Name: Reconstitución asistida por detergente de Drosophila Atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende la reconstitución asistida por detergente de Drosophila atlastin en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos mediante FRET. Este método permite estudiar proteínas de fusión de membrana con alta eficiencia de orientación.

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Agradecemos al Dr. Michael Stern y a su laboratorio sus ideas y comentarios sobre proyectos relacionados con atlastin. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales [R01GM101377] y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares [R01NS102676].

1. Purificación de GST-DAtl-His8
<ol><li>
Expresión de proteínas y preparación de lisados
	<ol>
<li>Transforme BL21 (DE3) E. coli con la construcción GST-DAtl-His8 en pGEX4-T32 y seleccione en una placa de ampicilina.</li>
		<li>Seleccione un solo transformador e incubar 5 ml de LB + ampicilina (5 l de 100 mg/ml de ampicilina) en un tubo de cultivo de 14 ml e incubar a 25 oC con agitación a 200 rpm durante 6-8 h. NOTA: Debido a la expresión con fugas, no se recomienda incubar a temperaturas más altas. El crecimiento a 25oC reduce la agregación de proteínas durante este período de crecimiento.</li>
		<li>Inocular 200 ml de LB + ampicilina con 1 ml del cultivo de 5 ml e incubar durante la noche (-15–18 h) a 25oC.</li>
		<li>A la mañana siguiente, cosechar las células por centrifugación (2.000 x g durante 10 min) y resuspender en 5 ml de LB.</li>
		<li>Inocular 4 L de LB + ampicilina y medir OD600 (0.05–0.15). Incubar a 25oC con agitación. NOTA: Reserve algunos medios para que sirvan como espacio en blanco para las mediciones de OD600 antes de agregar bacterias.</li>
		<li>Mida600 OD cada hora hasta que llegue a una OD entre 0,4 y 0,5. En este punto, reduzca la temperatura a 16 oC.</li>
		<li>Inducir con IPTG de 0,2 mM (800 ml de 1 M de stock), 10 min después de que la incubadora alcance los 16 oC. Incubar durante la noche (-15–18 h) a 16oC. NOTA: La temperatura más baja mejora el rendimiento de la proteína funcional al reducir la agregación de atastrotina.</li>
		<li>A la mañana siguiente, cosechar las células centrifugando a 7.500 x g a 4 oC.</li>
		<li>Resuspender las células en 200 mL de A200 (25 mM HEPES (pH 7.4) y 200 mM DeKC).</li>
		<li>Centrifugar las células a 11.000 x g durante 5 min a 4oC.</li>
		<li>Resuspenda el pellet en 40 ml de tampón de rotura (A200 más 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM de imidazol y una tableta de cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA). NOTA: Añadir TX-100 después de la resuspending para evitar la generación de burbujas y espuma.</li>
		<li>Pasar a través de una aguja de 18 G y pasar las células a través de un disruptor de células tres veces a 10.000 psi.</li>
		<li>Centrifugar el extracto a 125.000 x g durante 1 h. NOTA: Opcionalmente, disuelva el pellet 1:2 (w:v) en urea de 8 M y nutate a temperatura ambiente durante la noche. La urea como desnaturalizante disolverá lentamente cualquier proteína peletada insoluble para el análisis SDS-PAGE. Ahorre 1 l para el análisis de manchas SDS-PAGE y Coomassie.</li>
		<li>Filtrar el extracto a través de un filtro de membrana estéril de nitrato de celulosa de 0,45 m para eliminar bacterias y grandes desechos bacterianos. NOTA: Opcionalmente, guarde 1 l para el análisis de manchas SDS PAGE y Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad
	<ol>
<li>Cargue el lisado filtrado en una columna de resina de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) cargada con Ni2+,preequilibrada con tampón de imidazol bajo (A100 más 10% de glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 1% TX-100, 40 mM imidazol) a una velocidad de 1 mL/ a 4oC.</li>
		<li>Lavar la columna con 25 ml de A100 más 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM de imidazol con una tasa de 1 ml/min a 4oC. Eluir la proteína con un gradiente lineal de 30 ml de imidazol de 40 mM a 500 mM, y un lavado final de 5 ml a 500 mM.</li>
		<li>Piscina fracciones pico e incubar durante 1 h a 4 oC con cuentas hinchadas GSH-Agarose, previamente hinchadas en agua y equilibradas en A100 con 10% de glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0.1% Anapoe X-100, y 1 mM EDTA. NOTA: Las perlas GSH-Agarose pueden hincharse en 50 ml de agua el día anterior e incubarse durante la noche a 4oC, o durante 1 h a RT. Para eliminar el agua y el tampón de equilibrio, centrífuga en un rotor de cucharón oscilante a 500 x g durante 1 min sin freno. Aspirar el sobrenadante con una aguja de 26 G.</li>
		<li>Pellet GSH-Agarose perlas centrifugando en un rotor de cucharón oscilante a 500 x g sin freno y retire el sobrenadante de lisado por aspiración con una aguja de 26 G.</li>
		<li>Transfiera las perlas a una columna de poliprep de 10 ml y lave cinco veces con 5 ml de tampón de equilibrio (A100 con 10% de glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0.1% Anapoe X-100, y 1 mM EDTA) centrifugando a 500 x g.
