Name: Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a realizar inactivaciones génicas espacio-temporales en células madre neurales de la médula espinal de axolote mediante electroporación de complejos CAS9-gRNA. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración espinal.

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Agradecemos a la Profesora Elly M. Tanaka por su apoyo continuo y a largo plazo. Este trabajo fue apoyado por una Beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) (317716), Becas de Inicio de Investigación de la Universidad Normal del Sur de China (S82111 y 8S0109), y una Beca de la Fundación de Ciencia postdoctoral de China (2018M633067).

Todos los experimentos con animales deben llevarse a cabo de conformidad con las reglamentaciones locales y nacionales sobre experimentación con animales y con la aprobación de la junta de revisión institucional pertinente.
1. Preparación de la mezcla CAS9-gRNA RNP
<ol><li>Diseñar y sintetizar gRNAs. NOTA: Consulte otras publicaciones para diseñar y sintetizar ARNm, incluida una exclusivamente relativa a axolotls15,20,21,22.</li>
	<li>Obtenga la proteína CAS9-NLS preparándola internamente o comprándola comercialmente.</li>
	<li>Preparar la mezcla CAS9-gRNA mezclando 5 g de proteína CAS9-NLS, 4 g de gRNA, 0,9 l de tampón CAS9 de 10x, y llenar el volumen a 10 ml con H2O sin nucleasa, Aliquot la mezcla y almacenar a -80 oC si no se utiliza inmediatamente.</li>
</ol>2. Preparación de placas de agarosa para electroporación
<ol><li>Preparar 200 ml de solución de agarosa al 2% (wt/vol) en 1x DPBS. Disolver calentando la solución en un microondas y verterla en platos Petri de 10 cm a una profundidad de unos 10 mm (lo suficientemente profundo como para cubrir a todo el animal).</li>
	<li>Deje que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente. Almacene las placas a 4 oC si no se utilizan inmediatamente.</li>
	<li>Usando bisturíes quirúrgicos, corte la placa de agarosa para hacer una hendidura para sostener la cola recta, un pozo para el ajuste en el cuerpo del animal, y dos pozos adicionales para la colocación de los electrodos (Figura1E).</li>
	<li>Coloque el plato sobre hielo y llénelo hasta el borde con hielo frío 1x DPBS. Utilice la misma solución DPBS para fabricar las placas a fin de garantizar una conductividad eléctrica constante en la configuración.</li>
</ol>3. Configuración del electroporator
<ol><li>Configure el electroporator. Configure el pulso de porte para que consista en un pulso bipolar de 70 V, con una duración de 5 ms, intervalo de 50 ms y sin descomposición de tensión. Configure el pulso de transferencia para tener cuatro pulsos bipolares de 40 V, con una duración de 50 ms, intervalo de 999 ms y una decaimiento de voltaje del 10%.</li>
	<li>Conecte los electrodos al electroporator y ajuste las pinzas para que estén separadas por 7 mm. Sumerja los electrodos en un vaso de precipitados de DPBS antes y entre electroporación.</li>
</ol>4. Preparación y carga de capilares de vidrio de microinyección
<ol><li>Realice una prueba de rampa en un tirador de micropipeta en llamas/marrón según las instrucciones del fabricante para determinar el valor de calor.</li>
	<li>Tire de los capilares de inyección con extremos cónicos utilizando los siguientes parámetros: valor de prueba de rampa de calor, valor de rampa, tira de 100, velocidad 100, tiempo a 100.</li>
	<li>Observe la aguja bajo un estereomicroscopio. Usando fórceps finos, romper el capilar en un ángulo para que tenga una punta inclinada. Romper en una posición donde es lo suficientemente delgado como para apuntar al canal central, mientras que es lo suficientemente fuerte como para perforar la piel. NOTA: El punto en el que el diámetro es de aproximadamente 20 m o alrededor del 50% del diámetro de la médula espinal es un buen punto de partida. Es posible que se necesiten varios intentos para obtener una rotura óptima.</li>
	<li>Agregue la solución Fast Green FCF a la mezcla RNP a una proporción de 1:30 y cargue aproximadamente 5 sL de mezcla de inyección en el capilar con una punta de pipeta Microloader.</li>
	<li>Monte el capilar en la bomba neumática, con la punta inclinada hacia abajo.</li>
</ol>5. Configuración de la bomba neumática
<ol><li>Configure la bomba neumática. Establezca la retención en 0,5 libras por pulgada cuadrada (psi), expulse a 2 psi y la duración a gated.</li>
