Name: Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a evaluar la motilidad uterina ex vivo en ratón mediante video digital y análisis con MATLAB. Este método cuantitativo permite probar relajantes uterinos para investigar tratamientos contra la dismenorrea.

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Este trabajo fue apoyado por fondos internos de IU. AGO concibió el estudio. XC y AGO participaron en el diseño de los experimentos descritos.  FL y AGO analizaron e interpretaron los datos. KLL, JOB, FL realizaron todos los experimentos ex vivo. FL escribió el script MATLAB. KLL, JOB y AGO escribieron el manuscrito.  Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Todos los procedimientos con animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana (Indianapolis, IN). En el estudio se utilizaron ratones hembra sexualmente maduros F2-129S-C57BL/6 de 2-5 meses de edad.
PRECAUCION: Garantice la seguridad usando una capa de laboratorio, una máscara y guantes cuando trabaje con animales y materiales biopeligrosos.
1. Preparación de la solución
<ol><li>Preparar el tampón Krebs, que contiene: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 0,56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3y 5 mM de glucosa, pH 7,4. Oxigenar continuamente el tampón Krebs con una mezcla de gases comprimidos que contienen 5% de CO2 y 95% De2 mientras mantiene la temperatura de tampón a 37 oC utilizando un baño de agua circulante.</li>
	<li>Preparar la salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS), quecontiene: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4,136,89 mM NaCl y 8,1 mM Na2HPO4,pH 7,4.</li>
</ol>2. Preparación animal
<ol><li>Anestetizar ratones con inhalación de isoflurano (3%) con barrido de gas residual. Asegurar una anestesia adecuada mediante la evaluación de los reflejos de abstinencia. Pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo trasero para afirmar que no se provocan movimientos, lo que indica la pérdida de respuestas reflejo. Después de que se logra la anestesia profunda, eutanasia al animal por decapitación. NOTA: El isoflurano puede causar dilatación muscular suave. Por lo tanto, la preparación del tracto reproductivo debe lavarse e incubarse ampliamente en el tampón Krebs durante al menos 15-30 minutos antes de comenzar los experimentos ex vivo. El isoflurano puede causar irritación y malestar cuando está en contacto con la piel, así que proceda con precaución.</li>
	<li>Coloque el cuerpo en un bote de pesaje grande forrado con una toalla de papel. NOTA: El personal de laboratorio femenino embarazada no debe participar en experimentos con isoflurano porque puede disminuir el peso fetal, disminuir la osificación esquelética fetal y aumentar el riesgo de aborto espontáneo8,9. La inhalación de CO2 se puede utilizar como sustituto de los ratones de eutanasia.</li>
</ol>3. Determinación de la etapa de ciclo de Estrous
<ol><li>Con pequeños fórceps, levante el clítoris para acceder al ostium vaginal e inserte lentamente una punta de micropipeta que contenga 10 ml de DPBS en la vagina.<ol>
<li>Asegúrese de que la punta del micropipeta se inserta a través del ostium en un ángulo de 10 - 30o para evitar puntuar la pared vaginal. El líquido todavía debe ser visible en la punta después de la inserción. Si el líquido no es visible, la punta se insertó demasiado lejos en la vagina, y el área paracervical de la vagina podría haber sido perforada.</li>
		<li>Tire ligeramente hacia abajo en los músculos vaginales del ostium con la punta de la micropipette para permitir que el aire salga de la vagina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjuague lentamente la cavidad vaginal pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces con 10 s de DPBS y coloque la suspensión de la célula dibujada en un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Utilice un microscopio de contraste de fase invertido para determinar la etapa del ciclo estroso a través del análisis citológico. El procedimiento se realiza como se describe en otros lugares10,11. Asegúrese de que la suspensión celular no se seque antes de que se pueda realizar el análisis citológico. La suspensión puede diluirse con DPBS fresco, si es necesario.</li>
</ol>4. Desdisección del tracto reproductivo del ratón
<ol><li>Organizar el ratón en una posición supina y extender sus extremidades para exponer la región abdominopelvic.</li>
