Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos
1 de septiembre de 2019
Las contracciones uterinas son importantes para el bienestar de las hembras. Sin embargo, el aumento patológicamente de la contractilidad puede resultar en dismenorrea, especialmente en las hembras más jóvenes. Aquí, describimos una preparación ex vivo simple que permite una evaluación rápida de la eficacia de los relajantes musculares lisos que se pueden utilizar para el tratamiento de la dismenorrea.
Nuestro protocolo es significativo porque proporciona el primer método cuantitativo ex vivo para evaluar la motilidad espontánea de un útero intacto. Este enfoque novedoso proporciona una alternativa fácil y menos costosa para probar el potencial relajante de remedios naturales en compuestos sintéticos. Una de las principales ventajas de esta técnica es que todas las interacciones celulares intrauterinas permanecen intactas durante todo el experimento.
La contrailidad excesiva del útero se asocia con la dismenorrea, para la cual los relajantes uterinos pueden ser útiles para el tratamiento. Este método proporciona una manera fácil de probar nuevos relajantes. Después de confirmar la etapa del ciclo estroso, coloque el ratón en la posición supina y extienda las extremidades para exponer la región pélvica abdominal.
Humedezca el abdomen con 70%etanol y use fórceps para levantar cuidadosamente la piel superior al clítoris. Hacer pequeñas incisiones transversales en los aspectos laterales de la zona abdominal inferior hasta las extremidades superiores para exponer el peritoneo. Corte cuidadosamente a través del peritoneo para exponer el tracto gastrointestinal sin dañar los cuernos uterinos, y utilizar fórceps para eliminar la fascia y el tejido adiposo que cubre el tracto gastrointestinal.
Retire el duodeno, el yeyuno, el íleon, el cecum y el colon ascendente y transversal. Localice la vejiga urinaria para localizar la vagina que se encuentra directamente debajo de la vejiga urinaria. Localice la sínfisis púbica en la confluencia de los huesos púbicos, caudal a la vejiga, y use tijeras para hacer cuidadosamente una incisión en los lados laterales de la sínfisis púbica a través del tejido fibrocartilaginoso interpúbico para acceder y proporcionar una ruta para la extracción vaginal.
Cortar a través del perineo situado entre el ano y la parte inferior de la vulva, y utilizar fórceps para levantar la vagina para permitir una escisión lenta del recto. Identifique los dos cuernos uterinos que se bifurcan en un tenedor rostralmente a la vagina y localice un oviducto y un ovario enrevesados al final de cada cuerno. Identificar correctamente los cuernos uterinos es fundamental para el procedimiento para asegurar que los tejidos no estén dañados.
Usa pequeñas tijeras diseccionantes para quitar los ligamentos que se conectan y sostienen los cuernos, los oviductos y los ovarios dentro de la cavidad abdominal, y extirpar la vagina, el útero, los oviductos y los ovarios. Transfiera todo el tracto reproductivo aislado en un plato petri de 100 milímetros que contenga 10 mililitros de PBS de Dulbecco. Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier tejido conectivo y adiposo que rodea los cuernos uterinos y la vagina, así como cualquier pelaje en la región púbica que pueda obstaculizar la calidad de la imagen.
Retire el ligamento ancho para permitir la motilidad de los cuernos uterinos y lave el tejido dos veces con PBS fresco de Dulbecco por lavado antes de transferir el tracto reproductivo aislado a un plato Petri de 35 milímetros que contenga tres mililitros de solución de Krebs oxigenado. Para la motilidad espontánea, coloque el plato Petri sobre una superficie negra a temperatura ambiente y espere de 15 a 30 minutos para que comiencen las contracciones espontáneas. Cuando se pueda observar movimiento, registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de video digital.
A continuación, transfiera la preparación a un plato de Petri que contenga un tampón Krebs oxigenado complementado con el compuesto de prueba y registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos adicionales de la misma manera. Al final del período de grabación, lave todo el tracto reproductivo en 10 mililitros de PBS de Dulbecco en una placa Petri de 100 milímetros, y transfiera la muestra a un nuevo plato Petri de tampón Krebs recién oxigenado para evaluar la reversibilidad del tratamiento. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos de la misma manera, como en las dos últimas grabaciones.
Luego transfiera la preparación a otro plato Petri de 35 milímetros lleno de tampón Krebs oxigenado complementado con el vehículo para el compuesto de prueba para asegurarse de que no hay cambios inducidos mecánicamente en la motilidad uterina espontánea. La preparación del tracto reproductivo exhibió una alta motilidad en los paneles A y C en ausencia de epinefrina. Pero este fenotipo está inactivo en el panel B con la presencia de un micro muller epinefrina.
Aquí, se muestra un análisis de datos de muestra de la administración de epinefrina y la recuperación espontánea de motilidad, que ilustra cómo los efectos de la hormona en la motilidad espontánea del tracto reproductivo se pueden cuantificar a partir de las grabaciones del tejido tomado antes, durante y después del tratamiento compuesto de prueba. Es importante evitar comprimir o estirar demasiado los cuernos uterinos de lo contrario no se observará contractilidad espontánea. Nuestro método también se puede utilizar para probar compuestos que pueden aumentar la contractilidad del útero.