</li>
		<li>Elute la proteína con 1-1,5 ml de tampón de equilibrio complementado con 10 mM de glutatión reducido. Proteína eluted alícuota y congelación de flash en nitrógeno líquido. La proteína se puede almacenar a -80 oC indefinidamente. NOTA: Ajuste el pH del búfer de elución a 7.4.</li>
		<li>Cuantifique la concentración de proteínas mediante el ensayo de proteínas negras de amido9 y evalúe la pureza mediante la tinción SDS-PAGE y Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Reconstitución de Atlastin recombinante en liposomas
<ol><li>Producción de liposomas por método de extrusión 10<ol>
<li>Hacer reservas de mezcla de lípidos en cloroformo (10 mM de lípidos totales). Los lípidos necesarios son 1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosocolina (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-phospho-L-serina (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE), y 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-DPPE). Los liposomas de los acceptores consisten en POPC: DOPS (85:15 molar ratio) y liposomas de donantes de POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 relación molar). NOTA: Mientras que las mezclas de lípidos POPC:DOPS se han utilizado tradicionalmente para ensayos de mezcla de lípidos in vitro, las composiciones alternativas de lípidos pueden adaptarse para diferentes propósitos experimentales. POPC: los liposomas DOPS son muy estables y más difíciles de fusionar, por lo tanto es un sistema muy estricto para la fusión.</li>
		<li>Añadir 1 ci/ml de L--dipalmitoyl-fosfatidilcolina (colina metil-3H) a las mezclas de lípidos con el fin de determinar las concentraciones de lípidos en pasos posteriores por recuento de centelleo líquido. Reservar al menos 8 l de este stock.</li>
		<li>Transfiera la cantidad deseada de mezclas de lípidos a tubos de vidrio de sílex.</li>
		<li>Seque las mezclas de lípidos bajo una corriente suave de gas N2 durante 10 min hasta que no se pueda ver más cloroformo.</li>
		<li>Seque aún más la película lipídica en un desecador aspirando durante 30 min.</li>
		<li>Añadir suficiente A100 acuoso con 10% de glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, y 1 mM EDTA a la película lipídica y devolver la concentración a 10 mM. Resuspende la película lipídica vórtina ligeramente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se recomienda un vórtice que pueda acomodar tubos de vidrio de sílex.</li>
		<li>Congele y descongela los lípidos hidratados en nitrógeno líquido diez veces. Después de congelar en nitrógeno líquido, descongelar los liposomas dejando que la solución se sente a temperatura ambiente durante 30 s, luego transfiera al agua para una descongelación más rápida. Este ciclo de congelación-descongelación minimizará las vesículas multilamellar. PRECAUCION: Los tubos pueden agrietarse si contienen volúmenes superiores a 0,5 ml y si se transfieren directamente a agua de nitrógeno líquido.</li>
		<li>Pasar el lípido a través de filtros de policarbonato con 100 nm tamaño de poro 19 veces utilizando mini extrusor.</li>
		<li>Determinar la concentración total de lípidos de liposomas mediante el recuento de centelleo NOTA: Algunos de los lípidos pueden quedar atrás en tubos de vidrio y en miniextrusor.<ol>
<li>Añadir 4 l de lípidos y liposomas en 3 ml de cóctel de centelleo.</li>
			<li>Mida los recuentos medios por minuto (CPMA) para stock y liposomas. Y calcula la concentración de liposomas con la siguiente fórmula:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ01.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Almacene los liposomas a 4 oC durante un máximo de una semana. No se recomienda un almacenamiento más largo, ya que los liposomas pueden acumularse con el tiempo, disminuyendo la eficiencia de la reconstitución.</li>
	</ol></li>
	<li>Reconstitución por incorporación asistida por detergente en liposomas preformados
	<ol>
<li>Calcule la cantidad de tampón, proteína, liposomas y detergente adicional que se mezclarán:<ol>
<li>Determine el volumen total deseado. Este volumen se compone de tampón A100 con 10% de glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol y 1 mM EDTA. Los volúmenes inferiores a 250 ml no se mezclan bien en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml.</li>
			<li>Calcular el volumen de liposomas necesarios para dar una concentración final de lípidos de aproximadamente 1 mM. Reste el volumen del volumen del búfer.</li>
