Name: Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a diferenciar células CD34+ de sangre de cordón umbilical humano hacia las cuatro líneas mieloides usando citocinas. Este método permite estudiar la hematopoyesis y enfermedades mieloides.

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Los autores quieren agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero y Gabriella Ruiz de Maricopa Integrated Health Systems por las unidades de sangre de cordón de sin identificación y donado, Mrinalini Kala por la asistencia con la citometría de flujo, y Gay Crooks y Christopher Seet por consejos sobre la diferenciación mieloide ex vivo. Este trabajo fue apoyado por fondos a S.S. de los Institutos Nacionales de Salud (R21CA170786 y R01GM127464) y la Sociedad Americana contra el Cáncer (la Beca de Investigación Institucional 74-001-34-IRG). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

La sangre del cordón umbilical humano para la experimentación fue donada por individuos sanos después del consentimiento informado a Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. Las unidades desidentificadas se obtuvieron a través de un Acuerdo de Transferencia de Materiales entre MIHS y la Universidad de Arizona.
1. Reactivos y búferes
NOTA: Preparar todos los reactivos y tampones en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biológica.
<ol><li>Preparar un tampón estéril de PBS-BSA-EDTA (PBE) añadiendo 7,2 ml de albúmina sérica estéril 35% bovina (BSA; utilizar el cultivo de tejido estéril 35% BSA) y 5 ml de ácido tetra acético de etileno estéril de 0,5 M (EDTA) a 487,8 ml de fosfato estéril de Dulbecco tamponado salina (DPBS). Filtrar esterilizar y desgasificaciónr el tampón dejando el filtro unido al vacío en un armario de seguridad biológica durante al menos 2 h. Aliquot el tampón desgasilizado en volúmenes más pequeños (250 ml) y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Preparar 1 solución salina balanceada Hanks (1x HBSS). Diluir 100 ml de 10x HBSS en 900 ml de agua destilada estéril para hacer 1 L de 1x HBSS y ajustar el pH a 7.2. El filtro esteriliza el 1x HBSS antes de su uso.</li>
	<li>Preparar una solución de ácido acético al 2% añadiendo 2 ml de ácido acético glacial a 98 ml de agua destilada.</li>
	<li>Preparar 20 ng/ml solución de fragmento de fibronectina humana recombinante en 1x PBS. Hacer 10 ml por placa de 48 pocillos.</li>
	<li>Preparar 2% BSA. A 100 mL 1x PBS, añadir 2 gramos de fracción BSA V. Filtrar esterilizar antes de su uso.</li>
	<li>Haga un medio de águila modificada (DMEM) completo de Dulbecco añadiendo el polvo DMEM, bicarbonato sódico de 3,7 gm, suero bovino fetal de 100 ml (FBS) y 5 ml de penicilina-estreptomicina (PS) a 800 ml de agua destilada estéril. Mezclar y componer el volumen a 1 L, y filtrar esterilizar antes de su uso.</li>
	<li>Preparar el medio de congelación mezclando 90 ml de FBS y 10 ml de dimetilsulfóxido estéril (DMSO).</li>
	<li>Prepare el medio de estimulación. Para el medio libre de suero, añadir L-glutamina a 2 mM, y citoquinas a una concentración final de 50 ng/mL para factor de células madre (SCF), trombopoietina (TPO), y Fms-como tirosina quinasa 3 ligand(Flt3L), y 20 ng/mL para interleukin-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligandro (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligar (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina- para la preparación de soluciones de stock de citoquinas). Hacer 5 mL por placa de 48 pocillos.</li>
	<li>Preparar 1x medio de diferenciación mieloide. Para completar DMEM, añada citoquinas a una concentración final de 5 ng/ml para SCF, Flt3L e IL3, 50 ng/mL para TPO y 4 unidades/ml para eritropoyetina (EPO). Hacer 5 mL por placa de 48 pocillos.</li>
	<li>Preparar 2x medio de diferenciación mieloide. Para completar DMEM, añada citoquinas a una concentración final de 10 ng/ml para SCF, Flt3L e IL3, 100 ng/mL para TPO y 8 unidades/ml para EPO. Hacer 5 mL por placa de 48 pocillos.</li>
	<li>Prepare el búfer de citometría de flujo. A 1 L de 1x PBS, agregue 10 g de fracción BSA V.</li>
	<li>Prepare 1% de paraformaldehyde en 1x PBS (ver Tabla de Materiales para más detalles).</li>
	<li>Preparar la solución de poli-L-lisina mediante la adición de 500 l de 10 mg/ml poli-L-lisina a 49,5 ml de 1x PBS.</li>
</ol>2. Aislamiento de células mononucleares de la sangre del cordón umbilical
NOTA: Para el protocolo descrito a continuación, se utilizaron volúmenes de sangre de cordón umbilical de 90 a 100 ml. El aislamiento de las células CD34+ debe realizarse en condiciones estériles en un armario de seguridad biológica.
<ol><li>Rocíe la bolsa que contiene UCB con 70% de etanol para esterilizar la superficie exterior antes de introducirla en el gabinete de seguridad biológica. Transfiera el UCB a una botella de plástico estéril de 250 ml y diluya 1:1 añadiendo un volumen igual de temperatura ambiente (RT) 1x HBSS.</li>
	<li>Dispensar 15 ml de medio de fraccionamiento MNC (MFM; ver Tabla de Materiales)por tubo en aproximadamente seis tubos cónicos estériles de 50 ml. Incline el tubo con MFM, y vierta suavemente 30 ml de UCB diluido sobre la capa de MFM sin molestarlo.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 400 x g durante 30 min a RT con aceleración lenta y sin freno.</li>
	<li>Después de la centrifugación, aspirar entre 15-20 mL del plasma por encima de la capa MNC. Recoja suavemente los MNC con una pipeta y transfiera a un nuevo tubo cónico de 50 ml. NOTA: Los MNC se depositan como una capa blanca y pulsada en la interfaz del plasma y el MFM, y el sedimento de los glóbulos rojos (RBR) en la parte inferior del tubo cónico.</li>