	<li>Rocíe con 70% de etanol para humedecer y desinfectar la zona abdominopelvic.</li>
	<li>Con fórceps, levante cuidadosamente la piel que se encuentra superior al clítoris. Hacer pequeñas incisiones transversales en los aspectos laterales de la zona abdominal inferior, hasta las extremidades superiores para exponer el peritoneo (Figura1A). Durante este proceso, se formará una solapa externa. A medida que las pequeñas incisiones se hacen continuamente, la solapa aumentará de tamaño.</li>
	<li>Cortar cuidadosamente a través del peritoneo para exponer el tracto gastrointestinal (Figura 1B). Es importante tener en cuenta que los cuernos uterinos a menudo se pueden ubicar directamente debajo del peritoneo, así que haga incisiones con precaución y no toque los cuernos, ya que esto puede afectar la motilidad uterina.</li>
	<li>Usando fórceps, retire la fascia y el tejido adiposo que cubre el tracto gastrointestinal. Eliminar los siguientes segmentos del tracto gastrointestinal de la cavidad abdominal: el duodeno, el yeyuno, el íleon, el cecum, el colon ascendente y transversal (Figura1C).</li>
	<li>Para localizar los órganos reproductivos, primero identifique la vejiga urinaria (Figura1C, "4"), que puede tener una apariencia desinflada debido al vaciado después de la eutanasia. La vagina estará justo debajo de la vejiga urinaria.</li>
	<li>Localice la sínfisis púbica en la confluencia de los huesos púbicos (caudalmente a la vejiga).</li>
	<li>Usando tijeras, retire la sínfisis púbica haciendo cuidadosamente incisiones en sus lados laterales a través del tejido fibrocartilaginoso interpúbico para obtener acceso y proporcionar una ruta para la extracción de la vagina (Figura 1D).</li>
	<li>Corte a través del perineo situado entre el ano y la parte inferior de la vulva.</li>
	<li>Con fórceps, levante la vagina e exchorele lentamente el recto.</li>
	<li>Identificar dos cuernos uterinos que se bifurcan en un tenedor, rostrally a la vagina. Localice un oviducto y ovario enrevesado al final de cada cuerno, que puede estar oculto bajo los segmentos restantes del tracto gastrointestinal. Use tijeras disecantes pequeñas para eliminar los ligamentos que se conecten y apoyen los cuernos, oviductos y ovarios dentro de la cavidad abdominal.</li>
	<li>Retire el tracto reproductivo, que incluye la vagina, el útero, los oviductos y los ovarios, de la cavidad abdominal.</li>
	<li>Transfiera el tracto reproductivo aislado (Figura1E)a una placa Petri de 100 mm llena de 10 ml de DPBS. No comprima los cuernos uterinos para evitar dañar el miometrio.</li>
	<li>Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier tejido conectivo y adiposo que rodea los cuernos uterinos y la vagina, así como cualquier pelaje en la región púbica que pueda dificultar la calidad de la imagen. Retire el ligamento ancho para permitir la motilidad de los cuernos uterinos.</li>
	<li>Lavar el tracto reproductivo aislado con DPBS fresco dos veces y transferirlo a una placa Petri de 35 mm llena de 3 ml de solución de Krebs oxigenado.</li>
</ol>5. Imágenes de tejidos
<ol><li>Coloque la placa Petri que contiene el tracto reproductivo en un tampón Krebs oxigenado sobre una superficie negra. Mantenga el plato a temperatura ambiente. NOTA: Es posible utilizar una almohadilla de calentamiento por infrarrojos para mantener el tejido a 37 oC.</li>
	<li>Permita que comiencen 15-30 min para que comiencen las contracciones espontáneas. Registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.</li>
	<li>Transfiera la preparación a una placa Petri que contenga el tampón Krebs oxigenado complementado con un compuesto de prueba. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.</li>
	<li>Lavar todo el tracto reproductivo en una placa Petri de 100 mm con 10 ml de DPBS para evaluar la reversibilidad del tratamiento.</li>
	<li>Transfiera la preparación a un plato de Petri con el tampón Krebs recién oxigenado. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.</li>
	<li>Transfiera la preparación a otra placa Petri de 35 mm llena de tampones Krebs oxigenados complementado con el vehículo para el compuesto de prueba para asegurarse de que no haya cambios inducidos mecánicamente en la motilidad uterina espontánea. Este es un control importante.</li>
	<li>Transfiera el material de archivo de vídeo a un disco duro de ordenador.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Haga clips utilizando cualquier software de edición de vídeo a partir del material de archivo de vídeo original que contenga los episodios de control, tratamiento y lavado.</li>
