Name: Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende la técnica de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) para evaluar la biodistribución de anticuerpos terapéuticos y diagnósticos en modelos murinos de cáncer. Este método permite visualizar en tiempo real la distribución de anticuerpos en animales vivos.

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Agradecemos al Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) por las discusiones y el uso del equipo. Agradecemos al Dr. Juergen K. Willmann por su tutoría. Este estudio fue apoyado por la subvención NIH R21EB022214 (KEW), NIH R25CA118681 (KEW) y NIH K99EB023279 (KEW). El Servicio de Microscopía de Neurociencia de Stanford fue apoyado por NIH NS069375.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Panel Administrativo Institucional sobre Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC) de la Universidad de Stanford.
1. Modelo de ratón transgénico de desarrollo de cáncer de mama
<ol><li>Observe ratones del modelo de cáncer deseado para el crecimiento del tumor adecuado a través de la palpación o la medición de la pinza antes de proceder. NOTA: Aquí se utilizó el modelo murino transgénico del desarrollo del cáncer de mama (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Estos animales desarrollan espontáneamente carcinomas mamarios invasivos entre las 6 y 12 semanas de edad en cada glándula mamaria20. Las glándulas mamarias normales se utilizaron como controles de los habances transgénicos negativos y emparejados con la edad.</li>
</ol>2. Inyección intravenosa de agentes de anticuerpos específicos e inespecíficos
<ol><li>Purificar los anticuerpos de control de isotipo B7-H3 y IgG de conejo en una columna de desalación (por ejemplo, PD-10) para eliminar los conservantes y los tampones de almacenamiento siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: Algunos anticuerpos pueden necesitar una mayor purificación con el protocolo21basado en cuentas de agarosa en proteínas A.</li>
	<li>Dosis alícuotas de 33 g de cada conjugado de anticuerpos en tubos de microcentrífuga individuales. NOTA: La dosis del agente administrado puede variar dependiendo de la aplicación y coincide con las dosis en las que se utiliza rutinariamente el conjugado de anticuerpos. La concentración de las soluciones de anticuerpos es necesaria si el volumen es superior a 100 ml para la seguridad animal.</li>
	<li>En el punto de tiempo deseado antes de la recolección de tejido, aquí 96 h, anestesiar al animal portador del tumor con 2% de isoflurano fluyendo en oxígeno a 2 L/min, y colocar en una etapa calentada de 37 oC. Haga un pellizco de dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del de</li>
	<li>Para prepararse para la inoculación de la vena de cola de las soluciones de anticuerpos, desinfecte la cola del animal limpiando tres veces con una toallita de alcohol. Dilatar las venas de la cola calentando con una almohadilla de calor durante aproximadamente 30 s. Evite calentar todo el animal. Limpie la cola una vez más con una toallita de alcohol después de quitar la almohadilla de calor.</li>
	<li>Usando un catéter de vena de cola 27G, inserte la aguja de mariposa en una de las dos venas laterales de la cola y fije cuidadosamente la cola con la aguja insertada a la etapa con un pedazo de cinta quirúrgica. NOTA: El retroceso visible de la sangre hacia el catéter indica la ubicación adecuada de la aguja dentro de la vena de la cola.</li>
	<li>Enjuague el catéter con 25 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y, a continuación, inyecte la solución de anticuerpos en el catéter utilizando jeringas de insulina. Enjuague el catéter una vez más con 25 ml de PBS estéril.</li>
	<li>Retire la aguja de la cola y aplique presión para detener cualquier sangrado.</li>
	<li>Apague la anestesia y observe al animal hasta que esté completamente despierto para detectar cualquier signo de angustia.</li>
</ol>3. Recolección y preparación de tejidos tumorales diana
<ol><li>En el momento deseado, eutanasia humanamente al animal de acuerdo con el procedimiento institucional aceptable, aquí, por inhalación gradual de 100% CO2 de un tanque de gas comprimido con un caudal de desplazamiento de cámara de 10-30% volumen/min. NOTA: Algunas aplicaciones de la técnica IVIL requieren eutanasia por perfusión cardíaca con PBS para eliminar el anticuerpo circulante libremente19,22.</li>
	<li>Después de la confirmación de la eutanasia humana a través del cese del movimiento respiratorio y cardíaco, la falta de respuesta de pellizcar de los dedos del dedo del dedo del dedo del tiempo y el encaneado de las membranas mucosas, excluya los tejidos tumorales utilizando tijeras quirúrgicas y fórceps de la siguiente manera:<ol>
<li>Coloque el ratón en la posición supina y agarrando sólo la capa externa de la piel entre el conjunto de glándulas mamarias más cercanas a la cola(5o) con fórceps, haga una pequeña incisión con un par de tijeras quirúrgicas.</li>
		<li>Introducir las tijeras cerradas en el corte y abrir lentamente la punta para separar cuidadosamente la piel de la membrana de la pared abdominal subyacente manteniéndola intacta.</li>
