Name: Cuantificación de la aterosclerosis en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende a cuantificar lesiones ateroscleróticas en ratones mediante tinción con Sudan IV y análisis en face de la raíz aórtica, arco aórtico y arteria braquiocefálica. Este protocolo estandarizado mejora la reproducibilidad en investigación cardiovascular.

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Agradecemos a todos los miembros anteriores de la unidad de investigación cardiovascular experimental de Géran K Hansson que ayudó a desarrollar este protocolo en el último cuarto de siglo. Agradecemos especialmente las contribuciones de Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson e Inger Bodin. Este trabajo fue apoyado por la concesión del proyecto 06816 y linneo apoyaron 349-2007-8703 del Consejo Sueco de Investigación, y por subvenciones de la Fundación Sueca Heart-Lung, el Consejo del Condado de Estocolmo, la Fundación Profesora Nanna Svartz, Loo y Hans Osterman Fundación para la Investigación Médica, Fundación de Investigación de Karolinska Institutet y Fundación para Enfermedades Geriátricas en Karolinska Institutet.

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li>
<li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li>
<li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+atherosclerosis%2C+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li>
<li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li>
<li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li>
<li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome%2C+is+modifiable%2C+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li>
<li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li>
<li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein%2C+producing+massive+cholesterol+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li>
<li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains%3A+contributions+of+Clarence+Cook+Little%5BTitle%5D)+AND+%22Origins+of+Inbred+Mice%2C+Morse%2C+HC%2C+eds.+%28Academic+Press%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li>
<li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li>
<li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li>
<li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li>
<li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li>
<li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li>
<li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet%3A+no+accentuation+by+apolipoprotein%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li>
<li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li>
<li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li>
<li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li>
<li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+on+Design%2C+Execution%2C+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li>
<li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li>
<li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li>
<li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li>
<li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li>
<li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li>
<li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient%3A+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies%3A+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li>
<li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de mortalidad en el mundo y se necesitan nuevas mediciones preventivas2. Los modelos de ratón de la enfermedad proporcionan una plataforma integral para la investigación de la fisiopatología y los tratamientos experimentales13. La cuantificación fiable del tamaño de la lesión es esencial para este enfoque. Sin embargo, los métodos de cuantificación difieren entre laboratorios. La estandarización y optimización han sido un proceso continuo desde losaños 13,27,33,34. Raíces aórticas han surgido como el sitio más popular para cuantificar la aterosclerosis experimental. Las secciones transversales de las placas permiten comparar el volumen de placa entre grupos. Los preparados faciales en son favorecidos para la cuantificación de lesiones en segmentos más grandes de la aorta. El método en face visualiza la cantidad de placa y permite cuantificar la cobertura del área de placa, pero no tiene en cuenta el grosor de la placa. La relevancia biológica para las diferencias observadas está corroborada por resultados coherentes en diferentes lugares del árbol vascular. La evaluación del desarrollo de aterosclerosis en diferentes ubicaciones aborda los posibles efectos específicos del sitio. El efecto de las células hematopoyéticas trasplantadas en el desarrollo de la aterosclerosis se puede evaluar en quimeras hipercolesterolémicas de Ldlr-/- . Sin embargo, la irradiación de todo el cuerpo afecta el proceso de aterosclerosis con efectos específicos del sitio. Las lesiones ateroscleróticas más prominentes se desarrollan en la raíz aórtica, mientras que el desarrollo reducido de lesiones se observa en arcos aórticos35.
Es importante destacar que no sólo el tamaño de la lesión debe abordarse en estudios de aterosclerosis experimental. La composición de la lesión también es un parámetro clave. Varias características de la placa se han asociado con manifestaciones de la enfermedad en los seres humanos36. El seccionamiento en serie de la raíz aórtica deja varias secciones disponibles para un análisis cuidadoso de la composición de la placa. La ruptura de la placa en los seres humanos se caracteriza por una fina tapa fibrosa con pocas células musculares lisas, contenido de colágeno disperso y signos de inflamación en las placas36. Aunque la ruptura de la placa es un evento raro en los modelos de ratón de aterosclerosis, los marcadores para la estabilidad de la placa son informativos de evaluar. Los enfoques traslacionales podrían confirmar los hallazgos mecanicistas de los modelos de ratón y descubrir características importantes de la enfermedad humana31. El estado inflamatorio de las placas ateroscleróticas podría determinarse mediante la tinción inmunohistoquímica de VCAM-1, MHC clase II, macrófagos y linfocitos30. Algunos protocolos utilizan secciones longitudinales en el plano coronal del arco aórtico o la arteria braquiocéfala para medir el tamaño de la lesión aterosclerótica y la composición37. Sin embargo, este método alternativo deja sólo algunas secciones a analizar, lo que limita sus aplicaciones.
Un paso crítico inicial en este protocolo es la capacidad de cosechar aortas de manera eficiente. La coordinación mano-ojo bajo el microscopio requiere práctica y es crucial tanto para la microdisección como para la posterior fijación del arco aórtico. El siguiente paso crítico en este protocolo es la colección de secciones seriales de la raíz aórtica. Ochenta secciones consecutivas deben ser recogidas para cada ratón, lo que requiere tanto enfoque como paciencia. La competencia metodológica podría acelerar considerablemente los procesos descritos. Sin embargo, la cuantificación de lesiones ateroscleróticas sigue siendo una tarea que requiere mucho tiempo. La nueva tecnología, el manejo automatizado y las imágenes de animales pequeños podrían facilitar la cuantificación de la aterosclerosis experimental en el futuro. La progresión de la aterosclerosis es lenta y la mayoría de los protocolos experimentales en los modelos de ratón tardan más de cuatro meses en completar13. Por lo tanto, las aortas deben recopilarse de forma optimizada en los puntos finales de estudio. Este protocolo proporciona una guía completa para cosechar aortas de manera eficiente y el procesamiento propuesto prepara aortas para uso multiusos, incluida la cuantificación de lesiones en la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala. Esperemos que el protocolo pueda reducir la variabilidad experimental, mejorar la fiabilidad de los resultados y dar lugar a hallazgos que allanarán el camino para nuevos tratamientos contra la aterosclerosis.