	<li>Piscina MNCs recogidos de 2-3 tubos juntos. Componer el volumen de cada tubo a 50 ml con tampón PBE frío.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 min a 4oC, con el freno bajo.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y toque el tubo suavemente para aflojar el pellet celular.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células peletadas en 5 ml de tampón PBE helado. Utilice los mismos 5 ml de células resuspendidas para recoger células de otros tubos. Combine las células de 3 a 4 tubos en un tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Para recoger las células restantes, lave todos los tubos con 5 ml de tampón PBE frío y agréguelos al tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Cuente los MNC diluyendo 10 ml de suspensión celular en una solución de ácido acético de 490 l. NOTA: El ácido acético lide cualquier glóbulo contaminante para permitir un recuento más fácil de los MNC.</li>
	<li>Componer el volumen de la suspensión celular a 50 ml con tampón PBE frío con hielo. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4oC, con freno bajo. NOTA: La suspensión MNC puede procesarse inmediatamente para el aislamiento de células CD34+ o congelada para aplicaciones posteriores.</li>
	<li>Para congelar los MNC, retire el sobrenadante y vuelva a suspender a una densidad de 2 x 107 células/ml en medio de congelación en RT.</li>
	<li>Congele las células a -80 oC durante la noche en un recipiente de congelación celular y luego transfieralas a nitrógeno líquido.</li>
</ol>3. Aislamiento de CD34+ Células de células mononucleares
<ol><li>Si utiliza MNCs recién aislados proceda directamente al paso 3.3.</li>
	<li>Si utiliza MNCcongelados congelados, descongele rápidamente las células congeladas en un baño de agua de 37 oC y transfiera a un tubo cónico de 50 ml. Recoger las células restantes en los viales con 1 ml de tampón PBE helado y transferirlas al tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Hacer el volumen de la suspensión MNC a 50 ml con tampón PBE frío y centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 oC.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y toque suavemente el tubo para aflojar el pellet celular. Vuelva a suspender los MNC a 1 x 108 células en 300 ml de tampón PBE helado.</li>
	<li>Agregue 100 l de reactivo de bloqueo de FcR del kit de microperlas de células de activación magnética (MACS) por cada 1 x 108 MNCs y mezcle suavemente. NOTA: Esto bloquea la unión inespecífica a los microperlas CD34.</li>
	<li>Agregue 100 l de los microperlas CD34 por cada 1 x 108 celdas. Mezcle suavemente e incubar a 4oC durante 30 min en nevera. No incubar sobre hielo.</li>
	<li>Mientras las celdas están incubando, coloque una columna LS y un filtro de preseparación en el campo magnético del separador MACS. Equilibrar la columna con búfer PBE frío mediante la adición de 2 ml directamente en la columna y 1 ml en el filtro de separación previa. Deje que la columna se vacíe en un tubo cónico de 15 ml y deseche el flujo a través.</li>
	<li>Retire los MNC s de 4 oC, añada un tampón PBE helado para aumentar el volumen a 15 ml y centrifugar las células a 300 x g durante 10 minutos a 4 oC, con el freno bajo.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de tampón PBE helado.</li>
	<li>Agregue la suspensión de celda al filtro de preseparación colocado en la columna LS. NOTA: El filtro de separación previa elimina los agregados de celdas grandes que pueden bloquear la columna.</li>
	<li>Enjuague el tubo con 3 ml de tampón PBE helado y agréguelo al filtro de preseparación colocado en la columna LS. Después de esto, deseche el filtro de separación previa.</li>
	<li>Lave la columna LS cuatro veces agregando 3 ml de tampón PBE helado, permitiendo que la columna drene cada vez. NOTA: Las celdas CD34+ permanecerán enlazadas a la columna y las celdas sin etiquetar fluirán a través de la columna.</li>
	<li>Después del lavado final, retire la columna del campo magnético del separador MACS y colóquela en un nuevo tubo cónico de 15 ml, lejos del imán.</li>
	<li>Agregue un búfer PBE helado de 5 ml a la columna y expulse las células CD34+ enlazadas presionando firmemente el émbolo.</li>
	<li>Opcionalmente, pase CD34+ celdas aisladas de la primera columna sobre otra columna LS con el filtro de preseparación como se describió anteriormente (pasos 3.10-3.13).</li>
	<li>Cuente el CD34+ celdas aislados con trippan azul (10 l de células y 10 l de trippan azul) para determinar el número total de células vivas. NOTA: En esta etapa, las células aisladas CD34+ pueden congelarse para su uso posterior o pueden procesarse directamente para el análisis de hSCCP mediante citometría de flujo (sección 4) o para la diferenciación a las células de linaje mieloides (sección 5).</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de la celda a 600 x g durante 5 min a RT, con freno bajo.</li>
	<li>Para congelar las células CD34 +, aspirar el sobrenadante y volver a suspender hasta 5 x 106 células en 1 ml de medio de congelación y congelar como se describió anteriormente (paso 2.13). De lo contrario, proceda a la sección 4 o 5.</li>
</ol>4. Determinación de las poblaciones de tallo y progenitores por citometría de flujo
<ol><li>Para determinar las fracciones de las poblaciones de tallo y progenitor en los CD34+ HSPC recién aislados, centrirítelas a 600 x g durante 5 min y vuelva a suspender 1 x 106 células en 50 ml de tampometría de citometría de flujo.</li>
	<li>A 1 x 106 células CD34 +, añada anticuerpos (ver Tabla de Materiales para diluciones) a los marcadores de linaje (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 y CD235a — todos los FITC etiquetados), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) y 7- aminoactinomicina D (7-AAD; como una mancha viva / muerta) y conforman el volumen total a 100 ol. Incubar sobre hielo en la oscuridad durante 20 minutos. NOTA: Menos de 1 x 106 CD34+ células pueden ser empleadas para el análisis. Si se tiñen menos células, el volumen total y el volumen de anticuerpos añadidos deben reducirse en consecuencia. Para el análisis de citometría de flujo, se deben utilizar MNC sin manchas y de una sola mancha como controles para establecer puertas positivas y negativas para cada fluoróforo.</li>
	<li>Después de la incubación, lave las células con 1 ml de tampón de citometría de flujo y centrífuga a 600 x g durante 5 min.</li>
	<li>Opcionalmente, fije las células manchadas en 0,5 ml de solución de paraformaldehído al 1% durante 10 minutos en la oscuridad en RT.</li>
	<li>Centrífuga a 600 x g durante 5 min y aspirar al sobrenadante.</li>
