Name: Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a realizar imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales γδ en el intestino delgado murino mediante microscopía confocal de disco giratorio invertida. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas durante hasta 4 horas para estudiar interacciones inmuno-epiteliales en tiempo real.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Agradecemos a Madeleine Hu por su ayuda en la edición del manuscrito y el suministro de los datos que se muestran en los resultados representativos.

Todos los estudios se llevaron a cabo en una instalación acreditada por la Asociación de Evaluación y Acreditación de Cuidado Animal de Laboratorio (AALAC) de acuerdo con protocolos aprobados por Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.
1. Preparación del ratón
NOTA: El siguiente procedimiento, incluyendo la preparación y cirugía de animales, tomará de 30 a 40 minutos antes de la cirugía, encender el microscopio y calentar la incubadora encerrada en el microscopio a 37 oC.
<ol><li>Realizar experimentos en ratones TcrdEGFP de 8-10 semanas de edad sobre un fondo C57BL/6, que se obtuvieron de Bernard Malissen (INSERM, París, Francia). Según el procedimiento aprobado por la IACUC, anestesiar el ratón mediante la inyección i.p. de ketamina (120 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) en función del peso del animal. Evaluar el nivel de anestesia por frecuencia respiratoria (55–65 respiraciones por minuto)21,pellizco de dedo del pie y reflejo palpebral.</li>
	<li>Una vez alcanzada la anestesia del plano quirúrgico, asegure las patas traseras del ratón usando cinta adhesiva a una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal, que puede ser monitoreada por el termómetro rectal. Si hay signos de que la anestesia se está desgastando (por ejemplo, aumento de la frecuencia de respiración, parpadeo y/o respuesta de espasmo muscular ocular al reflejo palpebral), vuelva a administrar 50 ml de ketamina/xilazina a la vez hasta que el ratón esté completamente sedado.</li>
	<li>Preparar el tinte nuclear diluyendo 50 ml de Hoechst 33342 (10 mg/ml) con 315 ml de salina al 0,9%; la concentración final es de 37,5 mg/kg en función del peso del ratón (200 ml de volumen aproximado). Una vez anestesiado el ratón, inyecte lentamente el Hoechst con una jeringa de tuberculina a través del seno venoso retroorbital. NOTA: Espere de 1 a 2 minutos antes de continuar con el siguiente paso para permitir que el ratón se aclimate al cambio en el volumen circulante después de la inyección retro-orbital.</li>
	<li>Coloque una pequeña cantidad de lubricante sobre los ojos para evitar que se sequen.</li>
</ol>2. Cirugía del ratón: Laparotomía para exponer la mucosa intestinal
<ol><li>Hacer una incisión vertical de 2 cm a través de la piel y el peritoneo a lo largo de la línea media de la parte inferior del abdomen para externalizar la región del intestino a ser imágena.</li>
	<li>Usando fórceps en ángulo, saque cuidadosamente el cecum de la cavidad peritoneal e identifique el área del intestino delgado que se va a tomar imágenes. Tenga cuidado de no desgarrar los vasos sanguíneos mesentéricos durante este proceso. Para minimizar el daño potencial o el sangrado, evita agarrar o pellizcar el intestino con los fórceps.</li>
	<li>Localice una región adecuada del intestino delgado (2-3 cm) para la toma de imágenes que contenga un contenido fecal mínimo. Devuelva cuidadosamente el cecum y el intestino delgado restante a la cavidad peritoneal, dejando el segmento de interés externalizado. NOTA: Evite puncturing el cecum o interrumpir la vasculatura mesentérica durante este paso.</li>
	<li>Coloque dos pares de fórceps a ambos lados del mesenteria subyacente entre los vasos sanguíneos, y frote suavemente las puntas de los fórceps para crear un agujero en la membrana (Figura1)22. Esto permitirá que la aguja pase a través del mesentery al cerrar la cavidad peritoneal debajo del intestino.</li>
	<li>Cierre la incisión mientras mantiene el lazo del intestino externalizado. Usando fórceps en ángulo y una aguja curvada de punto cónico unida a una sutura de 5 cm, penetrar un lado del peritoneo, pasar por el agujero hecho en el paso anterior, y hacia arriba a través del otro lado del revestimiento peritoneal. Coloque una sutura en la parte superior y otra cerca de la parte inferior de la incisión. NOTA: Evite dañar la vasculatura durante este paso.</li>
	<li>Repita este proceso para cerrar la piel debajo del lazo intestinal, colocando una sutura en el centro de la incisión, entre las suturas anteriores en el peritoneo subyacente. NOTA: Es importante sólo externalizar el área que se va a crear una imagen; esto reducirá el movimiento extraño durante la toma de imágenes. Asegúrese de evitar atir las arterias mesentéricas.</li>
	<li>Utilice una electrocauterización para hacer una línea de perforación a lo largo del borde antimestérico. Inmediatamente después de la cauterización, aplicar unas gotas de agua en la superficie del intestino para evitar daños adicionales en el tejido inducido por el calor. Blot con un Kimwipe para eliminar el agua residual.</li>