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo con cardiopatía isquémica y accidente cerebrovascular que representan una de cada cuatro muertes1. La mayoría de los casos son causados por la aterosclerosis, una enfermedad caracterizada por una acumulación lenta de placas llenas de lípidos con signos de inflamación crónica en arterias grandes y medianas2. La enfermedad generalmente pasa desapercibida durante varias décadas hasta que una ruptura o erosión de la placa provoca una trombosis arterial que conduce a daño del tejido isquémico.
Una arteria normal consiste en una capa de intima con células endoteliales y células musculares lisas escasamente distribuidas, una capa mediacon células musculares lisas y lamelas elásticas, y una capa adventitativa circundante con tejido conectivo suelto 3. Una retención intimal de LDL compensa el desarrollo de aterosclerosis4. La acumulación y modificación de lipoproteínas conducen a la agregación y atrapamiento dentro de la intima arterial5. Una respuesta inflamatoria es evocada por las lipoproteínas atrapadas y modificadas6. Las células endoteliales comienzan a expresar moléculas de adhesión, como El VCAM-1 en sitios en elárbol arterial con flujo sanguíneo turbulento, lo que conduce al reclutamiento de monocitos circulantes y otros leucocitos 7. Los monocitos infiltrados se diferencian en macrófagos que envuelven lípidos con la transformación subsiguiente a las células de espuma de macrófagos8.
La aterosclerosis se ha estudiado en modelos de ratón con frecuencia creciente desde mediados de la década de 1980. C57BL/6 es la cepa de ratón endogámica más utilizada para estos estudios, y se utiliza como antecedentes genéticos para la mayoría de las cepas modificadas genéticamente9. Esta cepa fue establecida en la década de 192010,y su genoma fue publicado en 200211. Los experimentos en modelos de ratón tienen varios beneficios: las colonias se reproducen rápidamente, la vivienda es eficiente en el espacio y la endogamia reduce la variabilidad experimental. El modelo también permite manipulaciones genéticas, como deleciones genéticas dirigidas e inserción de transgenes. Esto ha llevado a una nueva comprensión fisiológica de la enfermedad y nuevas metas de terapia12.
Los ratones C57BL/6 de tipo salvaje son naturalmente resistentes a la aterosclerosis. Tienen la mayor parte del colesterol circulante en HDL, y lesiones ateroscleróticas complejas no se forman incluso cuando se alimentan de una dieta alta en grasas y colesterol13. Por lo tanto, los ratones hipercolesterolémicos, como Apoe-/- en el fondo C57BL/6, se utilizan como modelos experimentales de aterosclerosis14,15. La falta de ApoE afecta la absorción hepática de lipoproteínas remanentes y perturba gravemente el metabolismo de los lípidos. En los ratones Apoe-/-, el colesterol circulante es predominantemente en partículas vLDL, y los ratones desarrollan placas ateroscleróticas complejas en una dieta regular para la dieta.
Ldlr-/- ratones imitan el desarrollo de aterosclerosis visto en humanos con hipercolesterolemia familiar16. Los ratones Ldlr-/- necesitan una dieta de tipo occidental para desarrollar aterosclerosis17. La dieta occidental imita la ingesta de alimentos humanos y generalmente contiene 0.15% colesterol. El receptor LDL reconoce ApoB100 y ApoE y media la aceptación de partículas LDL a través de la endoocitosis. Los receptores LDL son fundamentales para el aclaramiento hepático de LDL de la circulación, mientras que la expresión del receptor LDL en las células hematopoyéticas no influye en este proceso. Esto abre la posibilidad de trasplante de médula ósea de células Ldlr+/+ en receptores hipercolesterolémicos de Ldlr-/- y evaluación del desarrollo de aterosclerosis. Las quimeras de médula ósea se han utilizado comúnmente para estudiar la participación de células hematopoyéticas en la aterosclerosis experimental. Sin embargo, el trasplante de médula ósea podría influir en el tamaño y la composición de las placas ateroscleróticas, haciendo que la interpretación de los resultados sea ambigua.