	<li>Lavar las células fijas/teñidas con 1 ml de tampón de citometría de flujo y centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 oC.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, volver a suspender las células en 500 s de tampometría de flujo y analizarlas mediante un citómetro de flujo (Tablade materiales).</li>
</ol>5. Diferenciación mieloide del CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y del progenitor
NOTA: Para diferenciar los CD34+ HSpCs a las células del linaje mieloide, primero se estimulan en placas recombinantes recombinantes recombinantes recombinantes de fragmentos de fibronectina humana y luego se sembran en una capa de células estromales MS-5 en el medio de diferenciación mieloide. La diferenciación se puede controlar cada semana durante 3 semanas en función de la expresión de marcadores de superficie celular específicos de los cuatro linajes mieloides. Durante la estimulación y la diferenciación, todas las incubaciones se realizan a 37 oC y 5% deCO2 en una cámara humidificada. Todos los pasos deben realizarse en un armario de seguridad biológica.
<ol><li>Recubrir los pozos de una placa estéril sin recubrir de 48 pocillos añadiendo 200 l/pozo de solución recombinante de fibronectina humana en 1x PBS durante 2 horas a RT.</li>
	<li>Después de 2 h, retire cuidadosamente la solución recombinante de fibronectina humana y deseche.</li>
	<li>Bloquear los pozos con 200 l/bien de 2% De BSA durante 30 min a RT.</li>
	<li>Aspirar la solución de BSA y lavar los pozos dos veces con 500 ml de PBS estéril 1x. NOTA: Las placas recubiertas de fragmentos de fibronectina pueden almacenarse a 4 oC durante un máximo de 2 semanas.</li>
	<li>Para estimular los CD34+ HSCCP, vuelva a suspender las células recién aisladas (del paso 3.17) a una densidad de 1 x 105 células/200 l o 5 x 105 células/ml de medio de estimulación 1x caliente.</li>
	<li>Si utiliza CD34+ células congeladas, descongele y transfiera rápidamente las células a un tubo cónico de 15 ml que contenga DMEM caliente y completo. Centrifugar a 600 x g durante 5 min y volver a suspender las células como se describe en el paso 5.5.</li>
	<li>Placa 200 l del CD34+ suspensión celular por pozo del fragmento de fibronectina recubierto de placa de 48 pocillos e incubar durante 48 h.</li>
	<li>Al día siguiente, la semilla 15.000 células estromales MS-5 en 200 ol de DMEM completo por pozo de una placa tratada con cultivo de tejido de 48 pocillos e incubar a 37 oC durante 24 horas.</li>
	<li>Después de 48 h de estimulación, recoger el CD34+ células mediante pipeteo suave. Lave los pozos con 500 ml de DMEM caliente y piscina con la suspensión de la celda.</li>
	<li>Cuente las celdas con trippan azul. Centrifugar la suspensión a 600 x g durante 5 min y volver a suspender a una densidad de 5.000 células/200 l de 1x medio de diferenciación mieloides.</li>
	<li>A partir de la placa de cultivo de tejido de 48 pocillos sembrada con células estromales MS-5, aspirar suavemente el medio sin perturbar las células. Capa 200 l (5.000 celdas) del CD34+ suspensión celular por pozo de la placa e incubar a 37 oC. NOTA: El cultivo de las células MS-5 se puede mantener en el DMEM completo. El día en que se sembran las células CD34 +, las células MS-5 deben estar en una capa uniforme (80-90% de confluencia). Se recomienda que las células MS-5 se celen al menos 24 horas antes de la sembración de las células CD34 +.  Si las células MS-5 deben ser chapadas 48 h o 72 h antes de la sembración de las células CD34+, la densidad celular debe ajustarse en consecuencia. También se recomienda que los pozos periféricos de la placa de 48 pocillos se dejen en blanco o se llenen con 200 ml de agua estéril para evitar efectos en los bordes.</li>
	<li>Realice un cambio medio-medio cada 3 x 4 días retirando suavemente 100 ml del medio de la parte superior de cada pocal y reemplazándolo por 100 s de 2x medio de diferenciación mieloide por pozo.</li>
	<li>El día 21, cosechar las células para el análisis de la expresión del marcador de linaje mieloide por citometría de flujo. Sin alterar la capa MS-5, pipetee suavemente el medio y transfiera las células a un tubo de 5 ml. NOTA: Para el análisis de tinción y citometría de flujo, las células de 1-2 pozos son suficientes. La diferenciación también se puede controlar en los días 1, 7 y 14. Si se realiza inmunofenotipado en varios días, el número de pozos necesarios para el análisis debe calcularse en consecuencia.</li>
	<li>Manchas 5 x 105 células con anticuerpos a CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5) y CD235a (APC) en un volumen total de 50 l. Incubar en hielo en la oscuridad durante 20 min. Incluir MNCs sin mancha y de una sola mancha como controles para establecer puertas positivas y negativas para cada fluoróforo, y 7-AAD como una mancha viva / muerta para eliminar las células muertas del análisis.</li>
	<li>Lavar y fijar (opcional) las células manchadas como se describió anteriormente (pasos 4.3-4.6).</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en un búfer de citometría de flujo de 500 ml y analizarlas mediante un citómetro de flujo.</li>
</ol>6. Evaluación de la Morfología Celular
<ol><li>Limpie los portaobjetos del microscopio pulverizando etanol y limpiando hasta que sea chirrecto.</li>
	<li>Sumerja las diapositivas limpias en la solución de poli-L-lisina durante 5 min a RT y seque durante 1 h en RT.</li>
	<li>Resuspenda los HSCCP del paso 3.14 y las células diferenciadas del paso 5.13 en 10 l de tampometría de citometría de flujo.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a los portaobjetos recubiertos y déjelos secar al aire. NOTA: Las diapositivas del día 1 y el día 21 se pueden almacenar en RT y mancharse simultáneamente.</li>
	<li>Vierta 0,5 ml de la mancha Wright-Giemsa en el tobogán y deje reposar durante 3 minutos en RT.</li>
	<li>Añadir el mismo volumen de agua desionizada y dejar reposar durante 10 minutos adicionales en RT.</li>
	<li>Lave el portaobjetos con agua desionizada.</li>
	<li>Visualice las células manchadas con un aumento de 60x o 100x por un microscopio.</li>
</ol>