	<li>Pruebe los ajustes capilares y neumáticos de la bomba sumergiendo el capilar en una gota de agua y presionando el pedal para inyectar. Asegúrese de que la mezcla de inyección salga en un flujo lento pero constante.</li>
	<li>Ajuste la presión de retención si la mezcla de inyección comienza a salirse espontáneamente o se aspira agua al capilar. Aumente la presión de eyección o rompa más del capilar si la mezcla de inyección está saliendo demasiado lenta. Disminuya la presión de eyección si la inyección está saliendo demasiado rápido.</li>
</ol>6. Inyección de la mezcla de RNP en la médula espinal
<ol><li>Anestetizar axolotls en 0.03% solución de benzocaína durante al menos 10 min. Compruebe que los animales no son sensibles volteándolos boca abajo en el agua.</li>
	<li>Recoger un animal con fórceps anillo y ponerlo en un lecho de silicio, con el lado izquierdo del animal hacia arriba y la cola apuntando hacia la derecha. Coloque el lugar de inyección en el centro del campo de visión del estereomicroscopio (Figura1A).</li>
	<li>Ajuste el micromanipulador de modo que el capilar entre a 60o desde el lado derecho del campo de visión (Figura1B).</li>
	<li>Identificar la médula espinal y el canal central (Figura1C). NOTA: La médula espinal es la estructura tubular por encima del notochord.</li>
	<li>Apuntando al canal central, mueva el capilar hacia adelante para perforar suavemente la piel y el músculo en el canal central de la médula espinal. Limite el movimiento del capilar a pequeños pasos, ya que la médula espinal está justo debajo de los músculos de la cola.</li>
	<li>Mantenga pulsado el pedal para inyectar la mezcla en el canal central. Observe si la mezcla RNP se extiende a lo largo del canal central como una línea azul en ambas direcciones, lo que muestra que el capilar se ha posicionado correctamente (Figura1D).</li>
	<li>Si esto no ocurre, mantenga pulsado el pedal mientras mueve el capilar ligeramente dentro y fuera hasta que la mezcla RNP comience a entrar. Si el capilar se obstruye por el tejido, elimítelo expulsándolo en el agua a presiones más altas.</li>
	<li>Ajuste la presión de eyección de modo que sea suficiente para hacer que la mezcla RNP se propague en el canal central, pero no tanto como para volar la estructura.</li>
	<li>Continúe manteniendo presionado el pedal para que la mezcla de inyección se extienda aún más a lo largo del canal central, hasta que llegue a la vesícula terminal al final de la médula espinal y los ventrículos en el cerebro. NOTA: Esto puede tardar hasta 2 minutos dependiendo del tamaño del animal. Puede ser necesario aumentar la presión después de algún tiempo para hacer que la mezcla RNP entre en los ventrículos cerebrales.</li>
	<li>Proceda tan pronto como sea posible a la electroporación después de la inyección exitosa.</li>
</ol>7. Electroporación
<ol><li>Transfiera al animal con fórceps de anillo a la placa de electroporación de agarosa preparada (Figura1E)sobre hielo. Coloque la cola dentro de la hendidura para que sea emparedado por agarosa (Figura1F).</li>
	<li>Coloque los electrodos en los pozos a ambos lados de la cola. Asegúrese de que todo el animal y los electrodos estén cubiertos por PBS helado.</li>
	<li>Pulse el interruptor del pie para iniciar la electroporación.</li>
	<li>Una vez completada la electroporación, devuelva al animal al agua.</li>
	<li>Proceda a inyectar más animales si es necesario.</li>
	<li>Compruebe que los animales electroportados estén sanos después de que la anestesia desaparezca y que no haya daños en la cola.</li>
</ol>8. Evaluación de la eficiencia de la eliminación
<ol><li>Fije la cola del animal electroportado. Hacer secciones transversales de la cola seguidas de tinción inmunohistoquímica para evaluar la eficiencia del knock-out a nivel proteico. NOTA: Si se va a realizar una amputación de cola después de la electroporación, la cola cortada podría utilizarse para este propósito. Los animales electroportados con ARNm contra Gfp o tirosinasa, por ejemplo, se pueden utilizar como control negativo4.</li>
	<li>Alternativamente, la médula espinal electroporada podría ser extraída y lysed para el ADN. Realizar pcR de genotipado seguido de secuenciación de Sanger o secuenciación de próxima generación para evaluar el porcentaje de loci genético editado15. NOTA: La eficiencia de edición resultante subestimará la eficiencia de edición real para los SNS, debido a la inclusión de células no electroporadas y neuronas que carecen de contacto apical con el lumen central y por lo tanto no recibirán la mezcla RNP.</li>
</ol>