			<li>Calcular el volumen de proteína necesario para dar la relación molar de proteína a lípido deseada (generalmente 1:400). Disminuya el volumen del búfer en consecuencia.</li>
			<li>Determinar cuánto detergente adicional debe añadirse para saturar los liposomas conel objetivo de obtener una relación eficaz entre detergente y lípidos (R eff) entre 0,64–0,8. Recuerde tener en cuenta el detergente que se añade con la proteína. La (Reff) está <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ02.jpg"> determinada por la ecuación Dtotal es la concentración total de detergente y elagua D es la concentración de detergente monomérico (0,18 mM para TX-100 y Anapoe X-100 en presencia de detergente)4, 11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mezcle las soluciones en un tubo de 0,5 ml en el siguiente orden: tampón, detergente, proteína y liposomas. Añadir los liposomas rápidamente y vórtice inmediatamente durante 5 s para homogeneizar la mezcla.</li>
		<li>Incubar la reacción en un nutator durante 1 h a 4oC.</li>
		<li>Hacer 0,2 g/mL de perla de poliestireno no polar adsorbente "slurry" en agua. NOTA: Hacer que el cordón adsorbente de poliestireno "slurry" durante la incubación de 1 h en el paso 2.2.3.</li>
		<li>Pesar 0,2 g de perlas adsorbentes de poliestireno y transferirlas a un tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Desgasifigas las perlas añadiendo 1 ml de metanol al tubo y mezclar durante 1 min. Las cuentas desgasifadas se hundirán.</li>
		<li>Aspira rinde al metanol y añade agua a las cuentas. Deje que las cuentas se mezclen con agua durante 5 minutos, luego aspire el agua. Repita cuatro veces, luego lleve el cordón adsorbente de poliestireno "slurry" a 1 ml de volumen con agua y una concentración final de 0,2 g/ml. NOTA: Las cuentas aún deben asentarse en la parte inferior del tubo. Si no lo hacen, desgasifique de nuevo. Utilice una aguja de 21 G o superior para aspirar metanol y agua de cuentas.</li>
		<li>Calcular la cantidad de perlas adsorbentes de poliestireno necesarias para absorber todo el detergente de cada muestra. 1 g de perlas adsorbentes de poliestireno absorbe 70 mg de TX-100. Para calcular el volumen de lodos de perlas de poliestireno adsorbentes necesarias para cada reacción, divida el detergente total en la reacción (paso 2.2.1.4) por 70 mg y, a continuación, por la concentración de la suspensión de perlas (0,2 g/ml (paso 2.2.7).</li>
		<li>Transfiera la cantidad calculada de perlas de perlas de poliestireno adsorbente a un tubo de 0,5 ml y aspirar el agua. NOTA: Corte el extremo de una punta de 20-200 l para transferir las perlas, vórtice el tubo justo antes de pipetear para resuspender las cuentas asentadas.</li>
		<li>Añadir las muestras al tubo de 0,5 ml que contiene perlas adsorbentes de poliestireno e incubar la muestra de nuez durante 1 h a 4 oC.</li>
		<li>Repita dos veces dejando atrás cuentas viejas y transfiriendo la muestra a cuentas frescas.</li>
		<li>Añadir la muestra a un cuarto tubo con perlas frescas e incubar durante la noche (15–18 h) a 4oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Por la mañana, retire la muestra de las perlas adsorbentes de poliestireno y los agregados de proteína insoluble sin pellets centrifugando durante 10 min a 16.000 x g a 4 oC.</li>
	<li>Recuperar el sobrenadante y determinar la concentración final de lípidos mediante el recuento de centelleo líquido (ver paso 2.1.9.2). Opcionalmente, la concentración de proteínas puede determinarse mediante el ensayo de proteína negra amido9. NOTA: Para los proteoliposomas de atlastina, se deben realizar ensayos enzimáticos con liposomas frescos. El almacenamiento prolongado a 4 oC o la congelación conduce a una pérdida significativa en la actividad de atlastina.</li>
</ol>3. Ensayos de mezcla de lípidos
<ol><li>Llevar el donante y el aceptador proteoliposomas a una concentración de 0,15 mM cada uno en A100 con 10% glicerol, 2 mM de mercaptoetanol, 1 mM EDTA y 5 mM MgCl2. Cada reacción (50 l) se debe añadir a un pozo en una placa de pozo blanca plana de 96 adecuada para lecturas de fluorescencia. Prepare al menos 4 reacciones, incluyendo un triplicado, y un control negativo sin GTP.</li>
	<li>Coloque la placa en un lector de placas precalentado a 37 oC. Medir la fluorescencia NBD (excitación 460 nm y emisión 535 nm) durante 5 min cada min.</li>
	<li>Inducir la fusión añadiendo 5 mM GTP (5 l de 50 mM GTP).</li>
	<li>Mida la fluorescencia NBD cada minuto durante 1 h.</li>
