Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Ofrecemos producir células sanguíneas a partir de células madre pluripotentes humanas. La principal ventaja de esta técnica es que obtenemos rendimientos consistentes y precisos de células endoteliales hemogénicas. Esperamos que nuestra plataforma permita amplias aplicaciones en el monitoreo y cribado de enfermedades para compuestos terapéuticos.

Esta técnica es particularmente beneficiosa para la investigación en hematología e inmunología. El método se puede aplicar a la intervención genética o a la edición genética de células sanguíneas humanas. Permite una fácil inducción de vectores en células endoteliales hemogénicas.

El punto más crucial es el recubrimiento LM511-E8 para escribir colonias PSC. No recomendamos omitir el recubrimiento ni sustituirlo por otra matriz. Las demostraciones visuales son importantes porque queremos mostrar cómo enjuagar las células con un tampón de disociación y cómo recubrir las placas con LM511-E8.

Cultivar células madre o hPSC pluripotentes humanas a entre 70 y 80% de confluencia en una placa de seis pocillos recubierta con LM511-E8 en medio mTeSR1. Cuatro días antes de la inducción hemogénica, aspirar el medio y lavar dos veces con PBS. Enjuague las células con solución de disociación e incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Resuspender las células en el medio de mantenimiento PSC y transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar las células a 200 veces G durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en el medio de recubrimiento PSC.

Plato de la suspensión PSC de acuerdo con las instrucciones del manuscrito en un recipiente de plástico microfabricado, e incubar durante la noche. Tres días antes de la inducción hemogénica, pipetee suavemente los esferoides PSC en un tubo cónico de 15 mililitros y déjelos durante dos minutos a temperatura ambiente para precipitarlos por gravedad. Aspirar el sobrenadante y resuspender los esferoides en medio de recubrimiento esferoide.

Distribuir la suspensión en un plato de cultivo LM511-E8 recubierto de 10 centímetros a una densidad de cuatro esferoides por centímetro cuadrado e incubar durante tres días. Después de tres días, aspirar el medio, añadir día cero medio de diferenciación, y cultivar las células durante dos días en una incubadora hipóxica. Luego, aspira el medio día cero, agrega el segundo día medio de diferenciación, y la cultura por otros dos días.

Dos días después, aspirar el medio y lavar las células dos veces con PBS. Enjuague las células con solución de disociación e incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, disociar las células resuspendándolas suavemente en un EDTA mililar.

Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifuga las células a 200 veces G durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 300 microlitros de búfer de separación magnética. Agregue 100 microlitros de microperlas CD34 positivos a las células y mezcle suavemente por pipeteo.

Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego usar un colador celular de 40 micrómetros para tensar la suspensión y separar las células CD34 positivas usando un separador magnético. Dispensar 0,5 mililitros de 5 microgramos por mililitro de solución de recubrimiento de fibronectina en cada pozo de una placa de cultivo de 24 pozos, e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, centrifugar las células CD34 positivas ordenadas a 200 veces G durante tres minutos, y resuspender el pellet en un mililitro de medio EHT.

Determine la densidad de celdas viable con un contador de celdas y ajuste la densidad de celdas a 200.000 celdas por mililitro agregando un medio EHT. Aspirar y desechar la solución de recubrimiento de los pozos recubiertos con fibronectina, y dispensar 0,5 mililitros de suspensión de células CD34 positivas en cada pozo. Incubar las células de la incubadora hipoxica durante una semana.

Para recoger las células flotantes, transfiera el medio de cultivo a un tubo cónico de 15 mililitros, y centrifugar a 200 veces G durante tres minutos. Entonces aspira el sobrenadante. Para recoger las células adherentes, lávelas dos veces con 0,5 mililitros de PBS y enjuáguelas con tampón disociante.

Aspirar el líquido sobrante e incubar la placa a 37 grados Centígrados durante cinco minutos. Resuspender las células en un mililitro de búfer Facs, y mezclar las células flotantes y adherentes. Centrifugar las células mixtas a 200 veces G durante tres minutos, luego aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 50 microlitros de búfer Facs.

Diluir anticuerpos anti-CD34 y anti-CD45 en 50 microlitros de tampón Facs;añadirlos a las células e incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, lave las células dos veces con PBS, centrifugando a 200 veces G durante tres minutos después de cada lavado. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 0,5 mililitros de tampón Facs con 0,5 microgramos por mililitro dappy.

Mida la expresión CD34 y CD45 por citometría de flujo. Para recoger las células hematopoyéticas, transfiera el medio de cultivo a un tubo cónico de 15 mililitros. Recoger las células restantes enjuagando suavemente el pozo dos veces con PBS.

Centrifugar las células a 200 veces G durante tres minutos y luego aspirar el sobrenadante y resuspend en un mililitro de medio EHT. Después de contar las células, agregue 10.000 células a tres mililitros de medios espaciados con metilcelulosa, complementados con antibióticos, y use una jeringa de calibre 16 para mezclar cinco veces. Dispensar toda la suspensión de medios en cada pozo de una placa de seis pozos.

Para mantener las células húmedas, agregue agua o PBS a los pozos vacíos en el plato. Incubar las células durante dos semanas, asegurándose de no molestar el plato ya que las colonias son sensibles al movimiento. Después de dos semanas, contar las colonias bajo un microscopio.

Las células cambian morfológicamente de células endoteliales a hematopoyéticas tras la estimulación con el cóctel hematopoyético. Las colonias de células hematopoyéticas emergen en el cultivo. Las células progenitoras hematopoyéticas expresan CD34 y CD45, por lo que la citometría de flujo se utiliza para confirmar la presencia de colonias celulares hematopoyéticas mediante el análisis de la expresión de CD34 y CD45.

Un ensayo de una unidad formadora de colonias demostró la generación de granulocitos o colonias de macrófagos a partir de células progenitoras hematopoyéticas CD34 positivas y CD45-positivas. Se estimó que el número de colonias era de 38 unidades formadoras de colonias por cada 10.000 células. Los pasos más cruciales son contar los esferoides PSC.

Encontramos que la métrica de superficie es el factor más determinista en la eficiencia de este protocolo. Este procedimiento puede ir seguido de la producción lista para usar de células inergicales, como células y macrófagos de origen natural. Esta plataforma permite a los investigadores explorar factores deterministas clave en el desarrollo hematopoyético humano.