		<li>Hacer una incisión vertical por el abdomen, continuando para separar la piel de la membrana interna. Entre las glándulasmamarias 3rd y 4, haz un corte horizontal a través del abdomen para permitir la retracción de la piel y la visualización de las glándulas mamarias. NOTA: Los tumores y glándulas mamarias se encuentran superficialmente debajo de la piel.</li>
		<li>Agarrando cada tumor o glándula normal con fórceps, recorta cuidadosamente la piel adherida usando tijeras quirúrgicas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los tejidos extirpados en moldes base desechables de tejido, preetiquetados y llenos con un medio de incrustación de temperatura de corte óptima (OCT) y congele los moldes rápidamente mediante la colocación en hielo seco. Con el fin de estudiar la administración fuera de destino, exponer otros tejidos u órganos de interés(porejemplo, el hígado o los pulmones). NOTA: Para pausar el protocolo en este punto, guarde los bloques de tejido congelado a -80 oC hasta que esté listo para continuar.</li>
	<li>Con un criostato, seccione los bloques de tejido congelado con un grosor de 10 m y coloque secciones adyacentes en diapositivas de vidrio de adhesión preetiquetadas. NOTA: Para pausar el protocolo en este punto, guarde las diapositivas a -80 oC hasta que estén listas para continuar.</li>
</ol>4. Protocolo de tinción Ex vivo
NOTA: Para la comparación cuantitativa entre imágenes de microscopía de fluorescencia, todas las diapositivas se tiñen al mismo tiempo con las mismas soluciones preparadas.
<ol><li>Enjuague los portaobjetos congelados con PBS a temperatura ambiente durante 5 min para eliminar los PTU.</li>
	<li>Demarca las secciones de tejido con una pluma de barrera hidrófoba para reducir el volumen de soluciones necesarias durante la tinción. NOTA: Tenga cuidado de no permitir que la pluma corra por encima de las muestras de tejido, ya que puede extraer el tejido de la diapositiva o evitar manchas adecuadas en la parte del tejido afectada. No permita que las secciones tisulares se deshidraten en ningún momento.</li>
	<li>Fijar las secciones de tejido con 4% de solución de paraformaldehído durante 5 min.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 min.</li>
	<li>Permeabilizar secciones de tejido con 0.5% Triton-X 100 en PBS durante 15 min.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 min.</li>
	<li>Bloquear los tejidos con 3% p/v albúmina sérica bovina (BSA) y 5% v/v suero de cabra, ambos en PBS (solución de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. NOTA: Haga coincidir el suero de la solución de bloqueo con el animal huésped de anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 min.</li>
	<li>Incubar secciones con anticuerpos primarios que mantengan registros como se desee, posiblemente un marcador nuclear común (por ejemplo, DAPI), vascular (por ejemplo, CD31) o citoplasma (por ejemplo, actina). Aquí, la rata antiratón CD31 (marcador vascular) a una dilución 1:100 se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante en la solución de bloqueo durante la noche a 4 oC protegida de la deshidratación en una bandeja deslizante. NOTA: No añada anticuerpos primarios adicionales ni conjugados de anticuerpos. El conjugado que se inyectó y se permitió que se acumulara en los tejidos in vivo actúa como el anticuerpo primario.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas en PBS durante 5 min tres veces, cambiando el PBS cada vez.</li>
	<li>Incubar diapositivas con anticuerpos secundarios para etiquetar anticuerpos primarios. Para esta aplicación, visualice el anticuerpo anti-B7-H3 utilizando el anticuerpo anticonejo de cabra conjugado AlexaFluor-546 (dilución 1:200, optimizado según las instrucciones del fabricante) y CD31 con anticuerpo secundario antirata de cabra AlexaFluor-488 (1:200 Dilución, optimizada según las instrucciones del fabricante) en solución de bloqueo, protegida de la luz y la deshidratación en una bandeja deslizante, durante 1 h a temperatura ambiente. NOTA: Los anticuerpos secundarios son del mismo animal huésped, pero coinciden con la afinidad de los anticuerpos secundarios con las especies anfitrionas del anticuerpo primario respectivo. Las diapositivas están protegidas de la luz a partir de este punto.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas en PBS durante 5 min tres veces, cambiando el PBS cada vez.</li>
	<li>Aplique una gota del medio de montaje en el centro de la rebanada de tejido y coloque cuidadosamente un cubreobjetos evitando el atrapamiento de burbujas de aire.</li>
	<li>Selle los bordes de la cubierta con esmalte de uñas transparente y deje secar. NOTA: Para pausar el protocolo durante un máximo de una semana en este punto, guarde las diapositivas a -20 oC hasta que estén listas para continuar.</li>
</ol>5. Imágenes por microscopía confocal y análisis cuantitativo de imágenes
NOTA: La preparación del microscopio confocal y los parámetros de imagen dependerá del sistema confocal utilizado. El microscopio utilizado aquí se compró comercialmente (por ejemplo, el sistema Zeiss LSM 510 Meta) y se utilizó el software de adquisición asociado (por ejemplo, Zen 2009). Sin embargo, muchos de estos pasos se aplicarán a cualquier microscopio confocal y asumirán conocimientos básicos de microscopía confocal.