	<li>Utilice el software MATLAB y el script proporcionado (consulte el material suplementario en línea) para cuantificar la motilidad uterina espontánea. NOTA: El complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB debe estar instalado para que el script sea completamente funcional.<ol>
<li>Abra el script de MATLAB, vaya a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar.</li>
		<li>Seleccione el primer archivo de vídeo y haga clic en Abrir.</li>
		<li>Introduzca una etiqueta para el archivo de vídeo en el cuadro de diálogo emergente y haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Introduzca el intervalo de tiempo (s) necesario para calcular la velocidad del movimiento de la bocina (distancia euclidiana / s).</li>
		<li>Utilice el cursor del ratón para seleccionar dos puntos en el primer fotograma del vídeo. Una ventana emergente le pedirá que confirme que los puntos seleccionados deben utilizarse para el seguimiento. Haga clic en Iniciar para iniciar el proceso de seguimiento en tiempo real que se mostrará en la ventana emergente. También puede hacer clic en Volver a seleccionar puntos para volver a seleccionar los dos puntos.</li>
		<li>Supervise la precisión del proceso de seguimiento en la ventana emergente.</li>
		<li>Observe una gráfica de dispersión de velocidad frente a dispersión de tiempo y gráfico de dispersión de distancia frente a dispersión de tiempo en una nueva ventana emergente. Guarde las dos figuras seleccionando Archivo ( File) Guardar como en la misma ventana para documentar los datos.</li>
		<li>Busque una carpeta denominada PointTrackerData, creada automáticamente por MATLAB, en el mismo directorio donde se encuentra el script de MATLAB. Identifique un archivo de Excel denominado label_Data que contenga puntos de datos recopilados del vídeo en dos pestañas de hoja de cálculo independientes. NOTA: Cualquier software de seguimiento de movimiento alternativo se puede utilizar para cuantificar la motilidad espontánea del útero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice un software adecuado (por ejemplo, Excel o SigmaPlot 13) para realizar el análisis estadístico.</li>
</ol>

<ol><li>Kuijsters, N. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+peristalsis+and+fertility%3A+current+knowledge+and+future+perspectives%3A+a+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis.</a> Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).</li>
<li>Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menstrual+characteristics+and+prevalence+of+dysmenorrhea+in+college+going+girls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Family+Medicine+and+Primary+Care%22%5BJournal%5D)">Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls.</a> Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).</li>
<li>Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+aerobic+exercise+on+primary+dysmenorrhea%3A+A+clinical+trial+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+education+and+health+promotion%22%5BJournal%5D)">The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study.</a> Journal of education and health promotion. 7, 3(2018).</li>
<li>Lindner, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+prostaglandins+in+the+regulation+of+cyclic+events+in+the+ovary+and+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+prostaglandin+and+thromboxane+research%22%5BJournal%5D)">Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus.</a> Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).</li>
<li>Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysmenorrhea+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+research%22%5BJournal%5D)">Dysmenorrhea and related disorders.</a> F1000 research. 6, 1645(2017).</li>
<li>Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs+for+dysmenorrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+database+of+systematic+reviews%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea.</a> The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751(2015).</li>
<li>Oladosu, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+skeletal+muscle+activity+precedes+spontaneous+menstrual+cramping+pain+in+primary+dysmenorrhea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91(2018).</li>