Se han desarrollado diferentes variantes de ratones Apoe-/- y Ldlr-/- con alteraciones genéticas adicionales para estudiar procesos específicos de la enfermedad18. Un ejemplo son los ratones humanos APOB100-Ldlr transgénico -/- (HuBL) que llevan el gen APOB100 humano de longitud completa19,20. Estos ratones desarrollan hipercolesterolemia y aterosclerosis en una dieta regular para hacer comidas. Sin embargo, el desarrollo de placas ateroscleróticas complejas toma al menos seis meses y protocolos experimentales más cortos suelen utilizar la dieta occidental21. Una gran fracción del colesterol plasmático está circulando en partículas LDL, lo que da a los ratones HuBL un perfil de lipoproteína disfidemiadilo más humana en comparación con apoe-/- y Ldlr-/- ratones. Los ratones HuBL también permiten estudios de apoB humano como un autoantígeno22.
Los modelos de ratón de aterosclerosis desarrollan placas ateroscleróticas complejas con características compartidas de la enfermedad humana. Sin embargo, las placas son bastante resistentes a la ruptura con el infarto de miocardio subsiguiente. La aterocrobosis sólo se detecta esporádicamente y se desafia experimentalmente para evaluar23,24,25. Se han desarrollado modelos especiales de ruptura de placas, pero el campo experimental carece de un modelo fiable y reproducible para la evaluación de los agentes estabilizadores de placas.
Cuantificación de la aterosclerosis se ha divulgado de muchas maneras en la literatura. Los esfuerzos recientes han tratado de estandarizar el diseño experimental, la ejecución y la presentación de informes de estudios en animales26. Los investigadores tienen diferentes preferencias y técnicas adaptadas a sus laboratorios. La mayoría de los proyectos de investigación también son únicos de una manera que requieren algunas modificaciones de protocolo. Debido a la naturaleza multifactorial de la enfermedad, los controles óptimos varían entre los proyectos. Las condiciones locales y la falta de estandarización pueden causar diferencias observadas en el desarrollo de la enfermedad, lo que dificulta los avances en el campo de la investigación. Las diferencias en la variabilidad experimental también significan que los cálculos estadísticos de potencia deben basarse en estudios piloto en condiciones locales.
La cuantificación de la aterosclerosis se recomienda en varios lugares del árbol vascular. Este protocolo describe cómo obtener resultados de la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala en un solo ratón, además de dejar el resto de la aorta toracoabdominal para otros análisis. Las preparaciones faciales permiten una cuantificación rápida de las placas cargados de lípidos en el arco aórtico. La carga de enfermedad en la arteria braquiocéfala también se puede cuantificar si los especímenes se muestran cuidadosamente. El corte transversal más lento de la raíz aórtica deja varias secciones disponibles para la evaluación detallada de la composición de la placa.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>VWR Chemicals</td><td>20066.296</td><td>Para la fijación de secciones para inmunohistoquímica.</td></tr><tr><td>Cinta aislante eléctrica negra (50 mm de ancho)</td><td>Cualquier minorista especializado-Para</td><td></td> <td>crear camas de alfiler para arcos aórticos.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417C</td><td>Microcentrífuga de sobremesa.</td></tr><tr><td>Tablero de corcho</td><td>Cualquier minorista especializado-Para</td><td></td> <td>cortar corazones en la preparación para criomontar raíces aórticas.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 560</td><td>Para la criosección en serie de raíces aórticas.</td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>:</td><td></td> <td>para enjuagar y preparar soluciones.</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Leica Microsystems</td><td>DC480 CCD</td><td>de 5,1 megapíxeles para imágenes de alta resolución de arcos aórticos y secciones de raíces aórticas.</td></tr><tr><td>Tijeras de disección (10 cm, rectas)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Para la disección general de órganos.</td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5 (11 cm, recta)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500341</td><td>Para la microdisección de la aorta.</td></tr><tr><td>Etanol 70% (v/v)</td><td>VWR Chemicals</td><td>83801.290</td><td>Líquidos y vapores altamente inflamables, almacenar en un lugar bien ventilado y mantener frescos.</td></tr><tr><td>Etanol absoluto &ge; 99.8%</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.310</td><td>Líquidos y vapores altamente inflamables, almacene en un lugar bien ventilado y manténgalo fresco.</td></tr><tr><td>Formaldehído 4% estabilizado, tamponado (pH 7.0)</td><td>VWR Chemicals</td><td>9713.1000</td><td>Nocivo por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td> <td>NIH-Software de análisis de</td> <td>imágenes.