Name: Aspectos destacados de la colección de métodos JoVE: Interacciones proteína-proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Descubre métodos avanzados para estudiar interacciones proteína-proteína en biología molecular. Esta colección de JoVE presenta técnicas experimentales fundamentales para investigar complejos proteicos celulares.

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Los autores reconocen las subvenciones NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) y Alberta Prion Research Institute/Alberta Innovates Bio Solutions (201600018) otorgadas a M.O.

<ol><li>Jin, L., Wang, W., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interaction+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interaction by small molecules.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 435-456 (2014).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. 38 (1), 79-111 (2019).</li>
<li>Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cyclin-dependent+Kinase+1+Specific+Phosphorylation+Sites+by+an+In+Vitro+Kinase+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+Assay+Using+Endogenous+Nuclear+Proteins+from+Cells+Cultured+Under+Hypoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration-free+Vitro+of+Protein+Homo-oligomerization+Using+Commercial+Instrumentation+and+Free%2C+Open+Source+Brightness+Analysis+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calibration-free Vitro of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58157(2018).</li>
<li>Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2+in+1%3A+One-step+Affinity+Purification+for+the+Parallel+Analysis+of+Protein-Protein+and+Protein-Metabolite+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57720(2018).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Heterodimerization+of+Protein+Isoforms+Using+an+Situ+Ligation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an Situ Ligation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57755(2018).</li>
<li>Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Interactions+of+Globular+and+Filamentous+Proteins+by+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+%28NMR%29+and+Microscale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST).</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58537(2018).</li>
<li>Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Macromolecules+in+Solution+using+Small+Angle+X-Ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58538(2018).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Lundberg, E., Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics%3A+a+powerful+discovery+tool+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la generación de efectos biológicos. Muchos están íntimamente relacionados con la enfermedad, y se reconoce cada vez más que ofrecen objetivos importantes para la acción farmacológica1. Existen numerosas técnicas disponibles para estudiar estas interacciones proteicas, algunas de las cuales se discuten en esta colección o en otros artículos de JoVE. Cada técnica tiene sus propios méritos y limitaciones2; sin embargo, no existe una técnica perfecta para todos los IBP debido a la enorme diversidad de estas interacciones que ocurren en diferentes compartimentos subcelulares, con una amplia gama de afinidades (picomolar a milimolar), y pueden ser solo de naturaleza transitoria.
Los ensayos de quinasas in vitro son un enfoque indirecto para estudiar los IBP que se pueden utilizar para analizar cómo las quinasas desempeñan su función de transferir un grupo fosfato del ATP a un sustrato. Cui et al.3 utilizan esta técnica, junto con la digestión tríptica y la espectrometría de masas, para identificar los sitios de fosforilación específicos de quinasa-1 dependientes de ciclina en un fragmento de la proteína del centrómero humano F (CENP-F). Para la verificación funcional de nuevos sitios de fosforilación, los autores utilizan un ensayo de unión, que combina CENP-F que contiene una mutación fosfomimética y carioferina α, un receptor de transporte nuclear, lo que proporciona una validación cruzada.
La coinmunoprecipitación es un método ampliamente utilizado para estudiar IBP en el que se utiliza un anticuerpo para capturar un objetivo específico junto con cualquier otra molécula de proteína que esté asociada con él. Zheng y sus colegas4 aplican esta técnica para estudiar factores inducibles por hipoxia (HIF) que funcionan como heterodímeros compuestos por una subunidad α regulada por oxígeno y una subunidad β expresada constitutivamente también conocida como ARNT3. Una nota interesante sobre su protocolo es que las células se inducen y cosechan en condiciones hipóxicas, y las proteínas endógenas de las fracciones nucleares se coinmunoprecipitan. Como señalan los autores, una limitación del método es que no puede determinar si los IBP son directos o indirectos.
Nolan et al.5 presentan un protocolo para la medición del número de moléculas y su brillo en imágenes de microscopía de fluorescencia 'Number and Brightness' (N&B), que se puede aplicar a la detección de homooligomerización de proteínas. La técnica se puede utilizar tanto in vitro como in vivo y se ha aplicado para cuantificar con precisión el estado oligomérico de FKBP12F36V marcados con mVenus antes y después de la adición de un fármaco dimerizante. Los autores discuten los méritos de la técnica en relación con las tecnologías relacionadas y destacan la importancia de corregir el blanqueamiento y las fluctuaciones de intensidad a largo plazo. Los microscopios confocales equipados con detectores digitales facilitan la cuantificación, pero N&B también es posible con detectores analógicos.
