Name: Tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con DMSO para promover la diferenciación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprende a tratar células madre pluripotentes humanas con DMSO al 1-2% durante 24 horas para potenciar su diferenciación multilineaje. Este método mejora la eficiencia en terapia celular y modelado de enfermedades.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford y una beca Siebel otorgada a S. C.

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Los autores no tienen nada que revelar.

En resumen, este protocolo describe una herramienta simple y barata para mejorar la capacidad de diferenciación de las células madre pluripotentes (PSC) a todas las capas de gérmenes primarios, varios tipos de células progenitoras especializadas, e incluso tipos de células funcionales y maduras en y ajustes in vivo. Se ilustran protocolos de diferenciación específicos que se han reproducido eficazmente en nuestro laboratorio y en otros, pero cualquier protocolo de diferenciación de elección se puede utilizar después del tratamiento DMSO. Como se muestra en la Tabla 1, varios laboratorios también han demostrado una mejora de la diferenciación de PSC después del tratamiento de DMSO transitorio utilizando diferentes paradigmas para generar varios otros tipos de células terminales. Además, aunque los métodos aquí describen el uso de PSC humanas, el pretratamiento DMSO se puede utilizar en todas las especies y se ha demostrado que es eficaz en las PSC de ratón, conejo y primate.
Aunque se sabe que dosis más altas de DMSO son citotóxicas, las dosis bajas utilizadas en este método (1%-2%) durante un período transitorio resulta en una mínima muerte celular. Mientras que el número total de células inmediatamente después del tratamiento CONDMSO puede disminuir debido a la promoción de DMSO de la detención del ciclo celular en la fase G1 del ciclo celular, estudios previos muestran que las células son capaces de alcanzar el mismo nivel de confluencia que los cultivos de control después de la eliminación de DMSO3.
El porcentaje y la duración del pretratamiento DMSO deben optimizarse por línea celular. El tiempo de tratamiento debe ajustarse teniendo en cuenta el tiempo de ciclo/duplicación de las células. Por ejemplo, los PSC de ratón suelen tener tiempos de ciclismo mucho más cortos de aproximadamente 15 h; por lo tanto, el tratamiento DMSO para 15 h para estas células es suficiente. Algunos laboratorios también han encontrado que el tratamiento DMSO es beneficioso cuando se continúa durante el protocolo de diferenciación o a concentraciones más bajas (ver Tabla 1). Cabe señalar que algunas líneas de la PSC son más modificables para la diferenciación a linajes específicos. Por ejemplo, se ha demostrado que las células HUES6 son menos permisivas a la diferenciación y, por lo tanto, tuvieron una mejora marcada con el tratamiento dmSO (figura2). Alternativamente, las células HUES8 utilizadas en la Figura 4 y la Figura 5 han demostrado tener una mayor propensión hacia la diferenciación endodérmica; por lo tanto, se mostraron menos diferencias entre el control y la DMSO para la diferenciación en las etapas iniciales hacia el endodermo definitivo. No obstante, la mejora del pretratamiento DMSO se observa en etapas posteriores de diferenciación en esta línea celular (Figura4B). El tratamiento DMSO también es versátil en el sentido de que es eficaz en sistemas de cultivos celulares 2D y 3D, se puede utilizar con varios tipos de material de recubrimiento en placas de cultivo celular, y funciona en diferentes tipos de medios de mantenimiento que promueven el crecimiento y la expansión de (por ejemplo, mTeSR, E8, medios condicionados MEF, etc.).
En términos más generales, estos resultados sugieren que el estado inicial de las células madre pluripotentes tiene una fuerte influencia en la propensión a la diferenciación inicial, así como la diferenciación terminal en tipos de células funcionales. Hemos demostrado previamente que el tratamiento DMSO funciona a través de Rb en hPSCs3,5. Rb desempeña un papel importante en la promoción de la diferenciación terminal, la supervivencia celular y la estabilidad genética de las células41,42,43,44, y por lo tanto puede explicar los efectos persistentes sobre las células diferenciados de los hPSC tratados por DMSO. Dirigirse a estos primeros modos de regulación puede colocar los hPSC en una mejor trayectoria para la diferenciación y, en última instancia, mejorar su utilidad para la medicina regenerativa.

