Name: Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprende a estudiar la dinámica nuclear en levadura de fisión durante mitosis y meiosis mediante microscopía de células vivas con Schizosaccharomyces pombe. Este método permite observar procesos celulares en tiempo real sin fijadores tóxicos.

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Los autores quieren agradecer a Natalia La Fourcade y Mon LaFerte por hacer de la preparación de este manuscrito un esfuerzo más agradable. Gracias a los miembros del Laboratorio de Forsburg que contribuyeron a la finalización de este trabajo con su visión, ideas de experimentos y apoyo moral. Este proyecto fue apoyado por NIGMS R35 GM118109 a SLF.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
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<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
<li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895(2012).</li>
<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
<li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13%2FMunc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li>
<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las imágenes de células vivas durante la mitosis y la meiosis ofrecen la oportunidad de examinar la dinámica nuclear sin interrumpir sustancialmente la fisiología de la levadura de fismo durante la adquisición de datos. Sin embargo, se debe tener precaución para garantizar que las células crezcan a las densidades deseadas libres de tensiones ambientales; y para la meiosis, que las células se imágen durante el tiempo de diferenciación terminal y no demasiado temprano o tarde. El exceso de habadeo celular, el hambre y las temperaturas de crecimiento inapropiadas son factores comunes que contribuyen a observaciones irreproducibles. Además, durante la construcción de la tensión, es crucial probar que las etiquetas fluorescentes no interfieren con las funciones de los genes diana ni afectan la aptitud celular general. Si no se inspeccionan de cerca los fenotipos de las cepas portadoras de marcadores fluorescentes, se pueden producir resultados inconsistentes e incomparables en genotipos similares.
Aunque las almohadillas de agarosa del microscopio son fáciles de montar, también pueden suponer un obstáculo para obtener valiosos datos de imágenes. Crear almohadillas de agarosa es tan simple como colocar tres diapositivas de microscopio paralelas entre sí, dispensar agarosa fundida en la diapositiva central y colocar una diapositiva que transversala la parte superior de las otras diapositivas. Es útil, sin embargo, montar un aparato de portaobjetos que permita modificaciones de anchura para fabricar almohadillas de agarosa resistentes y específicas de la situación. Un simple portaobjetos que proporciona flexibilidad de ancho de almohadilla consta de una plataforma (soporte de puntas de pipeta o banco), dos diapositivas de microscopio y cinta de laboratorio que actúa como mecanismo de ajuste de ancho de almohadilla (Figura1A). El grosor exacto de la almohadilla dependerá de los requisitos de tiempo de imagen, la marca de agarosa, la temperatura, el sellador de encubrimiento, la tasa de evaporación, etc. Por lo tanto, es importante calibrar el sistema de imágenes antes de la adquisición de datos para aumentar la reproducibilidad técnica y mejorar la calidad de las imágenes de células vivas1,2,3. La superficie de la almohadilla, la rigidez y la composición son esenciales durante la adquisición prolongada de la imagen. La agarosa tiene baja fluorescencia de fondo, se puede moldear fácilmente, y en la concentración adecuada, resiste la deformación estructural debido a la evaporación. Además, la combinación de medios de levadura de fission con agarosa no compromete la calidad de la imagen y permite la observación prolongada de múltiples ciclos de mitosis y meiosis. Además, es importante evitar cualquier burbuja de aire para la microscopía de lapso de tiempo. Dentro de las almohadillas de agarosa y dentro de la muestra, las bolsas de aire se expanden con el tiempo, causando el cambio de celda y alterando los planos focales. Siempre que las células se separen eficientemente por rotación de encubrimiento, los investigadores pueden seguir los procesos mitéticos a lo largo de varias generaciones y eventos meióticos desde la fusión nuclear hasta la esporulación. Hacer y elegir la almohadilla adecuada para los experimentos de imágenes requiere tiempo para dominar, pero una vez logrado, puede contribuir a observaciones de microscopio altamente informativas.