	<li>Cortar una pequeña hendidura horizontal en el borde distal del tejido cauterizado usando tijeras Vannas y proceder a cortar a lo largo de la longitud de la línea cauterizada hacia el extremo proximal del segmento de tejido externalizado (aproximadamente 1,5 cm de longitud) para exponer la mucosa Superficie. NOTA: Si es necesario, utilice fórceps para eliminar suavemente cualquier exceso de contenido fecal que quede en la superficie de la mucosa expuesta.</li>
	<li>Cubra el abdomen del ratón con un Kimwipe húmedo para evitar que el tejido se deshidrate. Transporte el ratón al microscopio en un recipiente cubierto.</li>
</ol>3. Adquisición de imágenes por microscopía confocal de disco giratorio
<ol><li>Pipetear 150 l de AlexaFluor 633 de 1 m en HBSS en la parte inferior de vidrio de un plato de 35 mm. Coloque el ratón de modo que la superficie mucosa abierta entre directamente en contacto con el cubreobjetos.</li>
	<li>Incline la cabeza del microscopio hacia atrás y coloque el ratón sobre el plato tapado en la etapa de imagen en una incubadora precalentada. Alternativamente, cubra el ratón con una manta calefactora para mantener la temperatura corporal.</li>
	<li>Inicie el software de imágenes. La intensidad de excitación y el tiempo de exposición de cada láser no deben superar los 10-15 mW o 120–150 ms, respectivamente, para evitar el fotoblanqueo y minimizar el intervalo entre puntos de tiempo. Ajuste el promedio del fotograma a "2" y active la función de ganancia EM para reducir el ruido de fondo. Seleccione la calibración de objetivos 63x para garantizar la medición correcta del tamaño de píxel. NOTA: Los ajustes detallados anteriormente están destinados a proporcionar una referencia inicial, pero variarán dependiendo de las configuraciones individuales del microscopio.</li>
	<li>Usando el láser de 405 nm y el objetivo de aire 20x, visualice los núcleos para localizar un campo de vellosidades que carecen de movimiento notable o deriva a la vista. Evite áreas de movimiento artifreal debido a la respiración, la peristalsis o los latidos del corazón.</li>
	<li>Con el escaneo XY, registre la coordenada XY del campo de interés y cambie al objetivo de inmersión en glicerol 63X.</li>
	<li>Confirme que las vellosidades en el campo seleccionado son estables mediante la adquisición de una imagen en vivo en el canal de 405 nm durante un máximo de 1 min.</li>
	<li>Mientras adquiere una imagen en vivo en el canal de 405 nm, ajuste el enfoque para encontrar el plano ortogonal justo debajo de la punta villa. Adquirir pilas Z a partir del epitelio de la punta villosa por las vellosidades hasta que sea difícil resolver los núcleos, alrededor de 15-20 m, usando un paso de 1,5 m. NOTA: Cuando las imágenes con tres canales (405, 488, 640 nm) utilizan los tiempos de exposición descritos anteriormente, es posible adquirir los tres canales secuencialmente a intervalos de aproximadamente 20 s.</li>
	<li>Abra el software en modo de análisis, 3-5 minutos después de comenzar la adquisición, para confirmar la estabilidad de la imagen y la motilidad de IEL. Continúe adquiriendo imágenes durante 30-60 min para cada campo de vellosidades. Registre de 2 a 3 campos para cada ratón. Durante la toma de imágenes, monitoree el ratón cada 5 minutos. NOTA: Si la anestesia comienza a desaparecer, utilice fórceps para estrujera suavemente el cuello del ratón para administrar 50 s de ketamina/xilazina a la vez. Continúe monitoreando los niveles de anestesia y vuelva a administrar los niveles de anestesia cuando sea necesario.</li>
	<li>No es aconsejable crear una imagen de un solo ratón durante más de 4 h. Una vez completada la adquisición de la imagen, sacrificar a los ratones por dislocación cervical seguida de neumotórax bilateral.</li>
</ol>4. Análisis 4D de imágenes
<ol><li>Importe directamente archivos de imágenes al software de renderizado 4D.</li>
	<li>Cree superficies individuales para IEL y lumen y, a continuación, realice un seguimiento de las superficies a lo largo del tiempo utilizando los parámetros descritos en la Tabla 1 como referencia inicial. Para los IEL, habilite Dividir objetos táctiles utilizando el diámetro de punto de semilla indicado.</li>
	<li>Utilice el algoritmo de seguimiento autoregresivo para determinar la motilidad de IEL. Aunque el algoritmo de seguimiento es relativamente preciso, es imperativo inspeccionar visualmente las pistas para cada IEL individual. Si una pista es incorrecta, corríjala con las funciones Desconectar y Conectar en la pestaña Editar pistas.</li>
	<li>Para determinar la distancia de cada IEL al lumen, seleccione la superficie de lumen y realice la función Transformación de distancia en el menú Herramienta. Cuando se le solicite, seleccione Superficie exterior. Una vez calculada, la transformación de distancia se mostrará como el 4o canal.</li>
	<li>Filtre el min de Intensidad del 4o canal para seleccionar los IEL que se encuentran dentro del espacio intercelular lateral (LIS). Este valor debe ser cercano a 15 m, en función de la altura de una célula epitelial columnar. El porcentaje de los IEL totales dentro de este rango se notifica como la frecuencia de los IEL en el LIS.</li>
	<li>Para un análisis posterior, exporte datos estadísticos que incluyen: velocidad de la pista IEL, desplazamiento de la pista, recto de la pista y longitud de la pista. Alternativamente, analice los datos utilizando el módulo Vantage. Dependiendo del experimento, obtenga métricas adicionales de los datos adquiridos, incluido el tiempo de permanencia dentro de las interacciones LIS o IEL/epitelial.</li>
</ol>