</td></tr><tr><td>Pinzas de iris (10 cm, curvas, dentadas)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915-G</td><td>Utilizadas como pinzas anatómicas.</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1096341011</td><td>líquido inflamable, causa irritación ocular grave y puede causar somnolencia o mareos.</td></tr><tr><td>Gelatina de glicerol de Kaiser,</td><td>Merck</td>, <td>1092420100</td><td>medio de montaje acuoso que contiene fenol. Se sospecha que causa defectos genéticos.</td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LB2</td><td>Para el análisis durante el corte y la documentación de micrografías teñidas con Oil Red O.</td></tr><tr><td>Hematoxilina de Mayer</td><td>Histolab</td><td>1820</td><td>Solución tintorante no tóxica sin hidrato de cloral, pero causa irritación ocular grave.</td></tr><tr><td>Tijeras Mayo (17 cm, rectas)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501751-G</td><td>Para disección general.</td></tr><tr><td>Portaagujas Micro Castroviejo (9 cm, recto)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503376</td><td>Para la fijación de arcos aórticos.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C</td><td>Microtubos de polipropileno con tapón snaplock.</td></tr><tr><td>Microlance 3 agujas, calibre 23</td><td>BD</td><td>300800</td><td>Para la extracción de sangre.</td></tr><tr><td>Microlance 3 agujas, calibre 27</td><td>BD</td><td>302200</td><td>Para perfusión de ratones.</td></tr><tr><td>Microvette 500 y micro; L, K3 EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>20.1341.100</td><td>Para la extracción de sangre.</td></tr><tr><td>Microvette 500 y micro; L, heparina de litio</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Para la extracción de sangre.</td></tr><tr><td>Clavijas para insectos, 0,10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Para la fijación de arcos aórticos.</td></tr><tr><td>Aceite Rojo O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td>No clasificado como sustancia o mezcla peligrosa.</td></tr><tr><td>Temperatura óptima de corte (OCT) cryomount</td><td>Histolab</td><td>45830</td><td>Para la inclusión de tejido.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td>Película de cera de parafina utilizada para crear lechos de fijación para arcos aórticos.</td></tr><tr><td>Placas de Petri (100 mm x 20 mm)</td><td>Cualquier proveedor de cultivos</td> <td>celulares-Propuesto</td> <td>como contenedor de almacenamiento para aortas fijadas.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS):</td><td></td><td></td> <td>se requiere una solución estéril y libre de RNasa para la perfusión de ratones.</td></tr><tr><td>Papel de filtro cualitativo (grado 1001)</td><td>Munktell</td><td>120006</td><td>Para filtrar la solución de trabajo Oil Red O (retención típica 2-3 y micro; m).</td></tr><tr><td>ARNposterior reactivo de estabilización de ARN</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>Para la estabilización de ARN en muestras de tejido</td></tr><tr><td>RNasaZap Solución de descontaminación de ARNasa</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Una solución de descontaminación de superficies que destruye las RNasas al contacto.</td></tr><tr><td>Mango de bisturí #3 (13 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>Para cortar corazones en la preparación para criomontar raíces aórticas.</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí estándar # 10</td><td>World Precision Instruments</td><td>500239</td><td>Para cortar corazones en la preparación para criomontar raíces aórticas.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ6</td><td>Para disección y documentación in situ</td></tr><tr><td>Sudan IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4261</td><td>No clasificado como sustancia o mezcla peligrosa.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Para recoger secciones de raíces aórticas.</td></tr><tr><td>Pinzas de tejido (15 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501741-G</td><td>Para disección general.</td></tr><tr><td>Criomoldes Tissue-Tek (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Sakura</td><td>4565</td><td>Para incrustar raíces aórticas en OCT.</td></tr><tr><td>Tijeras Vannas (8 cm, recta)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503378</td><td>Para la microdisección de la aorta.</td></tr></tbody></table>