El uso de células madre pluripotentes ha dado lugar a numerosos avances en la investigación biomédica, incluidos los campos de la medicina regenerativa y las terapias basadas en células madre, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos. También ha llevado a la perspectiva general de una investigación más traducible y de medicina personalizada. El advenimiento de la tecnología inducida de células madre pluripotentes (iPSC) hace más de 20 años ha permitido a los investigadores desarrollar células madre pluripotentes a partir de tejidos somáticos y diferenciarlas en tipos de células funcionales para estudiar una variedad de patologías, cardiovasculares, neurológicas e inmunológicas. Aunque se han logrado avances significativos en la tecnología de diferenciación de células madre, todavía persisten los desafíos en la diferenciación efectiva de células madre embrionarias humanas (HESC) y los ISPs, lo que limita el uso generalizado de la tecnología de células madre en diferentes programas de investigación. La variabilidad inherente a través de diferentes líneas celulares y clones sigue planteando obstáculos para diferenciar las líneas de células madre a los linages deseados1. Además, la derivación de células funcionales maduras y diferenciadas terminalmente de los hPSC sigue siendo un proceso tedioso e ineficiente a través de muchos linajes. De hecho, las células diferenciadas de los hPSCa menudo no logran diferenciarse terminalmente en celdas funcionales 2. En el movimiento de terapias basadas en células madre para su uso en pacientes, existe la necesidad de mejorar y asegurar la eficacia de las células que se generan a partir de hPSCs.
Nuestro laboratorio ha establecido una herramienta rápida y económica para mejorar significativamente la eficiencia de diferenciar tanto los iPSC como los ESC en tipos de células maduras. Encontramos que el pretratamiento de hiPSC s y hESCs con el sulfóxido de dimetil reactivo comúnmente utilizado (DMSO) durante 24 h a 48 h antes de la diferenciación dirigida resulta en una mejora marcada en la capacidad de diferenciación de células madre. El tratamiento con DMSO aumenta la proporción de hiPSC y hESC en la fase G1 temprana del ciclo celular y activa la proteína retinoblastoma (Rb)3, un regulador crítico de la proliferación celular, supervivencia y diferenciación4. En trabajos más recientes, se ha encontrado que Rb y sus familiares son necesarios para los efectos pro-diferenciación de DMSO, de modo que la inactivación transitoria de Rb suprime los efectos de DMSO, mientras que la activación constitutiva de Rb de una manera transitoria mejora Efectos de DMSO5. Análogo al ciclo celular durante el desarrollo embrionario, el ciclo celular de esCs e iPSCs se caracteriza por una fase Abreviada G1 que promueve la auto-renovación6,7,8. Esta fase abreviada g1 permite una proliferación más irresa, pero limita el potencial de diferenciación4,9. Al promover el detención del crecimiento en G1 y activar los controles de punto de control en el ciclo celular de los HESC y los iPSC, el tratamiento DMSO prepara células para los cambios en el destino celular tras la diferenciación dirigida.
Hasta la fecha, se ha demostrado que el pretratamiento DMSO mejora la capacidad de diferenciación de lastres capas de gérmenes en más de 30 líneas de células HUMANAs de ESC e iPSC específicas para el control y la enfermedad 3,5, así como la diferenciación de células madre y otras líneas celulares a una variedad de otros tipos de células maduras en estudios posteriores10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (Cuadro 1). Además, se ha demostrado que el tratamiento con DMSO es eficaz para mejorar la diferenciación de las células primarias no humanas21,23 (por ejemplo, ratón, primate, conejo), lo que sugiere mecanismos compartidos entre especies. Por último, el pretratamiento DMSO también se ha extendido a la tecnología de edición de genes, con un estudio en particular que muestra que el pretratamiento de 24 horas DMSO de hESCs/iPSCs aumentó significativamente la capacidad de repeticiones palindrómicas cortas interespaciales agrupadas (CRISPR) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-mediado eficiencia de edición del ADN no codificante sin incorporar mutaciones no intencionadas29. Aquí se proporciona una metodología detallada del pretratamiento DMSO de hESC s y iPSCs para aplicaciones en biología de células madre y diferenciación dirigida.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos Clear Flat Bottom</td> TC tratado con múltiples <td>pocillos Placa</td><td></td> de agitación de 353046 <td></td></tr><tr><td>de 9 posiciones&nbsp;</td><td>Chemglass</td><td>CLS-4100</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Activin A R</td><td>& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Avanzado</td><td>Gibco</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>Alk5i II</td><td>Axxora</td><td>ALX-270-445</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico totalmente trans;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>anti-Brachyury</td><td>R& D Systems</td><td>AF2085</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-péptido C</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>GN-ID4</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-FoxA2</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-Nkx2.2</td><td>Universidad de Iowa, Banco de hibridomas del desarrollo</td><td>74.5A5</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-Nkx6.1</td><td>Universidad de Iowa, Banco de Hibridomas del Desarrollo; &nbsp;</td><td>F55A12-sobrenadante</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-Olig2</td><td>EMD Millipore</td><td>MABN50</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números</td></tr><tr><td>de lote anti-Pax-6</td><td>Biolegend</td><td>901301</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números</td></tr><tr><td>de lote anti-Pdx1</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>No se observó variabilidad entre diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-SOX1&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>AF3369</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números de lote</td></tr><tr><td>anti-SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>No se observó variabilidad en diferentes números de lote</td></tr><tr><td>Suplemento B-27, menos vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Factor básico de crecimiento de fibroblastos</td><td>Gibco</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>Betacelulina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>50932345</tr><tr><td>Chir99021</td><td>Vástago</td><td>04-000-10</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066</td><td>Corning</td><td>99-603-CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de celdas automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAF1000</tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7528&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Matraces giratorios desechables</td><td>Corning, VWR</td><td>89089-814</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medios</td><td>Gibco</td><td>A1516501</td><td></td></tr><tr><td>FAF-BSA</td><td>Proliant&nbsp;</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ultrasensible humana ELISA</td><td>ALPCO Diagnostics</td><td>80-INSHUU-E01.1</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>51500056</tr><tr><td>KGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-19</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum de repuesto</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-3,3&prime;,5-Triyodotironina (T3)</td><td>EMD Millipore</td><td>642245</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131&nbsp;</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>15-100-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco 11140050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S3817&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Noggin Fc Chimera Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>3344-NG-050</td><td></td></tr><tr><td>PdBU</td><td>EMD Millipore</td><td>524390</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>Tecnología de medios&nbsp;</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sant1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4572</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agonista Alisado, SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de fijación ultra baja</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748</td><td></td></tr><tr><td>XXI</td><td>EMD Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con dmso para promover la diferenciación