<ol><li>Después de encender y calentar el sistema, seleccione el objetivo deseado; aquí se utilizó un objetivo de 20x (apertura numérica a 0,8).</li>
	<li>Cargue una diapositiva de control positivo, deslice hacia abajo, para permitir la optimización para la señal más brillante. Imágenes en el canal rojo, enfoque el sistema en la muestra en el modo de imagen en vivo.</li>
	<li>Para cada canal láser utilizado, optimice la intensidad del láser, la ganancia maestra y el tamaño del agujero de la siguiente manera:<ol>
<li>Cambie al modo continuo para la creación de imágenes.</li>
		<li>Optimice la intensidad láser (que controla la potencia del láser) y las barras deslizantes de ganancia (maestro) (que controla el voltaje del tubo fotomultiplicador) mientras supervisa el histograma de la tabla de búsqueda (LUT). Ajuste estos dos ajustes hasta que se llene el rango dinámico del histograma sin saturar píxeles. NOTA: Si la intensidad del láser es demasiado alta, se producirá un fotoblanqueo. Si la Ganancia (Maestro) es demasiado alta, la imagen se volverá ruidoso. Idealmente, la Ganancia (Maestro) estará en el medio de su rango.</li>
		<li>Ajuste el agujero en 1 unidad ventilada (AU), que proporciona la resolución más alta y la rebanada z más delgada.</li>
		<li>Deslice la barra de desplazamiento digital para minimizar el suelo de ruido en el histograma LUT para un fondo negro real. NOTA: Una vez que los ajustes de microscopía estén optimizados para cada canal láser y objetivo, manténgalos constantes durante toda la sesión de imágenes y para la toma de imágenes de todas las diapositivas, para permitir la comparación cuantitativa entre diapositivas.</li>
	</ol></li>
	<li>En la ficha Modo de adquisición, en Promedio, seleccione el número y la profundidad de bits deseados . Haga clic en el botón Óptimo para establecer el tamaño de píxel óptimo.</li>
	<li>Utilice el botón Adquisición de Snap para recopilar una imagen de alta calidad. Aquí, se seleccionaron campos de visión aleatorios dentro del tumor, pero otras áreas de interés pueden aplicarse para diferentes aplicaciones (vasos, márgenes tumorales, profundidad de penetración, etc.)</li>
	<li>Guarde los archivos de imagen en el formato utilizado por el software confocal (aquí, ".lsm") para el procesamiento y cuantificación sin conexión. NOTA: Si no todas las diapositivas se crean imágenes durante la misma sesión, guarde la configuración y vuelva a cargarla en visitas posteriores, aunque no se recomienda volver a crear una imagen de la misma diapositiva debido al fotoblanqueo.</li>
	<li>Realice las mediciones cuantitativas de intensidad de fluorescencia. Abra Fiji (Fiji is Just ImageJ software)19,23 y cargue un archivo de imagen .lsm arrastrándolo a la barra de estado.</li>
	<li>Divida los datos del canal de color. Vaya a Imagen > Pilas > Canales divididos.</li>
	<li>Preprocesar las imágenes de fluorescencia según sea necesario, es decir, restar la señal de fondo (Proceso > Restar fondo) o reducir el ruido a través de un método de filtrado.</li>
	<li>Segmente el canal de color correspondiente a la proteína de referencia (vascular, nuclear, mancha celular) estableciendo un umbral en la intensidad de la señal (Imagen > Ajustar > Umbral). NOTA: El umbral manual introduce la subjetividad en el análisis de imágenes, por lo tanto, el uso de un algoritmo de umbral automatizado o la referencia a histogramas de imagen hace que los resultados del análisis de imágenes sean menos sesgados.</li>
	<li>Utilice este umbral para crear una máscara binaria (Proceso > Binario > Convertir en máscara).</li>
	<li>Mida y etiquete los ROI dentro de la máscara (Analizar > Analizar partículas > Comprobar agregar al administrador > Aceptar).</li>
	<li>Aplique LOS ROI al canal de color correspondiente al anticuerpo de interés (Haga clic en imagen de canal, Analizar > Herramientas > Administrador de ROI > Medir). Esto aplicará los ROI de máscara a la imagen de anticuerpos y proporcionará mediciones de imagen para las secciones de etiquetas en la ventana Resultados. Guardar ventana de resultados(Archivo > Guardar).</li>