Como es el caso de otros métodos, la microscopía de células vivas no está libre de limitaciones técnicas. El uso de proteínas etiquetadas fluorescentes introduce límites a los experimentos que limitan el alcance de lo que se puede estudiar. El blanqueamiento fotográfico y la fototoxicidad son problemas típicos de la adquisición prolongada de imágenes. Pueden ser contrarrestados al no exponer las células a longitudes de onda cortas durante demasiado tiempo o con demasiada frecuencia. Para experimentos con GFP, CFP, YFP, mRFP y DsRed, proteínas fluorescentes típicas utilizadas en imágenes de células vivas de levadura de fission, es común emplear 5-15% de luz de excitación y 100-500 ms de tiempo de exposición para experimentos de rutina. Estos parámetros cambian, sin embargo, de acuerdo con los requisitos específicos del experimento del investigador. Además, las pilas z compuestas de 9-13 secciones con un espaciado de 0,5 m utilizando un objetivo de 60x es suficiente para resolver el grosor de una célula de levadura de fismo. Además, es importante confirmar que los marcadores fluorescentes no interrumpen la regulación o función adecuada de las proteínas diana ni generan fenotipos espurios. Por lo tanto, es aconsejable construir cepas que contengan diferentes etiquetas fluorescentes y de afinidad para el mismo gen objetivo para corroborar las observaciones por diferentes medios. Además, es responsabilidad de los investigadores asegurarse de que los parámetros experimentales se pueden reproducir a través de experimentos y que los datos recogidos son aptos para el análisis posterior1,3. Ninguna tecnología puede reemplazar la práctica probada de validar meticulosamente los sistemas experimentales mediante una observación cuidadosa y un examen riguroso de la linealidad en la detección de señales fluorescentes.
Por último, es crucial analizar los datos de microscopía en formatos que no modifiquen imágenes en bruto. Fiji proporciona excelentes herramientas de documentación para realizar un seguimiento de las mediciones de datos sin procesar y permite a los investigadores examinar diferentes parámetros celulares en una sola sesión. Estas características, así como su gran cantidad de tutoriales en línea y una amplia cobertura literaria, hacen de Fiji una herramienta importante para medir, analizar y presentar datos de imágenes de células en vivo que describen la dinámica nuclear de la levadura de fismo en la mitosis y la meiosis.

La microscopía de células vivas permite a los investigadores examinar la dinámica nuclear sin matar las células de levadura de festedez y elimina la necesidad de fijadores y manchas letales. Es posible observar la estabilidad, el movimiento, la localización y el tiempo de las proteínas etiquetadas fluorescentes que están involucradas en eventos importantes como la replicación cromosómica, la recombinación y la segregación, además de la membrana y la citoesquelética Movimientos. Al mantener la viabilidad celular y la detección de señal no tóxica, hay una mínima intrusión fisiológica. Cuando se realiza correctamente, este método de microscopía puede reducir los efectos de confunción que surgen de la manipulación técnica extendida o de la reactividad química falsa. Además, durante un experimento, los investigadores pueden hacer observaciones pertinentes de los estados nutricionales y de estrés de la levadura de fisión, la eficiencia proliferativa y el estado apoptotico que indican parámetros de imagen inapropiados o fisiología celular anormal1 ,2,3.