Este procedimiento se puede aplicar a los ratón embarazadas uteri en las primeras etapas del embarazo. Este experimento tiene el potencial de actualizarse a un formato de placa de seis pozos para el cribado de fármacos de rendimiento.
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Descripción general
Este estudio aborda la importancia de las contracciones uterinas, particularmente en relación con la dismenorrea en mujeres jóvenes. Presenta un método novedoso ex vivo para evaluar la motilidad uterina y la eficacia de relajantes del músculo liso, los cuales podrían ofrecer opciones terapéuticas para la dismenorrea.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Contractilidad uterina
- Tratamiento de la dismenorrea
- Técnicas de evaluación ex vivo
Antecedentes
- Un aumento de la contractilidad uterina está relacionado con la dismenorrea.
- Los métodos existentes para evaluar la motilidad uterina tienen limitaciones en su eficacia.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar las técnicas de evaluación para pruebas de relajación más eficientes.
Métodos Utilizados
- Evaluación cuantitativa ex vivo de la motilidad uterina.
- Sistema de modelo en ratón con interacciones uterinas íntegras.
- Uso de equipos de video digital para la grabación de la motilidad.
Resultados Principales
- Establecimiento de un método reproducible para evaluar la motilidad uterina.
- Cuantificación de la motilidad espontánea en respuesta a agentes relajantes.
- Potencial para probar compuestos relajantes y aquellos que potencian la contractilidad.
Conclusiones
- Este estudio presenta un método práctico para evaluar la motilidad uterina y la eficacia relajante.
- Los hallazgos tienen implicaciones para futuras investigaciones sobre tratamientos para la dismenorrea.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método ex vivo permite la evaluación cuantitativa de la motilidad uterina espontánea en un tracto reproductivo de ratón intacto, proporcionando un modelo fisiológicamente relevante para evaluar relajantes uterinos y moduladores de la contractilidad. Al conservar las interacciones celulares intrauterinas intrínsecas, el enfoque facilita la desactivación mecanicista de compuestos dirigidos a la dismenorrea y otros trastornos relacionados con la motilidad uterina. El método ofrece una plataforma escalable y reproducible para la validación temprana de dianas y la identificación de compuestos prometedores en el descubrimiento de fármacos para la salud de la mujer.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas sobre la función del músculo liso uterino mediante la cuantificación de los cambios en la motilidad espontánea.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible ex vivo para reducir riesgos en dianas al conservar la arquitectura tisular nativa y la comunicación celular.
- Valor predictivo: Facilita la selección de compuestos en carteras al generar datos cuantitativos y dependientes de la dosis sobre los efectos de compuestos en la contractilidad uterina.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Listo para ensayo: Genera lecturas estandarizadas de motilidad mediante el seguimiento del movimiento basado en MATLAB, lo que permite un cribado consistente de compuestos.
- Escalabilidad: Compatible con la captura digital de video y adaptable a formatos de mayor rendimiento, como placas de seis pocillos.
- Robustez del ensayo: Mide la inhibición reversible de la motilidad, como se ha demostrado con epinefrina, apoyando la validación del ensayo y la confirmación de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la actividad ondulatoria humana del endometrio, aportando información traslacional sobre la fisiopatología de la dismenorrea.
- Continuidad preclínica: Conecta el descubrimiento con la evaluación preclínica al mantener intactas las interacciones del tracto reproductivo durante todo el experimento.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al cuantificar la modulación de la contractilidad y la reversibilidad de los efectos del compuesto.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, particularmente para compuestos que modulan la motilidad uterina.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la investigación mecanicista de las vías de contractilidad uterina y la interacción con dianas en un contexto de tejido intacto.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en el movimiento que permiten la comparación fiable de los efectos de compuestos sobre la motilidad espontánea.
- Análisis: Emplea algoritmos de seguimiento del movimiento para generar salidas mensurables y reproducibles para el análisis de respuesta a la dosis y cinético.
- Investigación Traductiva: Aporta continuidad con modelos preclínicos al preservar las interacciones fisiológicas del tejido uterino relevantes para la dismenorrea humana.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de ensayo de motilidad reutilizable, aplicable a través de diferentes clases de compuestos y áreas terapéuticas relacionadas con la función del músculo liso.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las respuestas del músculo liso uterino.
- Valor operativo: Proporciona un ensayo ex vivo estandarizado y de bajo costo con requisitos mínimos de equipo (cámara digital, algoritmo MATLAB).
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en candidatos relajantes uterinos antes de realizar estudios in vivo intensivos en recursos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización basada en datos de compuestos según sus perfiles cuantificados de inhibición de la motilidad y reversibilidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección del tracto reproductivo de ratón y en el manejo de tejidos para mantener la viabilidad.
- Depende del mantenimiento del tampón de Krebs oxigenado y de un entorno de imagenología controlado en temperatura para lograr una motilidad constante.
- Necesita la estandarización de los parámetros de grabación de video (ángulo, duración, iluminación) para un análisis fiable del seguimiento del movimiento.
- Requiere la adaptación del algoritmo basado en MATLAB a los distintos patrones de motilidad del cuerno uterino entre cepas o condiciones.
- Se encuentra limitado por la ausencia de motilidad espontánea en un 10-20 % de las muestras, lo que exige un precribado para identificar tejidos con respuesta.