	<li>Calcular la estadística de interés deseada, como la intensidad media de fluorescencia como se describe aquí24.</li>
	<li>Realice todos los pasos de procesamiento de forma idéntica a cada imagen dentro de un conjunto de diapositivas. Cree una macro para hacer esto automáticamente para lotes de imágenes grandes23.</li>
	<li>Para la visualización de imágenes solo después de mediciones cuantitativas, aplique ajustes cualitativos de imagen para optimizar la visualización de patrones de biodistribución ajustando el mínimo, el máximo, el brillo y el contraste a los mismos niveles en todas las diapositivas (Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste).</li>
	<li>Convierta el tipo de imagen (Imagen > Texto > Color RGB) y guarde archivos en un tipo de imagen sin pérdidas como .tiff ( Archivo> Guardar como > Tiff...)para su uso en presentaciones y publicaciones.</li>
</ol>

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<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+reprograms+lymphatic+vessels+to+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
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<li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método tiene varios pasos críticos y requiere posibles modificaciones para garantizar una implementación correcta. En primer lugar, la dosis y el momento de la inyección intravenosa conjugada con anticuerpos/anticuerpos deben adaptarse a la aplicación específica. Generalmente, se deben utilizar dosis que sean consistentes con la forma en que el conjugado de anticuerpos se utilizará típicamente, es decir, dosis coincidentes del anticuerpo terapéutico o agente de contraste basado en anticuerpos. Además, se debe consid...

Los anticuerpos monoclonales (mAb) son grandes glicoproteínas (aproximadamente 150 kDa) de la superfamilia inmunoglobulina que son secretadas por células B y tienen una función primaria en el sistema inmunitario para identificar e inhibir la función biológica de, o marcar para patógenos bacterianos o virales, y puede reconocer la expresión anormal de proteínas en las células cancerosas1. Los anticuerpos pueden tener una afinidad extremadamente alta con sus epítopos específicos hasta las concentraciones femtomolares, lo que los convierte en herramientas altamente prometedoras en biomedicina2. Con el desarrollo de la tecnología de hibrioma por Milstein y K-hler (galardonado con el Premio Nobel en 1984), la producción de mAbs se hizo posible3. Más tarde, los mAbs humanos se generaron utilizando la tecnología de visualización de fagos o cepas de ratón transgénicas y revolucionaron su uso como nuevas herramientas de investigación y terapias4,5.
El cáncer es un problema de salud mundial y una de las principales causas de muerte, creando la necesidad de nuevos enfoques para la prevención, detección y terapia6. Hasta la fecha, los mAbs han permitido la extricación del papel de los genes y sus proteínas en la tumorigenesis y cuando se dirigen contra biomarcadores de cáncer, pueden permitir la detección y caracterización del tumor para la estratificación del paciente. Para la terapia oncológica, se están desarrollando como terapias los mAbs biespecíficos, los conjugados de anticuerpos y los anticuerpos más pequeños, y para la administración de fármacos dirigidos para mejorar la eficacia terapéutica7. Además, los anticuerpos sirven para la focalización de biomarcadores de agentes de contraste para modalidades de imágenes moleculares como cirugía guiada por fluorescencia, imágenes fotoacústicas (PA), imágenes moleculares por ultrasonido (EE. UU.) y emisión de positrones clínicamente utilizada tomografía (PET) o tomografía computarizada por emisión de fotones individuales (SPECT)8. Por último, los anticuerpos también se pueden utilizar como agentes ranosóticos que permiten la estratificación de los pacientes y el seguimiento de la respuesta para las terapias dirigidas9. Por lo tanto, los nuevos mAbs están empezando a desempeñar un papel crítico en la detección, diagnóstico y tratamiento del cáncer.