<ol><li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).</li>
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<li>Swamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+intraepithelial+lymphocyte+activation+promotes+innate+antiviral+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance.</a> Nature Communications. 6, 7090(2015).</li>
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<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li>
<li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li>
<li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li>
<li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li>
<li>Sandrock, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+reveal+origin%2C+persistence+and+non-redundant+functions+of+IL-17-producing+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).</li>
<li>Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR18+is+required+for+a+normal+CD8alphaalpha+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), (2017).</li>
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<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El desarrollo de técnicas de microscopía intravital ha proporcionado una oportunidad sin precedentes para observar la reorganización de las estructuras subcelulares8,9,22, interacciones célula-célula12, 25 y comportamiento migratorio celular13,14,15,<sup class="xref"...

Los linfocitos intraepiteliales (IEL) se encuentran dentro del epitelio intestinal, y se encuentran tanto a lo largo de la membrana del sótano como entre las células epiteliales adyacentes en el espacio intercelular lateral1. Hay aproximadamente un IEL por cada 5-10 células epiteliales; estos IEL sirven como centinelas para proporcionar vigilancia inmune de la granextensión de la barrera epitelial intestinal 2. Los IEL que expresan el receptor de células T (TCR) comprenden hasta el 60% de la población total de IEL en el intestino delgado murino. Los estudios realizados en ratones con deficiencia de células T demuestran un papel en gran medida protector de estas células en respuesta a lesiones intestinales, inflamación e infección3,4,5. A pesar de la generación del ratón noqueador Tcrd 6, nuestra comprensión de la biología de IEL sigue siendo limitada debido en parte al hecho de que los ligandos reconocidos por el TCR aún no se han identificado7. Como resultado, la falta de herramientas para estudiar esta población celular ha dificultado la investigación del papel de la activación y la función de la TCR en condiciones fisiológicas y patológicas. Para llenar este vacío, hemos desarrollado técnicas de imagen en vivo para visualizar el comportamiento migratorio de IEL y las interacciones con los enterocitos vecinos como un medio para proporcionar información adicional sobre la función y la capacidad de respuesta de IEL a los estímulos externos in vivo.
Durante la última década, la imagen intravital ha ampliado significativamente nuestra comprensión de los eventos moleculares involucrados en múltiples facetas de la biología intestinal, incluyendo el desprendimiento de células epiteliales8, la regulación de la función de barrera epitelial9 ,10, muestreo de células mieloides de contenidos luminales11,12, e interacciones host-microbio11,13,14,15,16 . En el contexto de la biología IEL, el uso de la microscopía intravital ha arrojado luz sobre la dinámica espaciotemporal de la motilidad IEL y los factores que median su comportamiento de vigilancia13,14,15, 16. El desarrollo de los ratones reportero tcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), que etiqueta los IEL por la expresión17de la FPG nuclear, reveló que los IEL son altamente motiles dentro del epitelio y exhiben un comportamiento de vigilancia único que responde a los microbianos infección17,13,14. Recientemente, se desarrolló otro ratón de reportero de células T (Tcrd-GDL) que expresa GFP en el citoplasma para permitir la visualización de toda la celda18. Se ha utilizado una metodología similar para investigar el requisito de receptores específicos de quimiocina, como el receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-18 y -55, sobre la dinámica de la motilidad IEL19,20. En ausencia de un reportero específico de la célula, se utilizaron anticuerpos fluorescentes conjugados contra CD8 para visualizar y rastrear la motilidad de IEL in vivo19,20. Aunque la microscopía de escaneo láser de dos fotones se utiliza comúnmente para imágenes intravitales, el uso de la microscopía láser confocal de disco giratorio proporciona ventajas únicas para capturar imágenes multicanal de alta velocidad y alta resolución con un mínimo ruido de fondo. Esta tecnología es ideal para dilucidar la dinámica espaciotemporal de las interacciones inmunes/epiteliales dentro del complejo microambiente de la mucosa intestinal. Además, mediante el uso de varios modelos de ratón transgénicos y/o knockout, estos estudios pueden proporcionar información sobre la regulación molecular de la función intestinal inmune y/o epitelial.