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<li>Caceres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+suppression+promotes+erythropoiesis+in+del%285q%29+MDS%2C+suggesting+a+targeted+therapeutic+strategy+in+lenalidomide-resistant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASXL1+plays+an+important+role+in+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ASXL1 plays an important role in erythropoiesis.</a> Scientific Reports. 6, 28789(2016).</li>
<li>Mazumdar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-Associated+Cohesin+Mutants+Dominantly+Enforce+Stem+Cell+Programs+and+Impair+Human+Hematopoietic+Progenitor+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+expression+of+an+Flt3+internal+tandem+duplication+in+human+CD34%2B+cells+confers+properties+of+self-renewal+and+enhanced+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis.</a> Blood. 105 (1), 77-84 (2005).</li>
<li>Ambrosini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+inhibits+ILC3+while+favoring+NK-cell+maturation+of+umbilical+cord+blood+CD34%28%2B%29+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors.</a> European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).</li>
<li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%28beta%291+maintains+hematopoietic+immaturity+by+a+reversible+negative+control+of+cell+cycle+and+induces+CD34+antigen+up-modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation.</a> Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).</li>
<li>Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+potent+small+molecule+capable+of+regulating+polyploidization%2C+megakaryocyte+maturation%2C+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production.</a> Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí es adecuado para la diferenciación ex vivo de CD34+ HSCCP derivados ucB a los cuatro linajes mieloides. La incubación inicial con una mezcla de citoquinas que consiste en Células SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula las células CD34+. Posteriormente, la diferenciación se logra con un cóctel de SCF, IL3, Flt3L, EPO y TPO. En esta mezcla, SCF, IL3 y Flt3L son importantes para la supervivencia y proliferación de CD34+ HSCs. EPO y TPO promueven la diferenciación hacia los...

La diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas (HSC) es fundamental para el mantenimiento de los niveles fisiológicos de todos los linajes de células sanguíneas. Durante la diferenciación, en una respuesta coordinada a las señales extracelulares, incluidos los factores de crecimiento y las citoquinas, los HSC dan lugar primero a células progenitoras multipotentes (MPP) que tienen potencial linfo-mieloides1,2,3 ,4 (Figura 1). Los PMP dan lugar a progenitores mieloides comunes (CMP) y progenitores linfoides comunes (CLP) que están restringidos al linaje. Los CLP se diferencian en los linajes linfoides compuestos por Células, T y células asesinas naturales. Los CMP generan los linajes mieloides a través de dos poblaciones de progenitores más restringidas, progenitores de eritroides de megacarilocitos (MEP) y progenitores de monocitos granulocitos (GMP). Los eurodiputados dan lugar a megacariocitos y eritrocitos, mientras que los GMP dan lugar a granulocitos y monocitos. Además de surgir a través de los CMP, se ha informado que los megacariocitostambién surgen directamente de los HSC o de los primeros PMP a través de vías no canónicas 5,6.
Las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC) se caracterizan por el marcador de superficie CD34 y la falta de marcadores específicos de linaje (Lin-). Otros marcadores de superficie que se emplean comúnmente para distinguir las poblaciones de Progenitores DeSC y mieloides incluyen CD38, CD45RA y CD1232 (Figura1). Los HSC y los MPP son Lin-/CD34+/CD38- y Lin-/CD34+/CD38+, respectivamente. Las poblaciones de progenitores comprometidos mieloides se distinguen por la presencia o ausencia de CD45RA y CD123. Los CMP son Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, los GMP son Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, y los MEP son Lin-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.
La población total decélulas madre y progenitora CD34 se puede obtener de la sangre del cordón umbilical humano (UCB), la médula ósea y la sangre periférica. CD34+ células constituyen 0.02% a 1.46% del total de células mononucleares (MNC) en UCB humano, mientras que su porcentaje varía entre 0.5% y 5.3% en la médula ósea y es mucho menor a 0.01% en sangre periférica7,8,9 . La capacidad proliferativa y el potencial de diferenciación de las células UCB derivadas CD34+ es significativamente mayor que la de la médula ósea o las células sanguíneas periféricas1,10, ofreciendo así una clara ventaja para obtener material suficiente para los análisis moleculares en combinación con la realización de caracterización inmunofenotípica y morfológica de las células durante la diferenciación.
La diferenciación ex vivo de la sangre del cordón umbilical derivada de CD34+ HSPCs es un modelo ampliamente aplicado para investigar los mecanismos normales de la hematopoyesis y la enfermedad hematopoyética. Cuando se cultiva con las citoquinas apropiadas, los UCB CD34+ HSCCP pueden ser inducidos a diferenciar a lo largo de los linajes mieloides o linfoides11,12,13,14,15 , 16. Aquí, describimos protocolos para el aislamiento y la caracterización inmunofenotípica de los CD34+ HSCCP de UCB humano, y para su diferenciación a las células de linaje mieloides. Este sistema de cultivo se basa en la diferenciación inducida por citoquinas de los HSCCP en presencia de células estromales MS-5 para imitar el microambiente en la médula ósea. Las condiciones de cultivo causan una expansión inicial de las células CD34 +, seguidas de su diferenciación a las células que expresan marcadores para las cuatro células de linaje mieloides, a saber, granulocitos (CD66b), monocitos (CD14), megacariocitos (CD41) y eritrocitos (CD235a). Las aplicaciones del protocolo CD34+ diferenciación celular incluyen estudios sobre mecanismos moleculares que regulan la hematopoyesis, y investigaciones sobre el impacto de mutaciones asociadas a la enfermedad mieloide y moléculas pequeñas en la auto-renovación y la auto-renovación y diferenciación de los HSCCP.

