Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

La inmunoprecipitación es una técnica muy poderosa para aislar y purificar una proteína diana. En condiciones suaves, las proteínas, reguladores o sustratos pueden ser co-inmunoprecipitados. A continuación, se puede descubrir una nueva red de interacción.

También se puede evaluar la actividad de la proteína inmunoprecipitada. En particular, la actividad de una quinasa puede ser probada en diferentes sustratos por etiquetado P32-ATP. Sin embargo, se puede evaluar la actividad de los inhibidores dirigidos a una quinasa implicada en una enfermedad.

Pueden constituir compuestos de plomo para desarrollar nuevos fármacos. Este método se puede extender desde mamíferos hasta levaduras o bacterias. Esta técnica no es tan difícil.

A los puntos clave: asegúrese de tener un control negativo para asegurarse de que la interacción detectada es específica, y elija cuidadosamente las condiciones de la lysis para mantener las interacciones y la actividad. Pequeños detalles y gestos son importantes para asegurar el éxito de esta técnica, y nunca se describen en materiales y métodos de artículos. Demostrando el procedimiento estará Fabienne Godin, un técnico de nuestro laboratorio.

Después de que las células se preparan en la sala de cultivo celular dentro del gabinete de bioseguridad, utilice una pipeta de 10 mililitros para retirar el medio de las placas y desecharlo en una botella de desecho dedicada con lejía. Luego, agregue 10 mililitros de DMEM suplementado con fresco, y vuelva a colocar las placas en una incubadora a 37 grados centígrados. Para preparar la mezcla de transfección, en un tubo de 15 mililitros, añadir 450 microlitros de 10 mililitros de solución de clorhidrato de Tris a pH 7.5, complementado con un EDTA mililolar y 50 microlitros de solución de cloruro de calcio molar 2,5.

Mezclar por inversión. En el tubo, añadir un volumen correspondiente a 10 microgramos de ADN plasmático, amplificado por un kit de midiprep de ADN, y diluido con el tampón de elución de este kit, y cuya concentración se ha determinado. Invierta el tubo para mezclar.

A continuación, con una agitación suave en un mezclador de vórtice, agregue lentamente 500 microlitros de concentrado de solución salina 2X tamponada BES, gota a gota en el tubo. Muévelo con mucho cuidado, para no perturbar la compleja formación entre el ADN y el fosfato cálcico. Incubar durante al menos 15 minutos, o hasta 45 minutos, a temperatura ambiente.

Ahora, transfiera la placa al transfecto de la incubadora al armario de seguridad. Añadir los complejos de ADN preparados gota a gota en las células por toda la superficie de la placa. Incubar de 24 a 72 horas en la incubadora a 37 grados centígrados.

Para prevenir la degradación de las proteínas, prepare el tampón de lelisis sobre hielo, teniendo en cuenta cuatro mililitros de tampón de lelisis para cada placa trans infectada. Tome la placa con células transfectantes de la incubadora. Retire el soporte y deséchelo en una botella de residuos de lejía dedicada.

Para lavar las células, añadir tres mililitros de PBS frío en el lado de la placa gota a gota, para evitar separar las células trans infectadas. Y gire suavemente la placa para extender el tampón por toda la superficie. Incline la placa para retirar el PBS y deseche en la botella de desecho.

Repita el lavado una vez más. Coloque el plato sobre hielo. Al final, retire cuidadosamente el resto del PBS.

A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de lysis fría a las células lavadas transinfectadas. Extiéndalo por toda la superficie de la placa. Incubar durante 10 minutos sobre hielo.

De vez en cuando, vuelva a extender el búfer por toda la superficie de la placa. Después de eso, utilice una espátula celular para raspar las células de la superficie y recogerlas en un tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 10 minutos a 10.000 veces G y cuatro grados centígrados.

Recoger el izado sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga y recoger una alícuota de 50 microlitros de esta fracción a otro nuevo tubo de microcentrífuga. Esta alícuota se utilizará para comprobar si las proteínas trans infectas están bien expresadas. Deseche el pellet en la basura.

En primer lugar, resuspender suavemente la solución de stock de cuentas de agarosa junto con el anticuerpo adecuado. Corte el extremo de una punta de 200 microlitros para hacer una abertura de uno a dos milímetros. Fije la punta a una micropipeta y extraiga 40 microlitros de la solución, lo que permite que las perlas entren en la punta.