La mitosis y la meiosis se caracterizan por la división nuclear y celular. En la meiosis, contrariamente a la mitosis, el contenidogenético se reduce a la mitad a medida que las células madre dan lugar a células hijas 4. Dado que las imágenes de células vivas proporcionan una dimensión temporal además de la relación espacial, se pueden examinar un gran número de celdas en tiempo real. La microscopía de células vivas ha permitido a los investigadoresexaminar la dinámica de la división nuclear utilizando etiquetas fluorescentes para histonas 5, cohesinasubunidades 6, microtúbulos7, centromeres8, quinetocoros9, componentes de el cuerpo del polo de husillo (SPB)10, y los del complejo de pasajeros cromosómicos (CPC)11. Fuera del aparato de segregación cromosómica, las imágenes de células vivas también han capturado el comportamiento de las proteínas necesarias, pero no directamente implicadas en la segregación cromosómica. Se ha demostrado que la función de estas proteínas influye en la replicación, la recombinación cromosómica, el movimiento nuclear y la unión cromosómica a los microtúbulos12,13,14. Estas observaciones han contribuido a una mejor comprensión de los eventos celulares cuyos componentes funcionales no eran susceptibles de examen bioquímico o genético. Con los nuevos avances en la tecnología de microscopía, se reducirán limitaciones como la mala resolución, el fotoblanqueo, la fototoxicidad y la estabilidad del enfoque, facilitando así mejores observaciones en tiempo real de la dinámica nuclear mitótica y meiótica1, 2,3. La meiosis es particularmente difícil, ya que es una vía de diferenciación terminal que requiere una atención cercana a la sincronización.
El objetivo de este protocolo es presentar un método relativamente simple para examinar la dinámica nuclear de la levadura en tiempo real en la mitosis y la meiosis. Para lograr esto, es necesario utilizar células que no han estado expuestas al estrés ambiental, preparar almohadillas de agarosa que puedan soportar imágenes prolongadas y montar células en densidades que faciliten la visualización de la dinámica de una sola célula. Además, este protocolo hace uso de células que transportan proteínas etiquetadas fluorescentes que sirven como marcadores útiles para la cinética nuclear (Hht1-mRFP o Hht1-GFP), segregación cromosómica (Sad1-DsRed), dinámica de citoesqueleto (Atb2-mRFP), transcripción activación en G1/S (Tos4-GFP) y estabilidad de cohesión en la meiosis (Rec8-GFP). Este método también introduce marcadores nucleares ycitosólicos adicionales (Tabla I) que se pueden utilizar en diferentes combinaciones para abordar preguntas sobre procesos celulares específicos. Además, se ofrecen herramientas básicas de Fiji para ayudar a los investigadores a procesar imágenes de células vivas y analizar diferentes tipos de datos. La fuerza de este enfoque se deriva del uso de observaciones en tiempo real de la dinámica de proteínas, el tiempo y la estabilidad para describir los procesos que son integrales para la correcta ejecución de la mitosis y la meiosis.

<table><tbody><tr><td>Lente de objetivo apocromático Plan 60x</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de bailarinas del vientre</td><td>Stovall</td><td>Patente de EE. UU. # 4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2</td><td>0,Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Convolve 3D plug-in de software</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD CoolSnap HQ</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H20,END</td><td></td> <td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia de deconvolución DeltaVision</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Difracción PSF 3D plug-in de software</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Edimburgo medio mínimo (EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023; 1kg</td><td></td></tr><tr><td>de FeCl2&middot; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Software de deconvolución Huygens</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Software de deconvolución Imaris</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Iterativo Deconvolve 3D plug-in</td><td>de software OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de malta (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>Ácido molibdico</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nicotínico,Sigma</td><td></td> <td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pantoténico</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>Pombe glutamato medio (PMG)</td><td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 software de procesamiento de imágenes</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Esporulación Medio en polvo</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga con control de temperatura</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura más suplementos (YES)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

La imagen de células vivas es una técnica de microscopía utilizada para examinar la dinámica celular y proteica en células vivas. Este método de diagnóstico por imágenes no es tóxico, generalmente no interfiere con la fisiología celular y requiere un manejo experimental mínimo. Los bajos niveles de interferencia técnica permiten a los investigadores estudiar las células a través de múltiples ciclos de mitosis y observar la meiosis de principio a fin. Utilizando etiquetas fluorescentes como Green Fluorescent Protein (GFP) y Red Fluorescent Protein (RFP), los investigadores pueden analizar diferentes factores cuyas funciones son importantes para procesos como la transcripción, la replicación del ADN, la cohesión y la segregación. Junto con el análisis de datos utilizando Fiji (una versión gratuita y optimizada de ImageJ), las imágenes de células vivas ofrecen varias formas de evaluar el movimiento de proteínas, la localización, la estabilidad y el tiempo, así como la dinámica nuclear y la segregación de cromosomas. Sin embargo, como es el caso de otros métodos de microscopía, las imágenes de células vivas están limitadas por las propiedades intrínsecas de la luz, que ponen un límite a la potencia de resolución en aumentos altos, y también es sensible al fotoblanqueo o fototoxicidad a alta longitud de onda Frecuencias. Sin embargo, con cierto cuidado, los investigadores pueden eludir estas limitaciones físicas eligiendo cuidadosamente las condiciones, tensiones y marcadores fluorescentes adecuados para permitir la visualización adecuada de eventos mitéticos y meióticos.