<table><tbody><tr><td>Solución de azul de tripano al 0,4 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>Material de trabajo diluido al 0,2 % en estéril 1 PBS</td></tr><tr><td>0,5 M Ácido tetraacético etileno diamina ultrapuro, pH 8,0</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>10x Solución salina equilibrada Hanks (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14185052</td><td>Diluir a 1x con agua destilada estéril y pH a 7,2</td></tr><tr><td>2,5% de tripsina, rojo sin fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090046</td><td>Diluir material de trabajo a 1x con estéril 1x PBS</td></tr><tr><td>30 y micro; m Filtros de preseparación</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>35% estéril Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td>Se utiliza como tinción viva/muerta para eliminar las células muertas del análisis FACS</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD10-FITC (Clon HI10a)</td><td>Biolegend</td><td>312207</td><td>Uso Dilución</td></tr> <tr><td>1:20Anticuerpo antihumano CD11b-FITC (activado) (clon CBRM1/5)</td><td>Biolegend</td><td>301403</td><td>Uso 1:5</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD123-APC (clon 6H6)</td><td>Biolegend</td><td>306012</td><td>uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD14-PE (clon M5E2)</td><td>Biolegend</td><td>301806</td><td>uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD19-FITC (clon 4G7)</td><td>BD Biosciences</td><td>347543</td><td>uso Dilución 1:5</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD235a-APC (clon GA-R2 (HIR2)</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td>uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD235a-FITC (clon HIR2)</td><td>Biolegend</td><td>306609</td><td>uso Dilución 1:50</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD34-APC-Cy7 (clon 581)</td><td>Biolegend</td><td>343514</td><td>uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-humano CD38-PE (clon HIT2)</td><td>Biolegend</td><td>303506</td><td>Usar dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD3-FITC (clon UCHT1)</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td>uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD41a-PerCP-Cy5.5 (clon HIP8)</td><td>Biolegend</td><td>303720</td><td>Uso en dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD45Ra-PE-Cy7 (clon HI100)</td><td>Biolegend</td><td>304126</td><td>uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD66b-PE-Cy7 (clon G10F5)</td><td>Biolegend</td><td>305116</td><td>uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-humano CD7-FITC (Clon CD7-6B7)</td><td>Biolegend</td><td>343103</td><td>Uso Dilución 1:20</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Filtro esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Polvo de medio de águila modificado (DMEM) con L-glutamina &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td>Reconstituir 1 paquete para hacer 1 L de medio DMEM con bicarbonato de sodio, 10% de FBS y 1% de penicilina y estreptomicina&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, fuente australiana, inactivado por calor</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22 Lote #609716</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microperlas CD34 humanas&nbsp;</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-046-702</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoyetina humana (TPO), grado de investigación</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-094-011</td><td>Haga un stock de 100 &micro; g/mL en 1x PBS + 0.1% BSA. Utilice 50 ng/mL para la diferenciación mieloide y medio de estimulación</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Omega Scientific</td><td>GS-60 Concentración de</td><td>2 mM en medio</td></tr><tr><td>de estimulación LS Columnas Miltenyi</td><td>biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi stand</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS separador magnético</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Medios de fraccionamiento MNC (Ficol-Paque PLUS)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr>Células <td></td><td></td><td>MS-5</td><td>Regalo del laboratorio de Gay Crooks, UCLA</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Calentar 800 mL de 1x PBS en un vaso de precipitados de vidrio en una placa de agitación en una campana química a ~ 65 &deg;C. Agregue 10 g de polvo de paraformaldehído. Para disolver completamente el paraformaldehído, eleve el pH agregando 1 N NaOH. Enfríe y filtre la solución y aumente el volumen a 1 L con 1x PBS. Ajuste el pH a 7.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina & Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Hacer un stock de 10 mg/mL en 1x PBS</td></tr><tr><td>Eritropoyetina-alfa humana recombinante (rHu EPO-&alpha;)</td><td>BioBasic</td><td>RC213-15</td><td>Realice un stock de 2.000 unidades/mL en 1x PBS + 0,1% BSA. Utilice 4 unidades/mL para la diferenciación mieloide Fragmento</td></tr><tr><td>de fibronectina humana recombinante (RetroNectin)</td><td>Takara&nbsp;</td><td>T100B</td><td>Uso 20 &micro; g/mL diluido en PBS estéril 1x para recubrir los pocillos antes de la estimulación de las HSCs CD34+.</td></tr><tr><td>Ligtando humano recombinante Flt-3 (rHu Flt-3L)</td><td>BioBasic</td><td>RC214-16</td><td>Haga un stock de 100 &micro; g/mL en 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL para la diferenciación mieloide & 50 ng/mL en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Interleucina-3 humana recombinante (rHu IL-3)</td><td>BioBasic</td><td>RC212-14</td><td>Haga un stock de 100 &micro; g/mL en 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL para la diferenciación mieloide & 20 ng/mL en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Factor de células madre humanas recombinantes (rHu SCF)</td><td>BioBasic</td><td>RC213-12</td><td>Haga un stock de 100 &micro; g/mL en 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL para la diferenciación mieloide & 50 ng/mL en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Medio libre sérico (X-Vivo-15)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Wright-Giemsa tinción, modificado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WG16-500</td><td>Úselo de acuerdo con las instrucciones del fabricante</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo&nbsp; Citómetro de flujo </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II Centrífuga</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td> óptico <td>Sorvall Legend RT</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada cd34+ células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