cuantificación de la aterosclerosis en ratones

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo. La causa subyacente en la mayoría de los casos es la aterosclerosis, que es en parte una enfermedad inflamatoria crónica. Estudios experimentales de aterosclerosis han aclarado el papel del colesterol y la inflamación en el proceso de la enfermedad. Esto ha llevado a ensayos clínicos exitosos con agentes farmacéuticos que reducen las manifestaciones clínicas de la aterosclerosis. Los experimentos cuidadosos y bien controlados en modelos de ratón de la enfermedad podrían dilucidar aún más la patogénesis de la enfermedad, que no se entiende completamente. El análisis estandarizado de lesiones es importante para reducir la variabilidad experimental y aumentar la reproducibilidad. Determinar el tamaño de la lesión en la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala son puntos finales comunes en la aterosclerosis experimental. Este protocolo proporciona una descripción técnica para la evaluación de la aterosclerosis en todos estos sitios con un solo ratón. El protocolo es particularmente útil cuando el material es limitado, como es frecuentemente el caso cuando se caracterizan animales modificados genéticamente.

En los modelos de ratón de aterosclerosis las lesiones más prominentes tienden a desarrollarse en la raíz aórtica y el arco aórtico. Este protocolo describe la cuantificación de la aterosclerosis en la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala en un solo ratón. Las lesiones mentoráticas en la aorta descendente torácica y la aorta abdominal solo están presentes en animales con enfermedad avanzada. En este protocolo, estas partes no se analizan para la carga aterosclerótica, sino que se guardan para el análisis posterior de los niveles de ARNm u otros análisis. Las secciones seriales de lesiones ateroscleróticas en la raíz aórtica generalmente se muestran en un gráfico con el tamaño de la lesión en el eje yy la distancia al seno aórtico en el eje x28. Las secciones transversales verdaderas son cruciales para la cuantificación del tamaño de la lesión. Las secciones oblicuas pueden sobreestimar el tamaño de las lesiones y una inclinación de sólo 20o podría sobreestimar la superficie absoluta de la lesión en un 15%29. Sin embargo, el cálculo de la fracción de lesión del área total del vaso hace que el resultado sea menos sensible a las posibles diferencias de ángulo durante el seccionamiento (Figura4A). Un método estadístico adecuado para detectar diferencias entre grupos suele ser un análisis regular de 2 vías de la varianza (ANOVA). A continuación, se llevan a cabo las pruebas posteriores de Bonferroni para detectar diferencias a ciertos niveles. La diferencia menos significativa de Fisher también podría utilizarse como prueba de seguimiento para ANOVA. Reduce la probabilidad de errores estadísticos de tipo II, pero no tiene en cuenta las comparaciones múltiples. Además, podría ser ilustrativo calcular el área debajo de la curva o el tamaño medio de la lesión por ratón y presentar los datos en una gráfica de puntos para visualizar aún más la variación individual dentro de los grupos (Figura4B).
El aceite Rojo O es un tinte de diazo rojo brillante soluble en grasa, que tiñe los lípidos neutros. Los lípidos polares en las membranas celulares no están manchados. La tinción de aceite Rojo O se puede realizar en muestras frescas, congeladas o fijadas en formalina, pero no en muestras incrustadas en parafina debido a la eliminación de lípidos en el proceso de desfinación requerido. Una cuantificación de la acumulación de lípidos lesionales podría realizarse umbral de color en el área positiva de aceite rojo O del área total de la lesión (Figura4C). La hematoxilina produce una tinción azul de los núcleos celulares, que es útil para visualizar la morfología de la placa. Las arterias coronarias derecha e izquierda generalmente difieren de la aorta alrededor de 250 m del seno aórtico27,que a menudo coinciden con los tamaños de lesión más prominentes. Las secciones transversales de esta región se muestran a menudo como resultados representativos (Figura4D).