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

A pesar del creciente uso de células madre pluripotentes (PSC), siguen existiendo desafíos para diferenciar eficientemente las células madre embrionarias e inducidas pluripotentes (ESC e iPSC) a través de varios linajes. Se han desarrollado numerosos protocolos de diferenciación, pero la variabilidad entre las líneas celulares y las bajas tasas de diferenciación transmiten desafíos en la implementación exitosa de estos protocolos. Aquí se describe un medio fácil y económico para mejorar la capacidad de diferenciación de los PSC. Se ha demostrado previamente que el tratamiento de células madre con una baja concentración de dimetilsulfóxido (DMSO) aumenta significativamente la propensión de una variedad de PSC a diferenciarse a diferentes tipos de células después de la diferenciación dirigida. Esta técnica ahora ha demostrado ser eficaz en diferentes especies (por ejemplo, ratón, primate y humano) en múltiples linajes, que van desde neuronas y esferoides corticales hasta células musculares lisas y hepatocitos. El pretratamiento DMSO mejora la diferenciación de la PSC mediante la regulación del ciclo celular y el cebado de las células madre para ser más sensible a las señales de diferenciación. Aquí se proporciona la metodología detallada para utilizar esta sencilla herramienta como un medio reproducible y ampliamente aplicable para diferenciar de manera más eficiente los PSC con cualquier linaje de elección.

La generación de tipos de células diferenciadas a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) tiene una gran promesa terapéutica, pero sigue siendo un desafío. Los PSC a menudo exhiben una incapacidad inherente para diferenciar incluso cuando se estimulan con un conjunto adecuado de señales. Aquí se describe una herramienta sencilla para mejorar la diferenciación multilínea en una variedad de líneas PSC.

Tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con DMSO para promover la diferenciación

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Es un tratamiento simple que se puede aplicar a cualquier línea de células madre o protocolo de diferenciación a las células principales para la diferenciación. Todo lo que uno tiene que hacer es agregar DMSO en 1-2% en el medio de mantenimiento de cultivo celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite aumentar significativamente el potencial de diferenciación de las células madre pluripotentes en cualquier linaje de elección mediante el cebado de células para la diferenciación.El tratamiento con DMSO aumenta la posibilidad de que las células se diferencien de los iPSC derivados del paciente, lo que les permite ser utilizadas para la terapia de reemplazo celular, el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Puede dar lugar a la aparición temprana de la regulación que controla la sub-proliferación, diferenciación y especificación durante el desarrollo embrionario. Hemos demostrado que el tratamiento con DMSO mejora la diferenciación en casi 50 líneas de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas por humanos.Mientras que otros laboratorios han demostrado que es beneficioso para las células madre de otras especies, como el ratón y el primate. Un día antes del inicio de la diferenciación, agregue DMSO a una concentración de 1 o 2% durante 24 horas en su medio de mantenimiento típico. 24 horas después del tratamiento con DMSO, sustituya el medio y proceda con su protocolo de diferenciación habitual.Cultivar células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cuando las células alcancen una confluencia adecuada, disociarlas y preparar una suspensión de una sola célula. Cuente las células vivas con un hemocitoómetro o un contador de celdas automático, utilizando un marcador de viabilidad como el azul tripano.Con el fin de lograr una confluencia del 80-90% dentro del pretratamiento DMSO de 24 horas, vajilla las células en una placa recubierta de seis pozos a una densidad de 500.000 a 1 millón de células por pozo. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. A continuación, aspire el medio y sustitúyalo por una solución de 1-2%DMSO.Deje que las células se incuban durante 24-28 horas antes de la diferenciación. Si incuba durante 48 horas, sustituya el medio después de 24 horas con una solución DMSO fresca. Para lograr la diferenciación del cultivo 3D, crezca y recoja las células en una suspensión celular.Cuente las células vivas y platéjelas en una placa de seis pozos sin recubrimiento y de baja fijación en medios de células madre con inhibidor DE ROCK. Típicamente, las esferas de células madre pluripotentes humanas 3D se formarán dentro de las 24 horas. Permita que las células se incuban durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono.Preparar 1-2%DMSO en medios de células madre precaleados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Para reemplazar el medio después de la incubación, incline la placa a un ángulo de 30 grados a 45 grados y permita que las esferas celulares se asienten en la parte inferior del pozo. Aspirar los medios de las células y volver a suspenderlos suavemente en la solución DMSO.Permita que las células se incuban durante 24-48 horas a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono. Pre-tratar las células con DMSO como se describe para cultivos 2D, y preparar soluciones de stock noggin y SB431542. Prepare suficiente reemplazo de suero 10%knockout, o KOSR, en un DMEM noqueador durante tres a cuatro días de cambio de medios.Preparar medios de diferenciación ectodérmica añadiendo noggin y SB431542 a KOSR knockout DMEM precalegado como se describe en el manuscrito. Después del pretratamiento de DMSO, aspirar medios de las células y añadir dos mililitros de medios de diferenciación a cada pozo. Permita que las células se incuban durante tres a cuatro días a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono, reemplazando los medios diariamente con factores de diferenciación frescos.El pretratamiento de DMSO da como resultado una disminución transitoria y dependiente de la dosis en la tasa de crecimiento celular en comparación con las células no tratadas. Esta disminución de la proliferación se asocia con un aumento en el contacto de célula a célula, que es especialmente pronunciado en las células tratadas con 2%DMSO. Cuando las células se fijan y se tiñen para los marcadores prototípicos de cada capa germinal, se puede observar que el pretratamiento de 2%DMSO da como resultado una mayor proporción de células de capa germinal diferenciadas.Por ejemplo, SOX17 se tiñe para visualizar las células de endodermo. Con el fin de investigar el efecto de DMSO en la diferenciación a los tipos de células progenitoras del sistema nervioso central, las células madre pluripotentes inducidas por el hombre podrían diferenciarse en células progenitoras neuronales o células progenitoras de oligodendrocitos. En comparación con las células de control, el pretratamiento de 2%DMSO aumenta la expresión del marcador de células progenitoras neuronales Pax6.Del mismo modo, el pretratamiento aumenta la proporción de células que expresan el marcador de células progenitores de oligodendrocitos Olig2. Además, el tratamiento inicial de DMSO mejora la función celular derivada de células madre embrionarias humanas después del trasplante in vivo. Cuando las células progenitoras pancreáticas diferenciadas se trasplantan en ratones inmunodeficientes, su funcionalidad se puede probar en respuesta a un desafío de glucosa o estimulación de KCl.Las mejoras en la funcionalidad celular son evidentes de dos semanas a 16 semanas después del trasplante. La consideración más importante a tener en cuenta es el ciclo o el tiempo de duplicación de las células madre. La duración del tratamiento con DMSO debe ser la misma que la del tiempo de ciclo de las células.Después del tratamiento inicial de DMSO, se puede entender cómo la proliferación celular y el ciclo celular se regulan en las células madre, como el tratamiento ayuda a promover la detención del crecimiento en la fase G1 del ciclo celular. Las células diferenciadas se pueden utilizar para comprender los mecanismos relacionados con la enfermedad, para el co-cultivo con otros tipos de células, en ensayos de tumorigenicidad, y en ensayos funcionales o estudios de trasplante para determinar si las células diferenciadas pueden rescatar un fenotipo de la enfermedad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el método para mejorar la diferenciación de células madre con el tratamiento transitorio con DMSO, que detiene las células en la fase G1. Después del tratamiento, se añade un medio de diferenciación ectodérmico con inhibidores de BMP y TGF-β para promover la formación de precursores neurales.