La diferenciación ex vivo de células madre hematopoyéticas humanas es un modelo ampliamente utilizado para estudiar la hematopoyesis. El protocolo descrito aquí es para la diferenciación inducida por citoquinas de CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a las cuatro células de linaje mieloides. CD34+ células están aisladas de la sangre del cordón umbilical humano y co-cultivadas con células estromales MS-5 en presencia de citoquinas. Se describe la caracterización inmunofenotípica de las células madre y progenitora, y las células de linaje mieloides diferenciadas. Usando este protocolo, las células CD34+ pueden ser incubadas con moléculas pequeñas o transducidas con lentivirus para expresar mutaciones de la enfermedad mieloide para investigar su impacto en la diferenciación mieloide.

La aplicación de los protocolos anteriores produce 5,6 (a 0,5) x 108 MNCs y 1 (a 0,3) x 106 CD34+ células de una unidad de sangre de cordón umbilical de 100 ml. El porcentaje del total de CD34+ celdas oscila entre 80-90% (Figura2A,B). 5 demuestra que las células CD34+ consisten típicamente en HSC s20% y MPP de 72% que son Lin-/CD34 + /CD38<sup...

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Este protocolo se puede utilizar para estudiar los cambios moleculares y celulares que se producen durante la diferenciación mieloide normal del tallo hematopoyético positivo CD34 humano y las células progenitoras. La principal ventaja de este protocolo es que permite la diferenciación de células positivas CD34 a lo largo de los cuatro linajes mieloides incluyendo megacariocitos, eritrocitos, granulocitos y monocitos. Demostrando el procedimiento estará Aditi Bapat, un post-doc de mi laboratorio.Para el aislamiento de células mononucleares de una muestra de sangre de cordón umbilical humano, esterilizar la superficie externa de una bolsa de sangre de cordón umbilical con 70% etanol antes de transferir el contenido de la bolsa a una botella de plástico estéril de 250 mililitros dentro de un gabinete de seguridad biológica. Diluir la sangre con un volumen igual de la solución salina tamponada de Hank a temperatura ambiente, y añadir 15 mililitros de medio de fraccionamiento celular mononuclear a cada uno de los cinco tubos cónicos estériles de 50 mililitros. Después de una mezcla suave, vierta cuidadosamente 30 mililitros de la sangre del cordón umbilical diluido en el medio de fraccionamiento mononuclear en cada tubo, sosteniendo los tubos de 50 mililitros en un ángulo para ayudar a evitar mezclar las capas.Separe las células por centrifugación de gradiente de densidad, y retire los 15 a 20 mililitros superiores de plasma por encima de la capa de célula mononuclear. Utilice una pipeta para transferir cuidadosamente la capa de celda mononuclear expuesta a un nuevo tubo de 50 mililitros, juntando las células mononucleares de dos a tres tubos juntos, y lleve el volumen final en cada tubo hasta 50 mililitros con tampón PBE frío. Pele el mononuclear de las muestras de células por centrifugación, y aspirar a los sobrenadantes.Toque suavemente cada tubo para aflojar los pellets de la célula y diluir los pellets en cinco mililitros de tampón PBE helado. Combine las células de tres a cuatro tubos en un tubo cónico de 50 mililitros, y lave todos los tubos con cinco mililitros de tampón PBE fresco para recoger las células restantes. Después de contar, traiga el volumen final en el tubo hasta 50 mililitros con tampón PBE helado fresco, y recoja las células por centrifugación.Para aislar las células mononucleares positivas CD34, vuelva a suspender el pellet en 50 mililitros de tampón PBE fresco antes de recoger las células con otra centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, toque suavemente para aflojar el pellet y vuelva a suspender las células en una de las 10 a las ocho células mononucleares por cada 300 microlitros de concentración de Tampón PBE helada. Bloquee cualquier unión inespecífica con 100 microlitros del reactivo de bloqueo del receptor Fc, mezcle suavemente y luego agregue 100 microlitros de microperlas CD34 de un kit de micropera CD34 humano de clasificación celular activado magnética por uno por 10 a las ocho células con mezcla suave, e incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Mientras las células están incubando, coloque una columna LS y un filtro de preseparación en un campo magnético separador MACS. Equilibre la columna con dos mililitros de tampón PBE helado y el filtro de preseseleccionado con un mililitro de tampón. Deje que la columna se vacíe en un tubo cónico de 15 mililitros y deseche el flujo a través.Al final de la incubación, llevar el volumen final de la muestra de célula mononuclear hasta 15 mililitros con lúxifado PBE frío fresco y sedimentar las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón PBE helado y cargue las células en el filtro de preseselección en la columna. Enjuague el tubo con tres mililitros de tampón PBE frío y añada el tampón al filtro de presegueta.Lave la columna cuatro veces con otros tres mililitros de tampón de PBE helado por lavado sin el filtro, lo que permite que la columna drene completamente entre cada lavado. Después del lavado final, mueva la columna a un nuevo tubo de 15 mililitros y sumerja cinco mililitros de PBE frío fresco a través de la columna en el tubo. Para determinar las fracciones de las poblaciones de tallo y progenitor en el recién aislado CD34 positivo células madre y progenitora, recoger las células por centrifugación y re-suspender el pellet en un uno veces 10 a las seis células por cada 50 microlitros de concentración de tampón de citometría de flujo.A continuación, transfiera las células en 50 alícuotas de microlitros por tubo de clasificación celular activado por fluorescencia de cinco mililitros de acuerdo con el protocolo experimental de tinción de citometría de flujo. Agregue el cóctel de anticuerpos adecuado y la tinción viva/muerta a las células, ajustando el volumen a 100 microlitros totales. Después de 20 minutos en la oscuridad protegido de la luz, lave las células con un mililitro de tampón de citometría de flujo fresco por tubo, y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de citometría de flujo fresco por tubo.Luego analice las células en un citometro de flujo de acuerdo con los protocolos citométricos de flujo estándar. Para diferenciar las células positivas CD34 aisladas de microperla en células de linaje mieloide, cubra primero los pozos de una placa estéril de 48 pozos sin recubrimiento con 200 microlitros por pozo de solución de fibronectina humana recombinante en PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, deseche la solución de fibronectina de cada pozo y bloquee los pozos con 200 microlitros de albúmina sérica 2%bovina.Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los pozos dos veces con 500 microlitros de PBS estériles por lavado. Re-suspender las células positivas CD34 recién aisladas a cinco veces 10 las cinco células por mililitro de concentración media de estimulación caliente. A continuación, sembrar 200 microlitros de células en cada pozo de la placa recubierta de fragmento de fibronectina y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas.Al final de la incubación, recoger las células con pipeteo suave, y lavar los pozos con 500 microlitros de caliente Dulbecco modificado Medio Eagle, la agrupación de los lavados con la suspensión celular. Después de contar, vuelva a suspender las células a una concentración media de diferenciación de 2,5 veces 10 por mililitro de mieloide. Microlitros de capa 200 de células positivas CD34 por pozo en una placa de cultivo de tejido MS-5 sembrada de células estromales 48 pozos.A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular, reemplazando suavemente 100 microlitros del sobrenadante en cada pozo con 100 microlitros de medio de diferenciación mieloide 2X fresco cada tres a cuatro días. En el día 21, cosecha las células para el análisis de la expresión del marcador de linaje mieloide por citometría de flujo como se acaba de demostrar. El porcentaje típico de células positivas CD34 totales aisladas de la sangre del cordón umbilical por separación de microperas, como lo demuestra, oscila entre el 80 y el 90%Análisis inmunofenotípico revela que estas células positivas CD34 suelen consistir en una población de células madre hematopoyéticas positivas CD38 CD38 positivas de aproximadamente 20%linaje y una población de células madre vugeno positiva CD38.Dentro de la población multitenidor de células progenitoras, alrededor del 25% de las células expresan marcadores comunes de progenitores mieloides, alrededor del 15% marcadores de progenitor de monocitos de granulocitos expresos, y alrededor del 56% expresan marcadores de progenitor de megacariocitos eritroideos exprés. El inmunofenotipado también demuestra que el porcentaje de células positivas CD34 reduce de aproximadamente 90%en aislamiento a menos del 25% en el día 21. El análisis de la población negativa CD34 demuestra un aumento concomitante en el porcentaje de células que expresan marcadores de linaje mieloide maduros.Además, las células manchadas Wright-Giemsa demuestran características morfológicas distintas en los días uno y 21 con los cultivos indiferenciados que exhiben núcleos grandes y redondos y muy poco citoplasma y los cultivos diferenciados que muestran características morfológicas de las células de linaje, incluyendo los cuales son monocitos, granulocitos y eritroblastos. Recuerde verter la sangre del cordón umbilical diluido en el medio de fraccionamiento de células mononucleares sin mezclar las capas, y no perturbe las células positivas MS-5 y CD34 al cambiar el medio. Siguiendo este protocolo de diferenciación, los cultivos celulares positivos CD34 se pueden analizar en busca de cambios morfológicos, efectos apoptóticos, cambios en los patrones de ciclo celular y el grado de diferenciación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Este video muestra una técnica para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Las células progenitoras madre hematopoyéticas, aisladas de la sangre del cordón umbilical humano, se diferencian en megacariocitos maduros en presencia de trombopoyetina. Los megacariocitos maduros producen extensiones citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dan lugar a plaquetas individuales.