<li>Lawson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+exposures+among+nurses+and+risk+of+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).</li>
<li>Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+development+in+mice+exposed+to+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Fetal development in mice exposed to isoflurane.</a> Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), 35538(2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Appendix 4, Appendix (2009).</li>
<li>Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tocolytic+effect+of+catecholamines+in+the+gravid+rat+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+analgesia%22%5BJournal%5D)">The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus.</a> Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylephrine%2C+a+common+cold+remedy+active+ingredient%2C+suppresses+uterine+contractions+through+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling.</a> Scientific reports. 8 (1), 11666(2018).</li>
<li>Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomathematical+pattern+of+EMG+signal+propagation+in+smooth+muscle+of+the+non-pregnant+porcine+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus.</a> PLoS One. 12 (3), 0173452(2017).</li>
<li>Crane, L. H., Martin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pace-maker+activity+in+the+myometrium+of+the+oestrous+rat%3A+in+vivo+studies+using+video-laparoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+fertility%2C+and+development%22%5BJournal%5D)">Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy.</a> Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un método para evaluar la contractilidad espontánea de todo el tracto reproductivo de los roedores, que incluye los ovarios, oviductos, cuernos uterinos y la vagina. Utilizamos un método similar para demostrar el efecto relajante de la fenilefrina en la motilidad uterina espontánea13, sin embargo, en el pasado no pudimos proporcionar análisis cuantitativos de los datos. En este trabajo, desarrollamos un algoritmo para el análisis cuantitativo de datos de motilidad utilizando el m...

Como un órgano femenino importante, el útero es crucial para la reproducción y esencial para la nutrición del feto1. El útero consta de tres capas: perimetrio, miometrio y endometrio. El miometrio es la principal capa contráctea del útero y desempeña un papel clave en el parto del feto. El endometrio es la capa más interna que recubre la cavidad uterina y es esencial para la implantación de embriones. En las mujeres no embarazadas en edad reproductiva, la capa endometrial se desprende mensualmente al comienzo del ciclo menstrual. El miometrio ayuda en este proceso de desprendimiento manteniendo las contracciones miometriales espontáneas necesarias para eliminar el tejido endometrial necrótico del útero1.
Desafortunadamente, aumento de la contractilidad miometrial puede resultar en efectos secundarios negativos como dismenorrea, o calambres menstruales dolorosos. Esto se ve especialmente en las mujeres jóvenes y las mujeres nulosa22. Sin embargo, la dismenorrea es diferente para cada mujer y depende de la fuerza de sus contracciones miometriales; contracciones más fuertes se asocian a menudo con la sensación de calambres graves3. La contractilidad miometrial se puede visualizar mediante ultrasonido uterino y a menudo se reconoce como ondas endometriales. Se cree que la liberación mejorada de prostaglandinas durante la menstruación4 en un útero sometido a desprendimiento de endometrio contribuye a aumentar la hipercontractilidad miometrial, lo que resulta en isquemia e hipoxia del músculo uterino y, por lo tanto, aumenta dolor3.
La dismenorrea grave puede obstaculizar la actividad diaria de algunas mujeres y entre el 3 y el 33% de las mujeres tienen dolormuy intenso, lo que podría causar que una mujer esté en cama durante 1 a 3 días cada ciclo menstrual 5. La dismenorrea es la principal causa de morbilidad ginecológica en mujeres en edad reproductiva independientemente de su edad, nacionalidad y situación económica5. La prevalencia estimada de dismenorrea es alta y variable, oscilando entre el 45% y el 93% en mujeres en edad reproductiva5.  El dolor asociado a la dismenorrea tiene un efecto en la vida diaria de las mujeres y puede resultar en un bajo rendimiento académico en adolescentes, menor calidad del sueño, restricción de las actividades diarias, y cambios de humor5.