<img alt="Análisis de lesiones aórticas; gráfico, gráficos de barras, imágenes de histología; tamaño de la lesión, resultados de tinción de O rojo aceite." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Lesiones ateroscleróticas en la raíz aórtica. (A) Veintiocho semanas de edad, se evaluaron las quimeras de médula ósea masculina alimentadas con dieta occidental durante ocho semanas para determinar el efecto de las células T deficientes de Smad7en el desarrollo de la aterosclerosis. Las quimeras experimentales Ldlr-/- recibieron la médula ósea Cd4-Cre+Smad7fl/fl y los controles recibieron la médula ósea Cd4-Cre+Smad7fl/+. El gráfico muestra la cuantificación del área de la lesión aterosclerótica a partir de ocho secciones consecutivas, 100 - 800 m del seno aórtico que se muestra como fracción de lesión de la superficie total del vaso (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n-6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n a 9, ANOVA de 2 vías con la prueba posterior de Bonferroni, el gráfico muestra la media de LASE, los aparatos ortopédicos indican el nivel de significancia para la comparación de deformación unitaria). (B) La gráfica de puntos combinada y el gráfico de barras muestran el área media de la lesión aterosclerótica a partir de las secciones de la raíz aórtica (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n-6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n n 9, Prueba del estudiante) (C) Fracción de la zona teñida de aceite rojo o en las lesiones (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n 4, Cd4-Cre+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n 6, Prueba t-test del estudiante, ns-no significativo) (B-C) Los puntos representan ratones y barras individuales muestran la media de la SEM. (D) Micrografías representativas que muestran la tinción de aceite rojo O (en rojo color) de los lípidos neutros en la raíz aórtica 300 m a partir del seno aórtico (aumento de 50x), barra de escala a 500 m. *p a 0,05, ***p a 0,001. Esta cifra ha sido modificada de Gister y al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El aceite Rojo O podría utilizarse para la tinción de aortas preparadas en la cara, pero este protocolo utiliza Sudán IV, otro conveniente tinte de diazo soluble en grasa. Sudán IV visualiza claramente las placas ateroscleróticas en un color rojo anaranjado mediante la tinción de lípidos, triglicéridos y lipoproteínas. La eliminación del fondo oscuro en imágenes representativas de los arcos aórticos en la cara podría mejorar la visualización visual (Figura5A). Por lo general, el tamaño de la lesión se distribuye normalmente dentro de los grupos, lo que permite realizar pruebas estadísticas con la prueba tdel estudiante entre grupos. Una gráfica de puntos que muestra tanto ratones individuales como la media, que se compara entre grupos, es una forma informativa de mostrar los resultados (Figura 5B-C). Dado que la variación dentro de los grupos suele ser diferente entre ubicaciones en el árbol vascular, normalmente se necesitan cálculos de potencia separados. La variación innecesaria puede evitarse mediante la competencia del método y la estandarización del protocolo. La obtención de resultados estadísticamente significativos es importante, pero la relevancia biológica para una diferencia observada siempre debe ser considerada también.
<img alt="Análisis de lesiones del arco aórtico: imágenes arteriales, comparación de datos de lesiones en modelos HuBL y BT1xHuBL, gráficos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Lesiones ateroscleróticas en arco aórtico y arteria braquiocéfala. (A) Representante en cara a micrografías de arcos aórticos con placas cargados de lípidos manchadas con Sudán IV (en color naranja) de 20 semanas de edad ratones alimentados con dieta occidental durante diez semanas, visualizados juntos. Barra de escala de 2 mm. Se utilizaron ratones APOB100-Ldlr transgénicos -/- (HuBL) como controles y el grupo experimental consistió en ratones transgénicos TCR con células T reactivas LDL (BT1) cruzadas a ratones HuBL. (B) Lesiones ateroscleróticas en el arco aórtico (HuBL n a 10, BT1xHuBL n á 12; Prueba del estudiante). (C) Lesiones ateroscleróticas en la arteria braquiocéfala (HuBL n .8, BT1xHuBL n 9, Prueba t-test del estudiante). (B-C) Los puntos representan ratones individuales, las barras muestran la media de la seM. *p a 0,05. Esta cifra ha sido modificada de Gister y al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1: Organización alternativa de diapositivas para secciones seriales de la raíz aórtica. Una organización de diapositivas sistemática simplificada para la recopilación de secciones de la raíz aórtica. La colección permite la tinción de aceite rojo O para lípidos e inmunohistoquímica o tinción de inmunofluorescencia. Se omiten las diapositivas dedicadas para la tinción roja de colágeno de Picrosirius. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Los modelos murinos de aterosclerosis son herramientas útiles para investigar vías patógenas a nivel molecular, pero requieren una cuantificación estandarizada del desarrollo de lesiones. Este protocolo describe un método optimizado para determinar el tamaño de la lesión en los vasos arteriales principales, incluyendo la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala.