A pesar de los avances críticos en el desarrollo y producción de mAbs novedosos y altamente específicos, las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas pueden hacerse ineficaces debido a la complejidad del entorno tumoral. Las interacciones de anticuerpos dependen del tipo de epítopo, es decir,desi es lineal o conformacional10. Además del reconocimiento de antígenos, los anticuerpos necesitan superar las barreras naturales como las paredes de los vasos, las membranas basales y el estroma tumoral para llegar a las células diana que expresan el antígeno. Los anticuerpos interactúan con el tejido no sólo a través del dominio de unión de antígeno de fragmento variable (Fab), sino también a través del fragmento cristalino constante (Fc) que conduce a las interacciones fuera del sitio11. La segmentación también se complica por la expresión heterogénea de los marcadores tumorales a lo largo del tumor a granel y la heterogeneidad en la vascularización tumoral y el sistema linfático12,13. Además, el microambiente tumoral se compone de fibroblastos asociados al cáncer que apoyan las células tumorales, células inmunitarias tumorales que suprimen las reacciones inmunitarias antitumorales, y el endotelio tumoral que apoya el transporte de oxígeno y nutrientes, todos que interfieren con la penetración, distribución y disponibilidad de terapias o diagnósticos basados en anticuerpos. En general, estas consideraciones pueden limitar la eficacia terapéutica o diagnóstica, reducir la respuesta al tratamiento y provocar resistencia a los tumores.
Por lo tanto, para el desarrollo de terapias y diagnósticos eficientes basados en anticuerpos, es crucial evaluar la biodistribución y la interacción del conjugado basado en anticuerpos dentro del microambiente tumoral. Actualmente, en estudios preclínicos, la expresión marcadora en modelos de investigación tumoral se analiza ex vivo mediante la tinción de inmunofluorescencia (IF) de las secciones14del tumor. La tinción IF estándar se realiza con anticuerpos específicos de marcadores primarios que luego se resaltan mediante anticuerpos separados fluorescentes mente capacitados en rodajas de tejido tumoral ex vivo que se han aislado del animal. Esta técnica destaca la ubicación estática del marcador en el momento de la fijación del tejido y no proporciona información sobre cómo las terapias o diagnósticos basados en anticuerpos podrían distribuirse o interactuar en condiciones fisiológicas. Las imágenes moleculares de PET, SPECT, US y PA pueden proporcionar información sobre la distribución de agentes de contraste conjugados con anticuerpos en los modelos preclínicos vivos8,15. Dado que estas modalidades de diagnóstico por imágenes no son invasivas, se pueden realizar estudios longitudinales y se pueden recopilar datos sensibles al tiempo con un número mínimo de animales por grupo. Sin embargo, estos enfoques de imágenes moleculares no invasivos no son lo suficientemente sensibles y no tienen suficiente resolución para la localización de la distribución de anticuerpos a nivel celular. Además, las características físicas y biológicas del anticuerpo primario pueden modificarse drásticamente por la conjugación de un agente de contraste16.
Con el fin de tener en cuenta las condiciones fisiológicas y patológicas in vivo de cómo interactúan y diagnostica la terapia basada en anticuerpos dentro del entorno tumoral y obtener una distribución celular e incluso subcelular de alta resolución perfiles de anticuerpos no conjugados, proponemos un enfoque IF, considerado In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), en el que el anticuerpo específico del antígeno se inyecta in vivo por vía intravenosa. El tratamiento o diagnóstico basado en anticuerpos, que actúa como anticuerpo primario, circula en los vasos sanguíneos funcionales y se une a su proteína diana en el entorno tumoral vivo de alta precisión. Después del aislamiento de tumores in vivo-etiquetados con el anticuerpo primario, se utiliza un anticuerpo secundario para localizar conjugados de anticuerpos acumulados y retenidos. Este enfoque es similar a un enfoque histológico IF descrito anteriormente que inyecta anticuerpos etiquetados fluorescentemente17. Aunque aquí, el uso de anticuerpos no conjugados evita un cambio potencial en las características de biodistribución inducido por la modificación de anticuerpos. Además, la aplicación ex vivo de anticuerpos secundarios fluorescentes evita una posible pérdida de señal de fluorescencia durante la recolección y el procesamiento del tejido y proporciona amplificación de la intensidad de la señal de fluorescencia. Nuestro enfoque de etiquetado refleja la biodistribución in vivo de fármacos basados en anticuerpos y agentes específicos y puede proporcionar información importante para el desarrollo de nuevos agentes diagnósticos y terapéuticos.