Pipetear las perlas hacia arriba y hacia abajo varias veces para saturar la punta para asegurar el volumen correcto de las perlas y transferir las perlas a un tubo de microcentrífuga. Agregue 500 microlitros de tampón TNET, mezcle por inversión y centrifugar durante dos minutos a 1.000 veces G y cuatro grados Centígrados. Retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 500 microlitros de búfer TNET.

Incubar en una rueda giratoria durante al menos una hora a cuatro grados centígrados. Luego, centrifuga el tubo durante dos minutos a 1.000 veces G y cuatro grados Celsius y lave las cuentas dos veces con 500 microlitros de tampón de lelisis invirtiendo y centrifugando. Después del lavado, transfiera la fracción total previamente recogida de lysate en el tubo e incubar en una rueda giratoria a cuatro grados Celsius durante dos a cuatro horas.

Ahora, centrifuga el tubo que contiene las cuentas inmunoprecipitadas durante dos minutos a 1.000 veces G y cuatro grados centígrados. Lave las cuentas cinco veces con 500 microlitros de tampón de lelisis invirtiendo y centrifugando. Al lavar las cuentas, tenga cuidado de no acercarse demasiado de las cuentas mientras quita el sobrenadante.

De lo contrario, se aspirarán cuentas y al final del experimento, no quedarán más cuentas. Para la elución, primera centrífuga durante dos minutos a 1.000 veces G y cuatro grados centígrados. Utilice una micropipeta de un mililitro para quitar cuidadosamente el sobrenadante.

A continuación, con una jeringa Hamilton equipada con una aguja cementada, retire las últimas gotas del sobrenadante para evitar la aspiración de las perlas. A continuación, agregue 40 microlitros de búfer 4X Laemmli. Homogeneizar tocando suavemente el tubo.

Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, centrifugar durante cinco minutos a 10.000 veces G y temperatura ambiente. Con una jeringa Hamilton, transfiera el eluido del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Conservar a menos 80 grados centígrados. Las células HEK-293 fueron transfectadas con LIMK 2-1 sin etiquetar o una de las isoformas etiquetadas con HA de LIMK 2. LIMK 2-1 está bien expresado en las diferentes condiciones.

El anticuerpo anti LIMK 2-1 no reconoce las isoformas LIMK 2a y LIMK 2b, y es específico, ya que su señal disminuye cuando las células se trans infectan con ARN interferente pequeño LIMK2, en comparación con el control de ARN que interfiere pequeño. En varias líneas celulares humanas, LIMK 2-1 parecía expresarse en HEK-293 y HeLa, pero no en C6. Se utilizaron experimentos de coimuncipitación para evaluar la interacción de LIMK2-1 con la quinasa ascendente ROCK. Cada una de las diferentes proteínas codificadas por los vectores trans infectados se expresaron bien.

Las tres isoformas de LIMK2, así como larp6, fueron inmunoprecipitadas eficientemente. En los eluidos, SE detectó ROCK y por lo tanto coimmunoprecipitado con las tres isoformas de LIMK2, pero no con larp6. La interacción detectada es específica.

Coimmunoprecipitado LIMK 2-1 fue probado para su actividad quinasa a través de gamma P32 ETIQUETADO ATP. LIMK 2-1 no fosforilaba la cofilina, mientras que sí fosforilato mielina proteína básica, o MBP. LIMK 2-1 es inmunoprecipitado eficientemente en esta prueba.

Es fundamental tener un control negativo mientras se realiza la inmunoprecipitación para asegurarse de que la interacción es específica. La composición de un búfer de lelisis debe configurarse cuidadosamente para conservar la interacción y la actividad. Tras la inmunoprecipitación, se puede evaluar la actividad quinasa para contar diferentes sustratos.

La mutación puede introducirse fácilmente y puede desentrañar el papel de los residuos específicos. También se pueden realizar estudios funcionales para comprender el papel fisiológico de las nuevas interacciones resaltadas. Las celdas deben cultivarse en una sala de cultivo dedicada dentro de un gabinete de bioseguridad.

P32 ATP tiene que ser manejado con precaución específica. Escudo para protegerse de la radiación, contador Geiger, recolección de residuos específicos, insignias personales de pecho y dedo para detectar la exposición radiactiva y las puntas de filtro.