<ol><li>O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+the+ependyma+during+axolotl+spinal+cord+regeneration%3A+Changes+in+intermediate+filament+and+fibronectin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression.</a> Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).</li>
<li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+Central+Nervous+System+During+Salamander+Tail+Regeneration+from+the+Implanted+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Soil+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres.</a> Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).</li>
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<li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).</li>
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<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Graham, D. B., Root, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources+for+the+design+of+CRISPR+gene+editing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Resources for the design of CRISPR gene editing experiments.</a> Genome Biology. 16 (1), 260(2015).</li>
<li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+husbandry%2C+breeding%2C+metamorphosis%2C+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de intereses.

El protocolo descrito permite el desoparamiento de genes restringidos en el tiempo y el espacio en los SCN en la médula espinal del axolotl. El protocolo actual permite la segmentación específica de los SCN en un momento y una ubicación definidos con alta penetrancia. Evita posibles efectos no deseados que se originan en el knock-out de genes en los SCN en otras regiones como el cerebro que se producen cuando se utiliza el sistema Cre-LoxP. También evita los efectos del desarrollo que se originan en un knock-out persiste...

La médula espinal de la mayoría de los vertebrados es incapaz de regenerarse después de una lesión, lo que conduce a una discapacidad permanente. Varias salamandras, como el axolotl, son notables excepciones. El axolotl puede regenerar completamente una médula espinal estructuralmente idéntica y restaurar completamente la función de la médula espinal. Gran parte de la capacidad regenerativa de la médula espinal axololol se debe a las células ependímicas. Estas células recubren el canal central, y a diferencia de las de los mamíferos, las células axolomales ependílicos permanecen como células madre neurales (NSC) de desarrollo postembrionario. Después de una lesión de la médula espinal (por ejemplo, a partir de una amputación de cola), estos SCN proliferan para regenerar el tubo ependimal y diferenciarse para reemplazar las neuronas perdidas1,2,3. Descubrir cómo los NSC de la médula espinal axolotl siguen siendo pluripotentes y se activan después de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para pacientes humanos.
Debido a los avances en la técnica de eliminación del gen CRISPR-Cas9, la realización de noqueos para descifrar la función génica se ha vuelto más fácil y se ha demostrado que tiene una amplia aplicabilidad en varias especies, incluyendo axolotls4,5, 6 , 7 , 8. La reciente publicación del genoma y transcriptoma completos del axolotl ahora permite atacar cualquier locus genómico y evaluar mejor los efectos fuera del objetivo9,10,11,12 , 13 , 14. Se han desarrollado protocolos optimizados para knock-out y knock-in en axolotls utilizando el sistema CRISPR-Cas915. Se ha demostrado que la entrega de la maquinaria CRISPR-Cas9 en forma de ribonucleoproteína CAS9 proteína-gRNA (RNP) es más eficiente que el uso de Plásmidos con codificación Cas9 y gRNA4. Esto es probablemente debido a que el RNP es más pequeño en tamaño que los vectores plásmidos, su capacidad para crear rupturas de ADN inmediatamente, y la protección del ARNR de la degradación del ARN. Además, el uso de RNPs evita la transcripción y la traducción; por lo tanto, evita cuestiones como la fuerza promotora y el uso óptimo de codón cuando los elementos plásmidos se derivan de una especie diferente.