La purificación por afinidad de complejos multiproteicos, junto con la identificación de sus componentes, ha sido una técnica ampliamente utilizada para comprender las funciones de dichas proteínas complejadas. En el protocolo de Luzarowski et al.6, esta técnica va un paso más allá al caracterizar simultáneamente tanto los IBP como las interacciones proteína-metabolito (PMI) en células vegetales transgénicas de Arabidopsis. Las nucleósidos difosfato quinasas marcadas se purifican por afinidad mediante el procedimiento de etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP) con proteínas capturadas y moléculas pequeñas que posteriormente se identifican mediante espectrometría de masas. La singularidad de este protocolo es la capacidad de identificar ligandos hidrófobos e hidrofílicos; es un protocolo de extracción tres en uno que permite estudiar tanto los IBP como los PMI y aplica la purificación por afinidad a la plantación de células.
El ensayo de ligadura de proximidad tiene la ventaja de ser utilizado para detectar interacciones entre proteínas endógenas en células y tejidos. Karchugina y Chernoff7 utilizan la técnica para mostrar la presencia de heterodímeros de las quinasas MST1 y MST2 en células de Schwann humanas (HSC) y células renales embrionarias humanas (HEK-293). Su artículo tiene varios consejos valiosos sobre cómo realizar la técnica con éxito. Se requieren anticuerpos primarios apropiados criados en diferentes especies contra cada proteína que interactúa, y dado que la especificidad y la sensibilidad de los anticuerpos son clave, las concentraciones de anticuerpos deben ajustarse con precisión. Los autores encontraron que los portaobjetos de cámara de vidrio son convenientes para analizar múltiples líneas celulares y combinaciones de anticuerpos, pero señalaron que es imperativo quitar todo el inserto de silicona entre pocillos para evitar diferencias en la distancia confocal durante la microscopía. Además, se utilizan varios controles positivos y negativos para validar los resultados.
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es un ensayo sensible que se puede utilizar para proporcionar resolución a nivel atómico e información cuantitativa sobre las interacciones de proteínas y las interacciones proteína-ligando. Winkelaar y sus colegas8 utilizan la técnica para estudiar la interacción de dos proteínas (vimentina y envoplacina) que se encuentran en los desmosomas, estructuras celulares involucradas en la adhesión de célula a célula que generalmente se encuentran en tejidos que experimentan un estrés mecánico intenso. Los autores utilizan un dominio de vimentina marcado con 15N y adquieren un espectro 2D utilizando la correlación cuántica única heteronuclear (HSQC). En presencia de un dominio de la envoplacina, se observa un extenso ensanchamiento de la línea y desaparición de picos, consistente con la interacción de la proteína. Los autores investigan además la base de la interacción utilizando mutagénesis y termoforesis a microescala (MST) para proporcionar información cuantitativa.
La dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) es una técnica que se puede utilizar para proporcionar información sobre el tamaño y las conformaciones de una macromolécula en solución y generar una envoltura molecular de grandes complejos multidominio o proteicos a baja resolución. En el protocolo de Mrozowich et al.9, la técnica se utiliza para generar una estructura de baja resolución de nidogen-1 y laminina γ-1 en complejo. La técnica puede ser de interés para los investigadores que estudian IBP en proteínas grandes con múltiples dominios globulares que son demasiado grandes para la espectroscopia de RMN y son difíciles de cristalizar para la cristalografía de rayos X.
Se ha estimado que hay unas 650.000 interacciones en el interactoma humano10, lo suficiente como para mantener ocupados a los investigadores en el campo durante algún tiempo. Un desarrollo reciente, posible gracias a los avances en microscopía, espectrometría de masas y aprendizaje automático, es la proteómica espacial que puede proporcionar una gran comprensión en esta área en el futuro11. Esta colección de métodos PPI ayudará a los investigadores a abordar este importante desafío y evitar posibles escollos.

aspectos destacados de la colección de métodos jove: interacciones proteína-proteína

JoVE Methods Collection Highlights: Protein-Protein Interactions

Aspectos destacados de la colección de métodos JoVE: Interacciones proteína-proteína

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Descubre métodos avanzados para estudiar interacciones proteína-proteína en biología molecular. Esta colección de JoVE presenta técnicas experimentales fundamentales para investigar complejos proteicos celulares.

Aspectos destacados de la colección de métodos JoVE: Interacciones proteína-proteína

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