Un método in vitro para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Una población altamente pura de megacariocitos puede obtenerse de cable derivadas de sangre CD34+ las células. Un método para CD34+ aislamiento y del megakaryocyte diferenciación se describe aquí.

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Aquí, describimos la ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas de CD34+ en células de sangre de cordón umbilical trataron con una combinación de un cytokine cóctel y VPA. Este método conduce a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio.

Ex Vivo expansión de células madre hematopoyéticas de cordón Umbilical humano derivadas de sangre CD34+ las células usando el ácido valproico

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Aquí se presenta una técnica basada en citometría de flujo que permite medir simultáneamente el número de divisiones celulares, el fenotipo celular superficial y el parentesco celular. Esas propiedades se pueden probar estadísticamente utilizando un marco basado en permutaciones.

Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

El modelado de la eritropoyesis proporciona una valiosa oportunidad para comprender la importancia biológica de los actores en este proceso y para evaluar nuevos enfoques terapéuticos que puedan aliviar los defectos de diferenciación. Aquí, describimos un método simple y confiable para diferenciar de manera eficiente las células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ ex vivo.

Un proyecto exhaustivo para evaluar la eficacia de la eritropoyesis humana in vitro y ex vivo

Aprende a diferenciar células CD34+ de sangre de cordón umbilical humano hacia las cuatro líneas mieloides usando citocinas. Este método permite estudiar la hematopoyesis y enfermedades mieloides.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34⁺ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

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