Los estudios de pérdida de funciones son uno de los enfoques generales para investigar las posibles funciones de los genes de interés. Con el fin de estudiar la función génica durante la regeneración, un knock-out debe realizarse idealmente justo antes de una lesión para evitar efectos en el desarrollo. Además, el knock-out debe limitarse tanto a los NSC como a la región de regeneración. Un nocaut del gen objetivo en todos los SCN (incluidos los del cerebro, que es el caso en los sistemas Cre-LoxP), puede producir efectos no relacionados con la regeneración que pueden confundir la interpretación de los resultados. Afortunadamente, la estructura de la médula espinal axolotl proporciona una oportunidad única para el desaqueo con tiempo y espacio restringido en los NSC. La mayoría de los NSC de la médula espinal están en contacto con el canal central y constituyen la gran mayoría de las células en contacto con el canal central16,17. Por lo tanto, una inyección del complejo CAS9-gRNA en el canal central, seguida de electroporación, permite la administración a los NSC de la médula espinal en una región deseada en un momento específico4,18,19. Este protocolo demuestra cómo se lleva a cabo esto, lo que conduce a un nocaut altamente penetrante en los NSC de la médula espinal objetivo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína 0.03 % (wt/vol)</td><td>Mezclar 500 ml de 10&veces; TBS, 500 ml de Holtfreter' al 400% (peso/vol) S y 30 ml de solución madre de benzocaína al 10% (peso/vol). Llene el volumen a 10 L con dH2O. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína 10 % (peso/vol)</td><td>Mezclar 50 g de benzocaína en 500 ml de etanol al 100 % (vol/vol). La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 12 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato de 1,2 mm de diámetro exterior, 0,94 mm de diámetro interno</td><td>Instrumento de tartamudez&nbsp;</td><td>BF120-94-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td></td><td>tampón Merck</td> 102382 <td></td></tr><tr><td>CAS9, 10x</td><td>Mix 200 mM HEPES y 1,5 M KCl en agua libre de RNasa. Ajusta el pH a 7,5. Filtrar esterilizar, alícuota y almacenar en &menos; 20 &deg; C hasta por 24 meses</td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteína CAS9-NLS&nbsp; &nbsp;</td><td>PNA Bio</td><td>CP03</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, 10cm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinzas finas</td><td>Fine Scientific Instruments</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Nepa Gene&nbsp;</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BEX Generador de Pulsos CUY21EDIT II</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Solución, 5x</td><td>Disuelva 12.5 mg de polvo Fast Green FCF en 10 mL de 1&veces; Pbs.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas aplanadas/marrones&nbsp;</td><td>Instrumento de tartamudez&nbsp;</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Holtfreter' S solución 400% (peso/vol)&nbsp;</td><td>Disolver 11.125 g de MgSO4&middot; 7H2O, 5,36 g de CaCl2&middot; 2H2O, 158,4 g de NaCl y 2,875 g de KCl en 10 L de dH2O. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>Microcargador Puntas de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MN-153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>PicoPump</td><td>neumático World Precision Instruments&nbsp;</td><td>SYS-PV830</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de anillo</td><td>Fine Scientific Instruments</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada Tris, 10x</td><td>Disuelva 24,2 g de base Tris y 90 g de NaCl en 990 ml de dH2O. Ajuste el pH a 8.0 agregando 10 ml de HCl al 37% (vol/vol). La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas con electrodo de placa de platino redondo 2 de espacio variable, 10 mm de diámetro</td><td>Nepa Gene&nbsp;</td><td></td><td></td>CUY650P10</tr></tbody></table>

desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-grna cas9

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

El axolotl tiene la capacidad única de regenerar completamente su médula espinal. Esto se debe en gran parte a las células ependimales que permanecen como células madre neurales (NSC) a lo largo de la vida, que proliferan para reformar el tubo ependimal y diferenciarse en neuronas perdidas después de una lesión de la médula espinal. Descifrar cómo estos NSC retienen la pluripotencia después del desarrollo y proliferan sobre la lesión de la médula espinal para reformar la estructura exacta antes de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre cómo las médulas espinales de los mamíferos pueden regenerarse, así como posibles opciones de tratamiento. La realización de de knock-outs genéticos en subconjuntos específicos de NSC dentro de un período de tiempo restringido permitirá el estudio de los mecanismos moleculares detrás de estos procesos regenerativos, sin ser confundido por efectos perturbadores de desarrollo. Aquí se describe un método para realizar el knock-out genético en los NSC de la médula espinal axolotl utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Al inyectar el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación, los genes diana se eliminan en los NSC dentro de regiones específicas de la médula espinal en el momento deseado, lo que permite estudios moleculares de los SEN de la médula espinal durante Regeneración.