<table><tbody><tr><td>Plato de 35 mm, n.º 1.5 Cubreobjetos</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Agujas hipodérmicas - 27 g</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringa estéril de punta deslizante - 1 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringa de tuberculina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Electrocauterio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de incubación cerrada</td><td>OKOLAB</td><td></td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>Agujas Oculares, Tamaño #3; 1/2 Círculo, Punta Cónica, 12 mm Longitud de Cuerda</td><td>Roboz</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solución salina equilibrada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (v. 9.2.1) con módulos Start, Track, XT</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>DMi8 Invertido Microscopio Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IQ3 (v. 3.6.3)</td><td>Andor</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Putney</td><td></td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras McPherson-Vannas 3" (7,5 cm) Largo 5 x 0.15 mm Recto Afilado</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica no absorbible, Carrete de seda, Trenzado</td><td>negro Pinzas Fisher Scientific</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>Nugent 4.25" (11 cm) Punta lisa de ángulo largo de 1,2 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Opomada</td><td>Dechra</td><td></td><td>Ungüento lubricante para los ojos</td></tr><tr><td>Disco giratorio Yokogawa CSU-W1 con un objetivo de inmersión de glicerol 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO, cámara iXon Life 888 EMCCD, láser de diodo de 405 nm, láser DPSS de 488 nm, láser de diodo de 640 nm</td><td>Sistema Andor</td><td></td><td>Confocal</td></tr><tr><td>Anestesia</td> <td>Akorn</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Los linfocitos intraepiteliales que expresan el receptor de células T (IEL) desempeñan un papel clave en la vigilancia inmune del epitelio intestinal. Debido en parte a la falta de un ligando definitivo para el receptor de células T, nuestra comprensión de la regulación de la activación de IEL y su función in vivo sigue siendo limitada. Esto requiere el desarrollo de estrategias alternativas para interrogar las vías de señalización implicadas en la regulación de la función IEL y la capacidad de respuesta de estas células al microambiente local. A pesar de que se entiende que los IEL limitan la translocación de patógenos, el uso de imágenes intravitales ha sido fundamental para comprender la dinámica espaciotemporal de las interacciones IEL/epiteliales en estado estacionario y en respuesta a patógenos invasivos. En este documento, presentamos un protocolo para visualizar el comportamiento migratorio de IEL en la pequeña mucosa intestinal de un ratón reportero de células T de GFP utilizando microscopía láser confocal de disco giratorio invertido. Aunque la profundidad máxima de imagen de este enfoque se limita en relación con el uso de microscopía de escaneo láser de dos fotones, la microscopía láser confocal de disco giratorio proporciona la ventaja de la adquisición de imágenes de alta velocidad con fotoblanqueo reducido y Fotodaño. Usando el software de análisis de imágenes 4D, el comportamiento de vigilancia de células T y sus interacciones con las células vecinas se pueden analizar después de la manipulación experimental para proporcionar información adicional sobre la activación y la función de IEL dentro de la mucosa intestinal.

Utilizando imágenes intravitales de ratones reporteros tcrdEGFP, hemos demostrado previamente que los IEL exhiben un comportamiento dinámico de vigilancia, en el que patrullan el epitelio migrando a lo largo de la membrana del sótano y hacia el espacio intercelular lateral (LIS) en constante estado (Figura 2, Película 1).
Este enfoque también se puede utilizar para evaluar cómo la inhibición de las vías de señalización celular específicas y/o los ...