Aquí, describimos dos aplicaciones del método IVIL aplicados en estudios anteriores que investigan la biodistribución y accesibilidad de agentes de contraste basados en anticuerpos para enfoques de imágenes moleculares para la detección del cáncer de mama. En primer lugar, la biodistribución de un conjugado de tinte infrarrojo cercano a los anticuerpos (anticuerpo anti-B7-H3 unido al tinte de fluorescencia infrarroja cercano, verde indocyanina, B7-H3-ICG) y el agente de control de isotipos (Iso-ICG) para fluorescencia y fotoacústica molecular imágenes se explora18. El método de esta aplicación se describe en el protocolo. A continuación, los resultados de la biodistribución de un anticuerpo sensible a la conformación a la netrina-1, normalmente no detectable con imágenes IF tradicionales, utilizadas con imágenes moleculares por ultrasonido, se cuantifican y presentan en los resultados representativos19. Al concluir este documento de protocolo, los lectores deben sentirse cómodos adoptando el método IVIL para sus propias aplicaciones de investigación basadas en anticuerpos.

<table><tbody><tr><td><Modelo >Animal fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>002374</td><td>Hembras, 4-6 semanas de edad</td></tr><tr><td>Animal Handling Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G</td><td>Catéter VisualSonics</td><td>Por favor llame para hacer un pedido</td><td>Kit</td></tr> <tr><td>de canulación de acceso a venas de cola Vevo MicroMarkerToallitas con alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246073</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gasa (4" x 4" 16 capas)</td><td>Cardinal Health</td><td>2913</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de calor</td><td>Morganville Scientific</td><td>&nbsp; HL0100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento Oftálmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>Cinta Quirúrgica</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura óptima de corte (OCT) Medio</td><td>Pinza Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Quirúrgica London</td><td>Fine Science Tools</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488 cabra anti-ratas IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-546 cabra anti-conejo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-594 cabra anti-humano IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11014</td><td></td></tr><tr><td>IgG humana Control</td><td>de isotipo Novus Biologicals</td><td>NBP1-97043</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo humanizado anti-netrina-1&nbsp;</td><td>Netris Pharma</td><td></td><td>contact@netrispharma.com</td></tr><tr><td>Conejo anti-Ratón CD276 (B7-H3)</td><td>Abcam</td><td>ab134161</td><td>EPNCIR122</td></tr><tr><td>Clon Rata anti-Ratón CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>MEC 13.3 Clón</td></tr><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Clavo transparente Polaco</td><td></td><td></td><td>Cualquier farmacia local</td></tr><tr><td>Verde de indocianina - NHS</td><td>Intrace Medical</td><td>ICG-NHS éster</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TA-006-FM</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19135680</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato estéril solución salina tamponada (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Correderas de vidrio</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización Fisher</td><td>Scientific</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>Correderas de cubierta de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544G</td><td></td></tr><tr><td>Pluma de barrera hidrofóbica</td><td>Ted Pella</td><td>22311</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>bandeja de tinción de portaobjetos</td><td>VWR</td><td>87000-136</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>LOCI, UW-Madison.</td><td>Versión 4.0</td><td>https://fiji.sc/</td></tr></tbody></table>

localización de inmunofluorescencia in vivo para la evaluación de la biodistribución de anticuerpos terapéuticos y diagnóstico en la investigación del cáncer

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son herramientas importantes en la detección, diagnóstico y tratamiento del cáncer. Se utilizan para desentrañar el papel de las proteínas en la tumorigenesis, se pueden dirigir a biomarcadores de cáncer que permiten la detección y caracterización de tumores, y se pueden utilizar para la terapia contra el cáncer como mAbs o conjugados de anticuerpos-drogas para activar las células efectoras inmunes, para inhibir señaldelas, o matar directamente las células que llevan el antígeno específico. A pesar de los avances clínicos en el desarrollo y producción de mAbs novedosos y altamente específicos, las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas pueden verse afectadas por la complejidad y heterogeneidad del microambiente tumoral. Por lo tanto, para el desarrollo de terapias y diagnósticos eficientes basados en anticuerpos, es crucial evaluar la biodistribución y la interacción del conjugado basado en anticuerpos con el microambiente tumoral vivo. Aquí, describimos In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) como un nuevo enfoque para estudiar las interacciones de la terapéutica basada en anticuerpos y el diagnóstico en las condiciones fisiológicas y patológicas in vivo. En esta técnica, se inyecta invivo un anticuerpo terapéutico o diagnóstico específico para antígenos in vivo y localizado ex vivo con un anticuerpo secundario en tumores aislados. Por lo tanto, IVIL refleja la biodistribución in vivo de fármacos a base de anticuerpos y agentes dirigidos. Se describen dos aplicaciones de IVIL que evalúan la biodistribución y la accesibilidad de agentes de contraste basados en anticuerpos para la toma de imágenes moleculares del cáncer de mama. Este protocolo permitirá a los futuros usuarios adaptar el método IVIL para sus propias aplicaciones de investigación basadas en anticuerpos.