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

La microscopía de células vivas permite a los investigadores estudiar la dinámica nuclear de la levadura de fisión en la mitosis y la meiosis en tiempo real. La fuerza de este método proviene del estudio de los procesos nucleares en células vivas en condiciones fisiológicas normales que elimina la necesidad de fijadores tóxicos y manchas. Esta técnica aborda cuestiones relacionadas con el tiempo de proteínas, la estabilidad y la movilidad que pueden no ser susceptibles a la manipulación genética o biomecánica.Es fundamental prestar mucha atención a la salud y la aptitud de las células de levadura de fisión antes de la toma de imágenes. Examine siempre la morfología y las características de crecimiento para garantizar la coherencia de los resultados en todos los experimentos. Este protocolo muestra la forma relativamente sencilla de preparar las diapositivas del microscopio que cuando se dominan correctamente pueden mejorar la consistencia y reproducibilidad de las imágenes de células vivas prolongadas.Para comenzar a recoger la materia celular de la placa de despertar criogénica, ártela en placas YES e incubarla a 25 grados centígrados o 32 grados centígrados dependiendo del genotipo de levadura para despertar las cepas de levadura de fisión de la preservación criogénica. Luego utilice un bucle estéril para recoger células de colonias individuales en las cepas de levadura de fisión despiertas e inocularlas en tubos de ensayo que contengan tres mililitros de medio líquido YES. Coloque los tubos en una coctelera a 150 a 220 rpm para crecer a 25 o 32 grados Celsius durante la noche hasta la fase de registro tardío con una lectura de densidad óptica deseada de 0,7 a 1,0.Transfiera 10 microlitros del cultivo a un portaobjetos de microscopio. Ponte un cubreobjetos y colóquelo bajo un microscopio para comprobar si hay morfología celular y estado nutricional adecuados. Para configurar un portaobjetos para el análisis de mitosis o meiosis primero añadir dos gramos de agarosa en el matraz de 500 mililitros que contiene 100 mililitros de medio mínimo más suplementos para mitosis o medio esporulante líquido para meiosis.Caliente la solución de agarosa en un horno microondas a una potencia del 60% en incrementos de 10 segundos o coloque el vaso de precipitados en un baño de agua de 55 grados centígrados durante 10 minutos. Gire la solución para garantizar un derretimiento eficiente. Configure dos diapositivas de microscopio en un soporte de punta de pipeta con la corredera superior apoyada en dos pilas de cinta de laboratorio en ambos extremos como soporte para hacer una forma cruzada.Ajuste la distancia entre las dos diapositivas a más de dos milímetros para formar una almohadilla gruesa en los siguientes pasos para obtener imágenes prolongadas. Después de enfriar la agarosa fundida durante un minuto a temperatura ambiente, retire la corredera superior y utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para dispensar de 50 a 100 microlitros en la corredera inferior para hacer un punto. Antes de que la agarosa se enfríe, coloque la corredera superior en la parte superior para generar una almohadilla de dispersión de aproximadamente uno y 1/2 a dos centímetros de diámetro.La creación de imágenes de células vivas óptimas es fundamental para los pasos posteriores del procesamiento de datos. Asegúrese de eliminar cualquier balbuceo de aire en la agarosa fundida y cree una almohadilla delgada para períodos de diagnóstico por imágenes de más de cuatro horas. Para examinar los eventos mitóticos crecen células de cultivos de inicio en EMM líquido o PMG más suplementos durante la noche.Transfiera un mililitro del cultivo a una cubeta, y mida el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nanómetros. El crecimiento celular se considera fase de registro medio cuando la densidad óptica alcanza 0.4. Luego centrifugar un mililitro de la suspensión celular a 1, 375 veces g durante un minuto.Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en un medio mínimo más suplementos a un volumen final de 100 microlitros. Para imaginar eventos meíticos crecen células de cultivos de inicio en medio mínimo más suplementos durante la noche. El crecimiento celular se considera fase de registro tardío cuando la densidad óptica a 595 nanómetros está entre 0,7 y uno.A continuación, de los cultivos de registro tardío obtienen 500 microlitros de cada cepa de tipo mate, H negativa y H positiva, y se combinan para hacer una suspensión celular de un mililitro. Centrifugar las células a 1, 375 veces g durante un minuto. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en un mililitro de extracto de maltosa líquida.Repita el lavado de extracto de maltosa tres veces más para asegurar la eliminación eficiente de nutrientes. Después del último extracto de maltosa, el lavado resuspendió las células en un mililitro de extracto de maltosa y transferir la mezcla a un matraz de 50 mililitros que contiene nueve mililitros de extracto de maltosa. Incubar de 12 a 16 horas a 22 a 25 grados celsius en una velocidad de rotación mínima entre 50 y 100 rpm.La aparición de muchos grumos redondos de levadura de fisión resultantes de una abundante auto floculación indica un apareamiento eficiente. A continuación, tome una muestra de un mililitro del cultivo de apareamiento y centrífuga a 1, 375 veces g durante un minuto. Retire 750 microlitros del sobrenadante y resusppend las células en el sobrenadante restante.Vórtice vigorosamente durante cinco segundos para interrumpir los grumos. Dispensar 20 microlitros de una suspensión de células mitóticas o meóticas en una almohadilla de agarosa del 2%. Retire cualquier exceso de medio invirtiendo la corredera y poniéndola en la parte superior de la toalla de papel sin pelusas durante dos o tres segundos.Voltee el portaobjetos y coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la almohadilla, asegurando que no genere burbujas de aire. Para crear una célula monocapa gire el cubreobjetos en el sentido de las agujas del reloj con el dedo índice para un giro completo para las células de mitosis o dos vueltas completas para las células de la meiosis. Asegúrese de que la materia celular se dispersa a través de la almohadilla de agarosa, lo que permite una mejor separación de células individuales o asci.Con la ayuda de un pequeño palo de madera dispensar sellador de hidrocarburos fundidos a lo largo de los bordes del cubreobjetos para sellar cada almohadilla de agarosa. Una vez sellada la almohadilla de agarosa, colóquela en la etapa del microscopio. Encienda la cámara de temperatura y establézcala a la temperatura deseada.Coloque una placa con una toalla de papel húmeda en la cámara para controlar la humedad del sistema de microscopio. Dejar que se equilibre durante 10 a 15 minutos en las condiciones de diagnóstico por imágenes adecuadas. Esto permite que las burbujas de aire restantes se disipen y se produzcan cambios de agarosa de última hora.Utilice el objetivo 40X para encontrar los campos de vista adecuados para la imagen. Cambie al objetivo 60X para comenzar la adquisición de datos. En el software que controla la función del microscopio, elija los conjuntos de filtros del microscopio que mejor se adapten a los fluoróforos bajo observación.Ajuste las longitudes de onda de excitación para que coincidan con los fluoróforos utilizados, utilice la potencia de excitación más baja que produzca una señal consistente y utilice tiempos de exposición de cuatro a ocho horas para generar datos de imagen aceptables pero cuantificables y reproducibles. Recopile al menos seis puntos de tiempo de adquisición cada hora. En el software de recopilación de imágenes, seleccione al menos un canal de fluorescencia desde el que adquirir datos y emplee un stock Z compuesto por 13 secciones con un espaciado de 0,5 micrómetros.En el software Fiji, cargue una imagen desconvolucionada