Cuantificación de la aterosclerosis en ratones

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte a nivel mundial. Los modelos de ratón son herramientas útiles para estudiar esta enfermedad y nuestro protocolo se puede utilizar para cuantificar la aterosclerosis en ratones. Con este protocolo, el tamaño de la lesión se puede medir en tres lugares vasculares.La raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala. La cuantificación de la aterosclerosis en ratones puede ser una tarea tediosa. Hemos proporcionado pasos detallados que esperamos puedan acelerar el proceso.Algunos de estos pasos son difíciles de describir por escrito. Esperamos que este video le ayude a obtener un análisis robusto del tamaño de la lesión aterosclerótica. Después de cosechar un corazón de ratón de acuerdo con los protocolos estándar, coloque el corazón en un lecho de corcho, el lado ventral hacia arriba bajo un microscopio diseccionado y use una aguja para fijar el corazón al corcho a través del ápice.Sosteniendo la base del corazón con fórceps anatómicos, utilice un bisturí mantenido en un ángulo de 20 grados caudalmente en el plano sagital, y 20 grados cránidalmente en el plano transversal, para cortar los dos tercios apicales del corazón. Incrustar la raíz aórtica y la base del corazón en el compuesto de temperatura de corte óptima, o OCT, y apretar suavemente el corazón con los fórceps para llenar la raíz aórtica con compuesto y para eliminar cualquier burbuja de aire. Transfiera la muestra al fondo de un criomold lleno de OCT con la raíz aórtica perpendicular a la superficie inferior y congele el compuesto en hielo seco.A continuación, almacene la muestra de tejido en una bolsa de congelador a menos 80 grados Centígrados hasta criocisar. Para preparar una cama de fijación para el análisis de la cara, doble un segmento de película de cera de parafina ocho veces para hacer una superficie plana de 25 por 25 mm y envolver la cinta de aislamiento eléctrico negro alrededor de la película para hacer un fondo oscuro para la aorta. Coloque una etiqueta en la parte posterior de la cama anclada y utilice un lápiz de plomo para registrar el número de identificación del ratón.Transfiera el arco aórtico a la cama de fijación y agregue una gota de PBS al tejido. Con un microscopio estéreo, limpie la aorta del tejido adiposo periadventitial restante y utilice tijeras Vannas y fórceps Dumont para despegar suavemente todo el tejido adiposo circundante sin manipular ni dañar la aorta. A continuación, introduzca las tijeras Vannas en el lumen aórtico para exponer la superficie intimal.Comience a cortar la curvatura exterior del arco ascendente en la dirección distal, continuando cortando las ramas, incluyendo la arteria braquiocéfala y ahorrando la parte dorsal de la región torácica descendente. Para mostrar la superficie intimal, abra la curvatura menor y abra la aorta. Usando un soporte de aguja micro Castroviejo, fije el arco abierto al lecho de fijación con el extremo romo de los pines de insectos minados sin estirar la muestra, doblando suavemente los alfileres lejos de la muestra mientras el tejido se mantiene en su lugar.A continuación, guarde el arco anclado boca abajo en un plato Petri de PBS a cuatro grados Centígrados. Para la tinción de Sudán IV, enjuague el espécimen durante cinco minutos en un plato de Petri de 70% etanol con el arco hacia abajo, antes de transferir el espécimen a un plato de solución de trabajo de Sudán IV durante siete minutos. Al final de la incubación, enjuague la muestra con dos lavados de tres minutos en 80%etanol para desmantellar la superficie normal de intimal, seguido de un enjuague final en PBS antes de devolver el tejido a su plato original de Petri.A continuación, adquiera micrografías bajo un microscopio estéreo conectado a una cámara digital con un aumento de 10X, obteniendo imágenes del arco anclado sumergido en PBS, utilizando pequeños pesos metálicos para sujetar la cama anclada a la parte inferior de la placa Petri. Para obtener criocciones de la raíz aórtica incrustada, establezca la temperatura del criostato en menos 20 grados Celsius y el espesor de la sección en 10 micrómetros. Monte el bloque OCT que contiene la raíz aórtica en el soporte de la muestra con el tejido ventricular orientado hacia afuera.Asegure el posicionamiento con algunos OCT adicionales si es necesario. La raíz aórtica ahora debe colocarse perpendicular a la hoja del cuchillo. Recoger las secciones de control inicial que contienen tejido muscular del corazón en diapositivas de microscopio ordinarios, comprobando la progresión a través del tejido cada 200 micrómetros bajo un microscopio de luz.Cuando aparezca la primera cúspide aórtica, incline la muestra hacia la cúspide cero del punto para alinear el plano de sección con las otras dos cúspides y contar cada sección de 10 micrómetros que se corte desde el punto cero en adelante. Comience a recoger secciones para su análisis a partir de 90 micrómetros de acuerdo con la diapositiva planificada, hasta que se hayan alcanzado 800 micrómetros desde el punto cero. El cálculo de la fracción de lesión del área total del recipiente de la raíz aórtica hace que los datos sean menos sensibles a las posibles diferencias de ángulo durante el seccionamiento.Además, podría ser ilustrativo calcular el área debajo de la curva o el tamaño de la lesión atheroto por ratón y presentar los datos en una gráfica de puntos para visualizar más las variaciones individuales dentro de los grupos. La acumulación de lípidos lesionales se puede cuantificar mediante el umbral de color rojo O áreas positivas de la zona total de la lesión. Las arterias coronarias derecha e izquierda generalmente difieren de la aorta alrededor de 250 micrómetros del seno aórtico que a menudo coincide con los tamaños de lesión más prominentes.La eliminación del fondo oscuro en imágenes representativas de los arcos aórticos en face puede mejorar la visualización visual. El tamaño de la lesión se distribuye normalmente dentro de los grupos, lo que permite el análisis estadístico utilizando la prueba t del estudiante entre grupos. Recomendamos practicar con algún material de prueba hasta que haya obtenido suficientes habilidades para procesar sus muestras experimentales.Si el tamaño de la lesión es diferente entre los grupos, debe determinar el mecanismo, ya que un análisis de la composición de la lesión suele ser el siguiente paso a seguir.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El análisis ex vivo de lesiones arteriales a partir de modelos animales de enfermedad cardiovascular se basa clásicamente en técnicas histológicas e inmunohistoquímicas. Estos proporcionan mediciones bidimensionales en lesiones tridimensionales. Este manuscrito describe la generación de lesiones arteriales para análisis cuantitativo en 3 dimensiones mediante tomografía óptica de proyección.