La inyección y electroporación del complejo CAS9-gRNA contra Sox2 en el canal central de la médula espinal axolol condujo a una pérdida masiva de inmunoreactividad SOX2 en la mayoría de los NSC de la médula espinal, con EL RNA contra la tirosinasa (Tyr) como control (Figura 2 A). B3-tubulina (manchado con TUJ1) es un marcador para las neuronas y no se expresó en NSCs, y las células SOX2- TUJ1- que rodeaban el canal central se consideraron células que albergaban elim...

Aquí se presenta un protocolo para realizar el desomo genético con tiempo y espacio restringido en las médulas espinales de axolotl inyectando el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación.

Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Este protocolo permite eliminaciones genéticas rápidas y de alta penetración en células madre neuronales de la médula espinal axolotl para el estudio de los mecanismos moleculares de la regeneración de la médula espinal. Esta técnica permite el estudio de la función génica en las células madre neurales, su regeneración médica sin ser confundido por efectos del desarrollo o efectos de otros tipos de células. Las células madre neurales de Axolotl contribuyen en gran medida a su capacidad para regenerar sus médulas espinales.Comprender los mecanismos de regeneración podría conducir a información para el desarrollo de tratamientos para lesiones de la médula espinal humana. Este método proporciona información sobre cómo las células madre neurales del axolotl montan una respuesta regenerativa a la lesión de la médula espinal. Colocar correctamente el capilar de inyección en la columna central de la médula espinal puede ser un reto y practicar en animales de prueba ayuda con el dominio de la técnica.Ver la administración puede mostrar cómo realizar la inyección y cómo se ve una inyección exitosa. Para preparar la mezcla de proteína ribonuclear de ARN guía Cas9, mezcle cinco microgramos de

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Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que...

Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

Heterotopia nodular periventricular (PNH) es la forma más común de malformación del desarrollo cortical (MCD) en la edad adulta, pero su base genética sigue siendo desconocido en los casos más esporádicos. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para identificar genes candidatos novela de MCDs y confirmar directamente su papel causativo en vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Estudios convencionales de pérdida de función de genes knockout animales han sido a menudo costoso y desperdiciador de tiempo. Basada en la electroporación CRISPR-mediada mutagénesis somática es una poderosa herramienta para entender gen funciona en vivo. Aquí, Divulgamos un método para analizar los fenotipos de nocaut en la proliferación de las células del cerebelo.

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Aquí, describimos un protocolo para introducir un knockout genético en el amastigote extracelular de Trypanosoma cruzi, utilizando el sistema CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento puede ser seguido ya sea por el recuento celular de la cultura axenic amastigote o por la proliferación de amastigotes intracelulares después de la invasión de la célula huésped.

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

Este objetivo de este protocolo es producir axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides derivadas del tejido donante mutado Cas9 utilizando técnicas de injerto de tejido embrionario.

Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario

La electroporación de organoides cerebrales de primates proporciona un enfoque preciso y eficiente para introducir modificaciones genéticas transitorias en diferentes tipos de progenitores y neuronas en un sistema modelo cercano al desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de primates. Esto permite el estudio de los procesos evolutivos y del desarrollo neurológico y también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.

Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética

Este protocolo describe el procedimiento para la edición del genoma en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón utilizando complejos de ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA ensamblados in vitro y administrados por electroporación.

Disrupción génica de alta eficiencia en macrófagos primarios derivados de la médula ósea mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados

La línea celular THP-1 se utiliza ampliamente como modelo para investigar las funciones de los monocitos/macrófagos humanos en diversas áreas de investigación relacionadas con la biología. Este artículo describe un protocolo para la ingeniería eficiente basada en CRISPR-Cas9 y el aislamiento de clones de una sola célula, lo que permite la producción de datos fenotípicos robustos y reproducibles.

Knockout génico mediado por CRISPR-Cas9 basado en electroporación en células THP-1 y aislamiento de clones de una sola célula

Aprende a realizar inactivaciones génicas espacio-temporales en células madre neurales de la médula espinal de axolote mediante electroporación de complejos CAS9-gRNA. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración espinal.

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Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9

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