Muchas mujeres que experimentan dismenorrea grave recurren a medicamentos de venta libre para aliviar su dolor. Estos medicamentos de venta libre contienen inhibidores de la ciclooxigenasa (COX) que previenen la formación de prostaglandinas6. Sin embargo, los inhibidores de la COX están asociados con eventos cardiovasculares adversos, y alrededor del 18% de las mujeres con dismenorrea no responden a estos inhibidores7. Por lo tanto, hay una necesidad de nuevos medicamentos para reducir los calambres menstruales. Dado que la contraetimididad del útero contribuye a la patogénesis de la dismenorrea, una posible estrategia puede ser el uso de relajantes uterinos.
Es beneficioso cuantificar los efectos de los medicamentos relajantes potenciales en un modelo de contracciones espontáneas de ondas miometriales de origen natural. Sin embargo, hasta ahora, no se ha descrito ningún método ex vivo eficiente para probar fármacos relajantes musculares en el útero intacto. Actualmente, las mediciones de tensión isométrica se utilizan para evaluar los efectos del fármaco relajante. Durante estas mediciones, una tira muscular uterina se mantiene a una longitud constante bajo precarga en un baño de tejido, mientras que la fuerza de las contracciones del músculo uterino se registra antes y después de la estimulación de la oxitocina en presencia o ausencia de un medicamento relajante. Aunque este enfoque es muy útil, requiere equipos costosos. Además, las contracciones isométricas no se asemejan a las contracciones espontáneas similares a las ondas miometriales que se producen naturalmente en el útero intacto. De manera única, las ondas miometriales uterinas en roedores se pueden visualizar como motilidad del cuerno uterino cuando todo el tracto reproductivo (ovarios, oviductos, útero y vagina) se mantiene en una solución tampón. Aquí, presentamos un método ex vivo para monitorear la motilidad espontánea del útero intacto del ratón colocado en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. También describimos un algoritmo de cuantificación de motilidad utilizando el rastreador de movimiento MATLAB. Este enfoque novedoso proporciona una alternativa fácil y menos costosa para probar el potencial relajante de remedios naturales y compuestos sintéticos.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de epinefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; E4642&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Sceintific de Dulbecco&nbsp;</td><td>17-512Q</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 PRUEBA Laboratorios de</td><td>descontaminación</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-2374</td><td></td></tr><tr><td>Disección pinza de astilla de precisión de punta extrafina</td><td>fisher sceintific</td><td>13-812-42</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de iris finas endurecidas curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>disección microscopio estereoscópico modular de alto rendimiento</td><td>Leica</td><td>MZ6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cámara microscópica digital en color de 5 megapíxeles con sistema de enfriamiento activo</td><td>Leica</td><td>&nbsp; DFC425 C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Stereomaster Fuentes de luz de fibra óptica</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>12-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Barco de pesaje</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td></td><td></td>WB30304</tr><tr><td>Convertidores Astound Bata quirúrgica estándar&nbsp;</td><td>Salud Cardinal &nbsp;</td><td>9515</td><td>Guantes