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

La microscopía intravital de la pequeña mucosa intestinal puede proporcionar información sobre la dinámica espaciotemporal de las interacciones celulares dentro del epitelio entre diferentes tipos de células inmunitarias, o entre estos dos compartimentos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la adquisición de imágenes de alta velocidad y alta resolución dentro de la mucosa intestinal en tiempo real. Las imágenes en vivo del intestino pueden proporcionar información adicional sobre las interacciones celulares, o la señalización celular implicada en la inmunidad a la mucosa, la biología epitelial o la biología del cáncer.Este es un método desafiante que requiere la práctica de la técnica quirúrgica, así como la paciencia y el posicionamiento óptimo del ratón para la adquisición de imágenes. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón transgénico anestesiado, expresando una proteína fluorescente verde mejorada, o receptor de células T de EGFP, Gamma-delta, utilice una jeringa de tuberculina para inyectar lentamente 200 microlitros de solución de tinte Hoechst 33342 recién preparada en el seno venoso retro-orbital. De uno a dos minutos después de la inyección, aplicar un ung en los ojos del animal para evitar que se sequen.Luego, haz una incisión vertical de 2CM a través de la piel y el peritoneo, a lo largo de la línea media de la parte inferior del abdomen y usa fórceps en ángulo para sacar cuidadosamente el cecum de la cavidad peritoneal. Identificar un área de 2-3CM del intestino delgado que contiene un contenido mínimo de heces, teniendo cuidado de no romper los vasos sanguíneos mesentéricos, y devolver cuidadosamente el cecum y el intestino delgado restante a la cavidad peritoneal, dejando el segmento de interés externalizado. Colocando dos pares de fórceps a cada lado del mesentería subrayado entre los vasos sanguíneos, frote suavemente las puntas de los fórceps para crear un agujero en la membrana.Usando fórceps angulares y una aguja curva de punta cónica unida a una sutura de 5CM, penetra un lado del peritoneo a través del agujero en la membrana, y hasta el otro lado del revestimiento peritoneal, colocando una sutura en la parte superior, y otra cerca de la parte inferior de la incisión para cerrar la incisión, manteniendo el bucle del intestino externalizado. Para aumentar la probabilidad de éxito, no ate ni rasgue los vasos sanguíneos mientras coloca la sutura abdominal y limite cualquier manejo extraño del intestino. Luego, cierra la piel debajo del lazo intestinal de la misma manera, colocando una sutura en el medio de la incisión entre las suturas anteriores en el peritoneo subrayado.Usando una electrocauterización, haz una línea de perforación a lo largo del borde antimesentérico y aplica inmediatamente unas gotas de agua a la superficie del intestino para evitar daños adicionales en los tejidos inducidos por calor. Blot con un kimwipe para eliminar el agua residual. Utilice tijeras de vanna para cortar una abertura horizontal de aproximadamente 1,5 CM en el borde distal del tejido cauterizado, a lo largo de la longitud de la línea cauterizada, hacia el extremo proximal del segmento de tejido externalizado.Cuando la superficie de la mucosa esté expuesta, cubra el abdomen con un kimwipe húmedo para mantener el tejido hidratado. Para imágenes de microscopía confocal de disco giratorio, transporte el ratón al microscopio en un recipiente cubierto. Inicie el software de imágenes e incline la cabeza del microscopio hacia atrás, y agregue 150 microlitros de 1 pultorio micromolar Alexa Fluor dye y Hank's Buffered Saline Solution en el fondo deslizado de la cubierta de