar el número de ciclos de PCR para la amplificación de la biblioteca de destino. Prepare las mezclas maestras qPCR para amplificar bibliotecas enteras de ADN del portador.
Establezca las condiciones de termociclismo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y amplíe la muestra preparada. El protocolo SLIC-CAGE permite obtener bibliotecas listas para la secuenciación a partir de nanogramos de material de ARN de arranque. La longitud del fragmento en la biblioteca final oscila entre 200 y 2.000 pares base.
Los fragmentos más cortos son artefactos PCR y pueden causar problemas de secuenciación en la línea. Se pueden realizar rondas adicionales de selección de tamaño para eliminarlas. En comparación con NanoCAGE, SLIC-CAGE exhibe un rendimiento significativamente mejor en la identificación del sitio de inicio de transcripción, lo que es evidente a partir de las curvas características de funcionamiento del receptor de las dos técnicas realizadas en varias cantidades de ARN total de S.cerevisiae.
Al realizar este protocolo, es importante tener en cuenta que la pérdida de muestra puede dar lugar a bibliotecas de baja complejidad. Para evitarlo, se deben utilizar puntas y tubos de pipeta de baja unión. Sin SLIC-CAGE, el análisis promotor de varios tipos de células ha sido hasta ahora inaccesible.
Esto incluye el análisis de las etapas del desarrollo embrionario o tejido embrionario de una amplia gama de organismos modelo.
Descripción general
El análisis de extremos de ARNm (Cap Analysis of Gene Expression, CAGE) es una técnica para mapear los extremos 5’ del ARNm con el fin de identificar sitios de inicio de la transcripción con resolución de un solo nucleótido. Este artículo presenta el protocolo SLIC-CAGE, que permite la generación de bibliotecas de alta calidad a partir de pequeñas cantidades de ARN total.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Regulación génica
- Análisis transcripcional
- Secuenciación de RNA
Antecedentes
- CAGE permite el descubrimiento de promotores principales y potenciadores.
- Es eficaz con material inicial mínimo, utilizando solo 10 nanogramos de ARN.
- La técnica es útil para identificar sitios de inicio de la transcripción asociados a enfermedades.
- SLIC-CAGE es adecuado para analizar tipos celulares frágiles y tejidos embrionarios.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo de bajo contenido para el análisis de promotores de alta resolución.
- Ampliar las aplicaciones de CAGE a muestras pequeñas como biopsias de tejido.
- Mejorar la identificación de los sitios de inicio de la transcripción en diversos organismos.
Métodos Utilizados
- Preparación de la mezcla de PCR y transcripción inversa de ARN.
- Purificación de productos utilizando perlas magnéticas SPRI.
- qPCR para amplificación de la biblioteca y selección por tamaño.
- Comparación del rendimiento de SLIC-CAGE con NanoCAGE.
Resultados principales
- SLIC-CAGE produce bibliotecas listas para secuenciación a partir de cantidades de ARN en el rango de nanogramos.
- La longitud final de los fragmentos de la biblioteca oscila entre 200 y 2.000 pares de bases.
- Muestra un rendimiento mejorado en la identificación del sitio de inicio de la transcripción en comparación con NanoCAGE.
- Un manejo cuidadoso minimiza la pérdida de muestra, asegurando bibliotecas de alta calidad.
Conclusiones
- SLIC-CAGE permite un análisis detallado del promotor en tipos celulares previamente inaccesibles.
- El protocolo es fundamental para estudiar el desarrollo embrionario temprano.
- Mejora la comprensión de la regulación génica en diversos organismos modelo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación precisa del sitio de inicio de la transcripción permite la determinación exacta de los promotores y potenciadores principales, lo cual es fundamental para la validación de objetivos en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. SLIC-CAGE amplía esta capacidad a muestras con baja cantidad de material, como biopsias de tejidos y tipos celulares raros, ampliando así el rango de sistemas biológicamente relevantes accesibles para la reducción mecanicista de riesgos. Esto respalda la confianza predictiva en la selección de objetivos al vincular la regulación transcripcional con elementos genómicos asociados a enfermedades.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis transcripcionales mediante el mapeo a nivel del genoma completo de promotores y potenciadores con resolución de un solo nucleótido.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad biológica al vincular elementos reguladores con la expresión génica en sistemas relevantes para enfermedades.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de objetivos al identificar sitios de inicio de la transcripción asociados a enfermedades como posibles biomarcadores o anclas mecanicistas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos y reproducibles de TSS adecuados para la estandarización de ensayos en campañas de cribado centradas en promotores.
- Valor operativo: Permite la preparación de bibliotecas a partir de entradas de ARN en nanogramos, posibilitando el cribado escalable de muestras biológicas limitadas o valiosas.
- Valor científico: Produce bibliotecas listas para secuenciación con una distribución definida de longitud de fragmentos (200–2.000 pb), reduciendo artefactos y mejorando la fiabilidad de los datos para análisis posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita el descubrimiento traslacional de biomarcadores mediante la identificación de potenciadores y promotores activos en tipos celulares frágiles y tejidos embrionarios.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir un perfilado consistente de los sitios de inicio de la transcripción (TSS) en diferentes sistemas modelo y etapas de desarrollo.
- Valor científico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la correlación de la dinámica transcripcional con resultados fenotípicos en modelos preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
SLIC-CAGE se integra en la fase temprana del descubrimiento, apoyando la identificación de dianas mediante una comprensión mecanicista de la regulación génica antes de avanzar hacia la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Permite probar hipótesis y aclarar vías al mapear eventos de inicio transcripcional a lo largo del genoma.
- Detección: Proporciona mediciones cuantitativas de sitios de inicio de transcripción listas para ensayos, que respaldan la detección reproducible de compuestos en formatos con baja cantidad de muestra.
- Análisis: Ofrece datos de alta resolución sobre sitios de inicio de transcripción a nivel de nucleótido único y perfiles de longitud de fragmentos que permiten una comparación precisa de los estados transcripcionales entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al permitir el análisis de promotores y potenciadores en tejidos relevantes para enfermedades y modelos de desarrollo.
- Reutilización Empresarial: Establece un método estandarizado y reutilizable para el perfilado transcripcional que puede aplicarse en diversos proyectos y sistemas modelo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la incertidumbre en la anotación de promotores y potenciadores.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante la normalización basada en portadores y requisitos mínimos de entrada.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de riesgos regulatorios asociados con la modulación del objetivo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al vincular la actividad transcripcional con mecanismos de enfermedad y potencial de biomarcadores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular, manipulación de ARN y preparación de bibliotecas de secuenciación de nueva generación.
- Depende del acceso a termocicladores, soportes magnéticos, perlas SPRI e instrumentación de qPCR para la cuantificación de bibliotecas.
- Necesita protocolos estandarizados entre los equipos para garantizar la consistencia del portador y minimizar los efectos por lote en la detección de sitios de inicio de transcripción (TSS).
- Debe tener en cuenta las variaciones en la integridad del ARN y la calidad de la entrada al adaptarse a diversos sistemas modelo o muestras clínicas.
- Limitación práctica: la duración del protocolo, que abarca varios días, requiere una planificación cuidadosa y personal calificado para prevenir la pérdida de muestras durante los traslados.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
1:04
Preparation of DNA Templates
1:38
Reverse Transcription
2:24
Purification of cDNA:RNA Hybrids Using Magnetic Beads
3:42
Cap-trapping
5:16
Control of Degradation Level and Determination of the Number of PCR Cycles
5:39
Results: DNA Quality and Validation of SLIC-CAGE Libraries
6:26
Conclusion