Mejora de la diferenciación de células madre con un tratamiento transitorio de DMSO

El video muestra una técnica para diferenciar células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) en células progenitoras neurales (NPCs). Inicialmente, las hiPSC se cultivan en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Posteriormente, las células se separan y se transfieren a una placa recubierta de biopolímero para permitir que los MEF se adhieran y se separen de las hiPSC. A continuación, las hiPSC suspendidas se transfieren a una placa inferior en V y se...

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en células progenitoras neurales

Nosotros, basándonos en el conocimiento de la biología del desarrollo y la investigación publicada, desarrollamos un protocolo optimizado para generar de manera eficiente neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo A9 a partir de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas humanas, que serían útiles para el modelado de enfermedades y la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson.

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Este trabajo describe un protocolo de diferenciación in vitro para producir, melanocitos maduros pigmentadas a partir de células madre pluripotentes humanas a través de una cresta neural y melanoblasto etapa intermedia usando un protocolo sin alimentador de 25 días.

Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.

Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

El protocolo que presentamos describe una plataforma para la identificación de pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática. Se presenta una descripción paso a paso detallando cómo iPSCs se diferencian en células con características de hepatocitos en placas de 96 pocillos y utilizar las células para detectar pequeñas moléculas con potencial actividad terapéutica.

Usando humanos inducida por células de hepatocito-como derivado de células madre pluripotentes de descubrimiento de fármacos

Presentamos un protocolo de reversión química rápida, eficiente y a granel de las células madre pluripotentes humanas linaje preparado convencional (hPSC) en un estado de preimplantación epiblasto como pluripotentes ingenua de epigenomically estable. Este método resulta en expresión génica disminución linaje preparado y notable mejora en la diferenciación del multilineage dirigida a través de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC.

Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación

Este protocolo detalla un método monocapa y libre de suero para generar eficientemente células similares a hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en 18 días. Esto implica seis pasos a medida que los hPSCs se diferencian secuencialmente en tipos celulares intermedios como la raya primitiva, el endodermo definitivo, los progenitores posteriores del antebrazo y del brote hepático antes de formar células similares a los hepatocitos.

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema automatizado de cultivo celular. Este sistema de cultivo automatizado reduce la mano de obra y beneficia a los usuarios, incluidos los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células madre pluripotentes inducidas (iPS), desde el mantenimiento de las células iPS hasta la diferenciación en varios tipos de células.

Un sistema de cultivo automatizado para mantener y diferenciar células madre pluripotentes inducidas por humanos

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Aprende a tratar células madre pluripotentes humanas con DMSO al 1-2% durante 24 horas para potenciar su diferenciación multilineaje. Este método mejora la eficiencia en terapia celular y modelado de enfermedades.

Tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con DMSO para promover la diferenciación

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