El método IVIL se utilizó aquí para examinar la biodistribución in vivo y la interacción tisular de B7-H3-ICG e Iso-ICG, permitiendo que los agentes, después de la inyección intravenosa en un animal vivo, interactúen con el tejido diana durante 96 h, y luego una vez que los tejidos cosechados, para actuar como los anticuerpos primarios durante la inmunomancha ex vivo. El método IVIL también se comparó con la tinción estándar ex vivo IF de los tejidos para el marcador B7-H3. Las glándulas ...

El método de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) se puede utilizar para examinar la biodistribución in vivo de anticuerpos y conjugados de anticuerpos con fines oncológicos en organismos vivos utilizando una combinación de segmentación tumoral in vivo e inmunostainización ex vivo Métodos.

Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Este protocolo para la localización de inmunofluorescencia in vivo, o IVIL, evalúa la biodistribución in vivo de anticuerpos diagnósticos y terapéuticos o agentes basados en anticuerpos para la investigación, detección y tratamiento del cáncer. A diferencia de la tinción inmunofluorescente convencional donde la expresión celular de antígenos se revela ex vivo, el método IVIL aclara cómo se distribuyen los anticuerpos y los agentes basados en anticuerpos en el animal vivo. Este video ayudará a comprender el flujo de trabajo general del método IVIL.Muestra detalles importantes para la reproducción exitosa del protocolo para otras aplicaciones y anticuerpos. Observe los ratones del modelo de cáncer deseado para el crecimiento tumoral adecuado a través de la palpación o la medición de la pinza antes de continuar. Purify conejo anti-ratón B7-H3 y conejo IgG isotip control anticuerpos en una columna de desalado para eliminar conservantes y tampones de almacenamiento siguiendo las instrucciones del fabricante.Dosis alícuotas de 33 microgramos de cada conjugado de anticuerpos en tubos de microcentrífuga individuales. Después de la anestesia como se describe en el protocolo de texto, prepararse para la inoculación de la vena de cola de las soluciones de anticuerpos. Desinfectar la cola del animal limpiando tres veces con una toallita de alcohol.Dilate las venas de la cola calentando con una almohadilla de calor durante aproximadamente 30 segundos. Evite calentar todo el animal. Usando un catéter de vena de cola de calibre 27, inserte la aguja de mariposa en una de las dos venas laterales de la cola.Visualice el flujo de sangre en el catéter para asegurarse de que la aguja está colocada correctamente de modo que las soluciones entren completamente en el animal en comparación con ser capturado en la cola. Utilice un trozo de cinta quirúrgica para fijar cuidadosamente la cola con la aguja insertada al escenario. Enjuague el catéter con 25 microlitros de solución salina estéril tamponada con fosfato.A continuación, inyecte la solución de anticuerpos en el catéter utilizando jeringas de insulina. Enjuague el catéter una vez más con 25 microlitros de PBS estéril. Retire la aguja de la cola y aplique presión para detener cualquier sangrado.Realizar la eutanasia humana del ratón como se describe en el protocolo de texto, y poner el ratón en la posición supina. Use tijeras quirúrgicas y fórceps para extirpar los tejidos tumorales. Usa fórceps para agarrar solo la capa externa de la piel entre el conjunto de glándulas mamarias más cercanas a la cola, y haz una pequeña incisión con un par de tijeras quirúrgicas.Introducir las tijeras cerradas en el corte, y abrir lentamente la punta para separar cuidadosamente la piel de la membrana de la pared abdominal subyacente, manteniéndola intacta. Hacer una incisión vertical en el abdomen, continuando separando la piel de la membrana interna. Entre la tercera y la cuarta glándula mamaria, hacer un corte horizontal a través del abdomen para permitir la retracción de la piel y la visualización de las glándulas mamarias.Agarrando cada tumor o glándula normal con fórceps, recorta cuidadosamente la piel unida usando tijeras quirúrgicas. Coloque los tejidos extirpados en moldes de base desechables de tejido que estén premarcados y llenos de un medio de incrustación óptimo de la temperatura de corte. Congele rápidamente los moldes colocando sobre hielo seco.Con el fin de estudiar el parto fuera del objetivo, excúyen otros tejidos u órganos de interés. Usando un criostato, bloques de tejido congelado de sección a 10 micras de espesor, y coloque secciones adyacentes en diapositivas de vidrio de adhesión preetiquetados. Enjuague los portaobjetos de tejido congelado con PBS a temperatura ambiente durante