Generación y cuantificación de 3 dimensiones de las lesiones arteriales en ratones mediante tomografía óptica de proyección

Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.

Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino

Este video muestra a dos modelos de desarrollo de la placa de la íntima en las arterias murinos y hace hincapié en las diferencias en la hiperplasia miointimal y la aterosclerosis.

Inducir miointimal Hiperplasia Versus aterosclerosis en ratones: una introducción de dos modelos válidos

Este estudio describe un procedimiento invasivo para la inducción de la aterosclerosis acelerada en ratones. En comparación con otros métodos que utilizan lesiones inducidas por electricidad o crio, la lesión inducida por la mecánica imita la condición humana de la restenosis después de las terapias de revascularización y es ideal para el estudio de los mecanismos moleculares involucrados.

Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"

Se describe un protocolo para inducir ateroesclerosis en la raíz aórtica de ApoE- / - los ratones alimentados con una dieta aterogénico, a través de una continua liberación de aldosterona. También se describen métodos para caracterizar la composición de la placa.

Inducción de las placas ateroscleróticas a través de la activación de los receptores de mineralocorticoides en ratones deficientes en apolipoproteína E

Proponemos un protocolo estandarizado para caracterizar la composición celular de etapa tardía las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos de disección animal, tejido inclusión, seccionamiento, tinción y análisis de las arterias braquiocefálicas de atheroprone músculo liso células linaje seguimiento ratones.

Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para analizar la carga aterosclerótica en ratones. Los investigadores pueden usar este protocolo para comparar la abundancia, la ubicación y el tamaño de las lesiones ateroscleróticas en diferentes animales.

Imágenes y análisis de lesiones de aorta entera teñidas de O de color rojo aceite en un modelo de ratón con hiperlipidemia por aneurisma

Aquí, presentamos protocolos optimizados de limpieza de tejidos para obtener imágenes de la aorta murina en tres dimensiones (3D). Delineamos procedimientos de última generación para la inmunotinción, el aclaramiento óptico y la obtención de imágenes con la intención de definir la proximidad anatómica del sistema nervioso periférico con las placas ateroscleróticas y la adventicia en la aterosclerosis.

Imágenes tridimensionales de los tejidos aórticos en la aterosclerosis

Este protocolo proporciona una metodología integral para el análisis cuantitativo de las placas ateroscleróticas para facilitar una investigación más profunda sobre los mecanismos y la progresión de la aterosclerosis.

Aislamiento y análisis de lesiones del arco aórtico y la raíz en un modelo de ratón aterosclerótico

γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma...

La medición de γHV68 infección en los ratones

Aprende a cuantificar lesiones ateroscleróticas en ratones mediante tinción con Sudan IV y análisis en face de la raíz aórtica, arco aórtico y arteria braquiocefálica. Este protocolo estandarizado mejora la reproducibilidad en investigación cardiovascular.

Cuantificación de la aterosclerosis en ratones

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