seleccionando la función Importador de bioteo format en el menú de complementos. En la ventana emergente Opciones de importación, seleccione Hyperstack, Modo de color predeterminado, marque Escalado automático y pulse el botón Aceptar. Asegúrese de que la ventana mostrada tenga el número correcto de canales de fluorescencia y marcos de tiempo desplazándose hacia los lados en las barras respectivas en la parte inferior.Guardar como un archivo Tiff que no comprime los datos. A continuación, en el menú Analizar, utilice la opción Definir medidas para elegir diferentes parámetros. Por ejemplo:Area, Valor gris máximo mínimo, Densidad integrada, Valor gris medio, Mediana, Posición de pila, Perímetro y Etiqueta de visualización.Seleccione Color y haga clic en la Herramienta Canales. En la ventana emergente Canales marque el Canal de Color para el que se medirá la intensidad o el área. Seleccione Imagen, luego Escriba y haga clic en 32 bits.Elija las funciones Ajustar y Umbral en el menú Imagen. Marque la casilla Fondo oscuro, seleccione el método Predeterminado y elija Rojo para superponer las señales de interés. Utilice la herramienta de varita para resaltar cada estructura de interés y pulse la letra T en el teclado para agregar el ROI seleccionado a la ventana emergente del gestor de ROI.A continuación, abra la carpeta ROI comprimida para cargar el administrador de ROI y haga clic en cada identificador de ROI en el panel lateral izquierdo. Seleccione Medir en el menú Analizar y repita este comando en cada identificador de ROI para cuantificar los objetos de interés en todos los sectores de la pila de imágenes. Guarde los resultados como un archivo CSV para el análisis estadístico.En este estudio si las células mueren de hambre debido a la limitación de nutrientes o el crecimiento excesivo, mostrarán el exceso de vacuolas y disminución del tamaño de la célula. Las células logarítmicas muestran la replicación activa del ADN y la división celular, así como la expresión Pan-nuclear Tos4-GFP y la separación de los focos Sad1-DsRed. No aparearse, como es el caso cuando las células no están suficientemente hambrientas de nitrógeno, les impedirá entrar en la meiosis.Se muestra un par de células de fisión sometidas a cariogamia. La floculación robusta de la suspensión de la célula de acoplamiento aumenta la interacción de célula a célula y, por lo tanto, indica un apareamiento exitoso y una inducción meótica eficiente. Los asci zygotic toman múltiples formas, incluyendo las formas de celda en zig-zag y banana.En la mitosis a medida que las células pasan de la metafase a la telófase, el primer cambio implica una contracción del tamaño nuclear en la metafase, mientras que el segundo muestra la división del núcleo durante la anafase. Además de compartir algunas dinámicas de segregación con células mitóticas, las células meóticas exhiben oscilación nuclear durante la recombinación homóloga y una mayor reducción de nucleósidos al final de la II.It de análisis antófasis es responsabilidad de los investigadores garantizar que los parámetros del experimento se puedan reproducir en todos los experimentos, y que los datos recopilados sean aptos para el análisis posterior. Las imágenes de células vivas han permitido a los investigadores examinar en detalle la mecánica de la división nuclear en mitosis y meiosis.A medida que las etiquetas fluorescentes y las capacidades del microscopio mejoren el número y el tipo de procesos que podemos observar aumentarán.

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Investigación

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Biología

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Aprende a estudiar la dinámica nuclear en levadura de fisión durante mitosis y meiosis mediante microscopía de células vivas con Schizosaccharomyces pombe. Este método permite observar procesos celulares en tiempo real sin fijadores tóxicos.

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