pequeños, medianos o grandes</td></tr><tr><td></td><td>McKesson Corporation</td><td>20-1080</td><td>pequeños, medianos o grandes; guantes quirúrgicos estériles de látex o nitrilo sin polvo</td></tr><tr><td>&nbsp; Placa</td><td>de Petri Corning Falcon</td><td>351029</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>&nbsp; Placa de Petri</td><td>Corning Falcon</td><td>353001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>95% O2- 5% CO2 mezcla de gases</td><td>Praxair</td><td>&nbsp; MM OXCD5-K</td><td></td></tr><tr><td>Mascarillas de gancho para la oreja</td><td>Valumax International</td><td>5430E-PP</td><td></td></tr><tr><td>DSLR 24.2 MP Cámara</td><td>Canon</td><td>EOS Rebel T6i</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>versión 2019 o posterior</td></tr></tbody></table>

método ex vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en matlab para el análisis de datos

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

La dismenorrea, o calambres dolorosos, es el síntoma más común asociado con la menstruación en las mujeres y su gravedad puede obstaculizar la vida cotidiana de las mujeres. Aquí, presentamos un método fácil y barato que sería instrumental para probar nuevos fármacos disminuyendo la contractilidad uterina. Este método utiliza la capacidad única de todo el tracto reproductivo del ratón para exhibir motilidad espontánea cuando se mantiene ex vivo en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. Esta motilidad espontánea se asemeja a la actividad miometrial similar a una onda del útero humano, conocida como ondas endometriales. Para demostrar la eficacia del método, empleamos un conocido medicamento relajante uterino, la epinefrina. Demostramos que la motilidad espontánea de todo el tracto reproductivo del ratón puede ser inhibida de forma rápida y reversible por 1 m de epinefrina en este modelo de plato Petri. Documentar los cambios de la motilidad uterina se puede hacer fácilmente usando un teléfono inteligente ordinario o una sofisticada cámara digital. Desarrollamos un algoritmo basado en MATLAB que permite el seguimiento del movimiento para cuantificar los cambios espontáneos de motilidad uterina midiendo la velocidad de los movimientos del cuerno uterino. Una ventaja importante de este enfoque ex vivo es que el tracto reproductivo permanece intacto durante todo el experimento, preservando todas las interacciones celulares intrauterinas intrínsecas. La principal limitación de este enfoque es que hasta el 10-20% de los úteros puede no presentar motilidad espontánea. Hasta ahora, este es el primer método cuantitativo ex vivo para evaluar la motilidad uterina espontánea en un modelo de plato Petri.

La Figura 1 muestra imágenes representativas tomadas durante todo el procedimiento de aislamiento del tracto reproductivo que se describe en este protocolo. Para evitar contaminar el tampón con piel, lo que disminuiría la calidad del vídeo, humedecimos el cuerpo del ratón con 70% de etanol. El punto de referencia principal para la sección de disección del protocolo es encontrar la vejiga urinaria. El útero y la vagina se ubicarán de forma inferior a la vejiga urinaria.
<p class="jove_con...

Las contracciones uterinas son importantes para el bienestar de las hembras. Sin embargo, el aumento patológicamente de la contractilidad puede resultar en dismenorrea, especialmente en las hembras más jóvenes. Aquí, describimos una preparación ex vivo simple que permite una evaluación rápida de la eficacia de los relajantes musculares lisos que se pueden utilizar para el tratamiento de la dismenorrea.

Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Nuestro protocolo es significativo porque proporciona el primer método cuantitativo ex vivo para evaluar la motilidad espontánea de un útero intacto. Este enfoque novedoso proporciona una alternativa fácil y menos costosa para probar el potencial relajante de remedios naturales en compuestos sintéticos. Una de las principales ventajas de esta técnica es que todas las interacciones celulares intrauterinas permanecen intactas durante todo el experimento.La contrailidad excesiva del útero se asocia con la dismenorrea, para la cual los relajantes uterinos pueden ser útiles para el tratamiento. Este método proporciona una manera fácil de probar nuevos relajantes. Después de confirmar la etapa del ciclo estroso, coloque el ratón en la posición supina y extienda las extremidades para exponer la región pélvica abdominal.Humedezca el abdomen con 70%etanol y use fórceps para levantar cuidadosamente la piel superior al clítoris. Hacer pequeñas incisiones transversales en los aspectos laterales de la zona abdominal inferior hasta las extremidades superiores para exponer el peritoneo. Corte cuidadosamente a través del peritoneo para exponer el tracto gastrointestinal sin dañar los cuernos uterinos, y utilizar fórceps para eliminar la fascia y el tejido adiposo que cubre el tracto gastrointestinal.Retire el duodeno, el yeyuno, el íleon, el cecum y el colon ascendente y transversal. Localice la vejiga urinaria para localizar la vagina que se encuentra directamente debajo de la vejiga urinaria. Localice la sínfisis púbica en la confluencia de los huesos púbicos, caudal a la vejiga, y use tijeras para hacer cuidadosamente una incisión en los lados laterales de la sínfisis púbica a través del tejido fibrocartilaginoso interpúbico para acceder y proporcionar una ruta para la extracción vaginal.Cortar a través del perineo situado entre el ano y la parte inferior de la vulva, y utilizar fórceps para levantar la vagina para permitir una escisión lenta del recto. Identifique los dos cuernos uterinos que se bifurcan en un tenedor rostralmente a la vagina y localice un oviducto y un ovario enrevesados al final de cada cuerno. Identificar correctamente los cuernos uterinos es fundamental para el procedimiento para asegurar que los tejidos no estén dañados.Usa pequeñas tijeras diseccionantes para quitar los ligamentos que se conectan y sostienen los cuernos, los oviductos y los ovarios dentro de la cavidad abdominal, y extirpar la vagina, el útero, los oviductos y los ovarios. Transfiera todo el tracto reproductivo aislado en un plato petri de 100 milímetros que contenga 10 mililitros de PBS de Dulbecco. Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier tejido conectivo y adiposo que rodea los cuernos uterinos y la vagina, así como cualquier pelaje en la región púbica que pueda obstaculizar la calidad de la imagen.Retire el ligamento ancho para permitir la motilidad de los cuernos uterinos y lave el tejido dos veces con PBS fresco de Dulbecco por lavado antes de transferir el tracto reproductivo aislado a un plato Petri de 35 milímetros que contenga tres mililitros de solución de Krebs oxigenado. Para la motilidad espontánea, coloque el plato Petri sobre una superficie negra a temperatura ambiente y espere de 15 a 30 minutos para que comiencen las contracciones espontáneas. Cuando se pueda observar movimiento, registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de video digital.A continuación, transfiera la preparación a un plato de Petri que contenga un tampón Krebs oxigenado complementado con el compuesto de prueba y registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos adicionales de la misma manera. Al final del período de grabación, lave todo el tracto reproductivo en 10 mililitros de PBS de Dulbecco en una placa Petri de 100 milímetros, y transfiera la muestra a un nuevo plato Petri de tampón Krebs recién oxigenado para evaluar la reversibilidad del tratamiento. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos de la misma manera, como en las dos últimas grabaciones.Luego transfiera la preparación a otro plato Petri de 35 milímetros lleno de tampón Krebs oxigenado complementado con el vehículo para el compuesto de prueba para asegurarse de que no hay cambios inducidos mecánicamente en la motilidad uterina espontánea. La preparación del tracto reproductivo exhibió una alta motilidad en los paneles A y C en ausencia de epinefrina. Pero este fenotipo está inactivo en el panel B con la presencia de un micro muller epinefrina.Aquí, se muestra un análisis de datos de muestra de la administración de epinefrina y la recuperación espontánea de motilidad, que ilustra cómo los efectos de la hormona en la motilidad espontánea del tracto reproductivo se pueden cuantificar a partir de las grabaciones del tejido tomado antes, durante y después del tratamiento compuesto de prueba. Es importante evitar comprimir o estirar demasiado los cuernos uterinos de lo contrario no se observará contractilidad espontánea. Nuestro método también se puede utilizar para probar compuestos que pueden aumentar la contractilidad del útero.Este procedimiento se puede aplicar a los ratón embarazadas uteri en las primeras etapas del embarazo. Este experimento tiene el potencial de actualizarse a un formato de placa de seis pozos para el cribado de fármacos de rendimiento.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

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Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos (Video) | JoVE Journal

Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos

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