vidrio.Coloque el ratón de modo que la superficie mucosa abierta entre directamente en contacto con el cubreobjetos. Coloque el ratón y el plato en la etapa de imágenes en una incubadora precalentó. Establezca la Intensidad de Excitación y el Tiempo de Exposición para cada láser en no más de 10-15 milivatios y 120-150 milisegundos, respectivamente, y ajuste el Promedio de Fotograma a 2.Active la función Ganancia de multiplicación de electrones para reducir el ruido de fondo y seleccione la calibración de objetivos 63X para garantizar una medición correcta del tamaño de píxel. Usando el láser de 405 nanómetros y el objetivo de aire 20X, visualice manualmente los núcleos para localizar un campo de vellosidades que carecen de movimiento o deriva notables, evitando áreas de movimiento artifactual debido a la respiración, peristalsis o latidos del corazón. Usando el X-Y Scan, registre la coordenada X-Y del campo de interés y cambie al objetivo de inmersión de glicerol 63X.Adquiera una imagen en vivo en el canal de 405 nanómetros durante un máximo de 1 minuto para confirmar que las vellosidades en el campo seleccionado son estables, mientras que ajusta el enfoque para encontrar el plano ortogonal justo debajo de la punta del villus. A continuación, adquiera pilas z, comenzando desde justo debajo del epitelio de punta de villus, alrededor de 15-20 micrómetros hasta el villus hasta que sea difícil resolver los núcleos, utilizando pasos de 1,5 micrómetros. 3-5 minutos después de comenzar la adquisición, confirme la estabilidad de la imagen y la motilidad celular intraepitelial gamma-delta, y continúe adquiriendo imágenes durante 30-60 minutos para cada campo de vellosidades.Los linfocitos intraepiteliales gamma-delta exhiben un comportamiento de vigilancia dinámico, en el que patrullan el epitelio migrando a lo largo de la membrana del sótano y hacia el espacio intercelular lateral en estado de estudio. En estas imágenes representativas, las pistas de color indican las trayectorias migratorias de los linfocitos intraepiteliales gamma-delta individuales en el transcurso de 30 minutos. Aunque la frecuencia de los linfocitos intraepiteliales en el espacio intercelular lateral se incrementó en ratones tratados con anticuerpos beta receptores anti-interleucina-2, más del 30% de estos linfocitos intraepiteliales gamma-delta mostraron un comportamiento inmódico.Este fenotipo en ralentí fue confirmado por una reducción significativa tanto en la velocidad instantánea como en la relación de confinamiento de los linfocitos intraepiteliales Gamma-delta, tras el bloqueo del receptor de interleucina-2, en relación con los controles. Además, los linfocitos intraepiteliales gamma-delta inactivos tenían tiempos de permanencia más largos, y se localizaban con mayor frecuencia dentro del espacio intercelular lateral, en comparación con los linfocitos intraepiteliales gamma-delta móviles. Puede ser difícil identificar campos de vellosidades que carecen de movimiento excesivo debido a la peristalsis.Cambiar la posición del ratón puede ayudar a localizar un campo más estable. Un análisis adicional de los datos de seguimiento celular puede ayudar a identificar el comportamiento específico de la motilidad, o a proporcionar métricas adicionales para medir las interacciones celulares. La imagen intravital y el análisis de la motilidad IEL se han convertido en una lectura estándar de la función IEL, lo que proporciona información sobre cómo la señalización innata inmune regula la función gamma-delta IEL.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una técnica para la realización de microscopía intravital del ganglio linfático inguinal (LN) se describe. Dicha técnica permite en tiempo...

Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

Los recientes avances en microscopía de dos fotones han permitido en tiempo...

Imagen intravital del nodo linfático poplíteo ratón

Este video demuestra la visualización de linfocitos intraepiteliales γδ (IELs) en ratones transgénicos utilizando microscopía confocal. El procedimiento quirúrgico consiste en crear una línea de perforación y hacer una incisión longitudinal para exponer la mucosa intestinal y las vellosidades. Los ratones transgénicos expresan proteínas reporteras exclusivamente en γδ IELs, lo que permite su seguimiento. Las imágenes intravitales capturan el movimiento dinámico de las IAL γδ marcadas con...

Visualización intravital de linfocitos intraepiteliales gamma delta

Mediante el uso de ratones reporteros transgénicos y marcadores fluorescentes inyectables, la microscopía confocal de disco giratorio intravital a largo plazo permite la visualización directa del comportamiento de las células mieloides en el adenoma intestinal en el modelo de cáncer colorrectal ApcMin/+.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica Apc Min / + Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Describimos aquí un modelo de ratón reportero transgénico para visualizar las células productoras de IL-22 dentro de diferentes tejidos de ratón. Este método se puede utilizar para rastrear la ubicación de otras citocinas o proteínas secretaria en el ratón.

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.

Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar las células linfoides innatas tipo 1 de la lámina propia del intestino delgado murino y establecer cocultivos tridimensionales (3D) entre ambos tipos de células para estudiar las interacciones bidireccionales entre las células epiteliales intestinales y las células linfoides innatas tipo 1.

Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

Aquí, presentamos un método para obtener imágenes del intestino tras heridas inducidas por láser. Al exponer el intestino del ratón a un láser multifotónico, la pérdida de una o varias criptas se induce localmente. Al obtener imágenes repetidas del área dañada durante meses, se captura la dinámica en tiempo real de la recuperación intestinal.

Ablación láser y microscopía intravital para estudiar la remodelación intestinal

Aprende a realizar imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales γδ en el intestino delgado murino mediante microscopía confocal de disco giratorio invertida. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas durante hasta 4 horas para estudiar interacciones inmuno-epiteliales en tiempo real.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

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