cinco minutos para extraer el medio de incrustación.Demarcar secciones de tejido con una pluma de barrera hidrófoba para reducir el volumen de soluciones necesarias durante la tinción. Fije las secciones tisulares con una solución de 4%paraformaldehído durante cinco minutos. Después de enjuagar los portaobjetos en PBS durante cinco minutos, permeabilizar las secciones de tejido con 0.5%Triton X-100 en PBS durante 15 minutos.Enjuague las diapositivas de nuevo en PBS durante cinco minutos. Bloquear los tejidos con PBS que contienen 3% de peso por volumen de albúmina sérica bovina y 5% de volumen de suero de cabra durante una hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar los portaobjetos en PBS durante cinco minutos, incubar las secciones con anticuerpos primarios que mantienen registros, como un marcador nuclear, vascular o citoplasmático común.Aquí, el CD31 antiratón de rata se utiliza en una dilución de uno a 100 en la solución de bloqueo. Las diapositivas con anticuerpo primario se dejan durante la noche a cuatro grados centígrados, protegidas de la deshidratación en una bandeja deslizante. Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en PBS durante cinco minutos tres veces.Cambie el PBS cada vez. Incubar las diapositivas con anticuerpos secundarios para etiquetar los anticuerpos primarios. Para esta aplicación, visualice el anticuerpo anti-B7-H3 usando el anticuerpo anti-conejo conjugado de cabra Alexa Fluor 546, y visualice CD31 con anticuerpo secundario anti-rata de cabra Alexa 488 en solución de bloqueo.Proteja los portaobjetos de la luz y la deshidratación en una bandeja deslizante durante una hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar las diapositivas en PBS como antes, aplique una gota del medio de montaje en el centro de la rebanada de tejido. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos, evitando el atrapamiento de burbujas de aire.Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y deje secar. Proceda con imágenes de microscopía confocal y análisis cuantitativo de imágenes como se describe en el protocolo de texto. Los micrografos confocales representativos muestran la comparación de anticuerpos específicos B7-H3 conjugados e isotipos inespecíficos de localización conjugada de anticuerpos-ICG en glándulas mamarias murinas que contienen tejidos normales o carcinoma.Las glándulas mamarias murinas normales de un animal inyectados por vía intravenosa con Iso-ICG o B7-H3-ICG y antimanchas mantenidas con CD31 no muestran manchas de los conjugados de anticuerpos. Se demostró que los tejidos normales no tenían expresión de B7-H3 mediante tinción de inmunofluorescencia ex vivo estándar. En los tumores mamarios invasivos, B7-H3-ICG se une fuertemente a la vasculatura, el primer punto de contacto in vivo, y luego es capaz de extravasar de la vasculatura para manchar heterogéneamente el epitelio tumoral.Iso-ICG muestra acumulación inespecífica dentro de los tejidos tumorales. La tinción inmunofluorescente ex vivo estándar muestra la expresión uniforme del marcador B7-H3 en células epiteliales y endoteliales. Los micrografos confocales representativos muestran el método de localización de inmunofluorescencia in vivo para detectar la expresión netrin-1 o la expresión de control de isotipo en el carcinoma murino y las glándulas mamarias normales.La localización de la inmunofluorescencia in vivo confirma la señal epitelial para netrin-1 en tumores MMTV-PyMT, pero no en las glándulas mamarias normales. Además, hay una fuerte señal netrin-1 en las células endoteliales en los tumores mamarios, como lo indica la señal amarilla colocada. La señal es significativamente más débil en las glándulas mamarias normales.El método IVIL deberá optimizarse en términos de dosificación de anticuerpos, tiempo de recolección de tejido y dilución secundaria de anticuerpos para una implementación exitosa. IVIL permite la focalización de epítopos conformacionales que no se pueden detectar mediante tinción de inmunofluorescencia estándar, que requiere procesamiento de tejido. Además, se pueden recolectar órganos sanos de ratones portadores de tumores para evaluar la administración fuera de la diana de anticuerpos terapéuticos.Con un mayor uso de terapias basadas en anticuerpos y agentes de contraste en la investigación y el manejo del cáncer, el método IVIL es altamente aplicable a la investigación y el desarrollo farmacéuticos. Los investigadores de terapias oncológicas, imágenes moleculares, inflamación y otras áreas pueden encontrar que el método IVIL proporciona información útil.

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