	<li>Añadir 5 sL de 2,5% p/v n-Dodecíl-D-maltoside para disolver los proteoliposomas y medir la fluorescencia máxima de NBD. Lea la fluorescencia NBD durante 15 min cada minuto.</li>
</ol>4. Flotación liposoma en el degradado discontinuo de Iohexol12
<ol><li>(opcional) Analizar la eficiencia de la reconstitución mediante ensayos de flotación13.</li>
	<li>Preparar un 80% y un 30% w/v iohexol en A100 con 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanol, y 1 mM EDTA. El iohexol no se disuelve fácilmente, por lo que debe prepararse un día antes mediante la nuez durante la noche a 4 oC.</li>
	<li>Mezclar a fondo 150 l de 80% de material de iohexol con 150 éL de muestra de proteoliposomas para llevarlo a un 40% de iohexol. Añadir esto a un tubo ultra-claro de 5 x 41 mm2 evitando burbujas.</li>
	<li>Capa 250 l de 30% de material de iohexol lentamente en la parte superior de la muestra para hacer una capa media. Evita las burbujas y perturba la capa inferior. En la parte superior de la capa media, agregue lentamente 50 ml de A100 con 2 mM de 2-mercaptoetanol y 1 mM edTA.</li>
	<li>Centrifugar el gradiente en un rotor de cucharón oscilante a 220.000 x g durante 4 h a 4oC con aceleración lenta y sin rotura.</li>
	<li>Cosecha las capas del degradado y analiza por tinción SDS-PAGE y Coomassie, la cuantificación se puede realizar por densitometría. La proteína reconstituida debe flotar hasta la capa superior, mientras que los agregados de proteínas y lípidos se sedimentarán en la parte inferior o en la capa media.</li>
</ol>5. Análisis de la orientación de la proteína reconstituida por proteólisis de trombina
NOTA: La construcción de atlastina reportada aquí tiene un sitio de corte de trombina entre el extremo de la etiqueta N-terminal GST y el comienzo de atlastin. La atlastrina en la orientación correcta tendrá este sitio de corte accesible a la proteasa, mientras que la proteína en la orientación incorrecta estará protegida por la bicapa lipídica.
<ol><li>Para el ensayo de orientación de proteoliposoma de atolina, reserve al menos 8 ml de proteoliposomas reconstituidos reconstituidos frescos.</li>
	<li>Añadir 8 s de proteoliposomas y 1 l de 1 U/L de trombina. Incubar a 37oC durante 1 h.</li>
	<li>Quench la proteasa con 1 l de 5 mg/ml de cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA e incubar durante 30 min a 37 oC.</li>
	<li>Analice la muestra por tinción SDS-PAGE y Coomassie. La proporción de proteínas sin levadura y sin levadura puede determinarse por la densitometría.</li>
</ol>

<ol><li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li>
<li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li>
<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li>
<li>Düzgüneş, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li>
<li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion%3A+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li>
<li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li>
<li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li>
<li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive%2C+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li>
<li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large%2C+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li>
<li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+%28prepared+by+reverse-phase+evaporation%29+by+Triton+X-100%2C+octyl+glucoside%2C+and+sodium+cholate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li>
<li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li>
<li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+%CE%B1-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li>
<li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407(2016).</li>
<li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li>
<li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos aquí delinean un método eficiente para purificar, reconstituir y medir la actividad de fusión de atlastina recombinante. Para garantizar altos rendimientos de atlastin funcional se deben considerar algunos pasos críticos. La expresión de atlastina debe realizarse a bajas temperaturas (16oC) para evitar la agregación y se debe apuntar a una concentración final entre 0,4-1,5 mg/ml. La proteína muy diluida no se reconstituirá de forma óptima en una proporción de proteína 1:400 a lípidos. La eficiencia de la reco...

La fusión de membranas es un proceso crítico en muchas reacciones biológicas. En condiciones biológicas, la fusión de membranas no es espontánea y requiere proteínas de fusión especializadas para catalizar tales reacciones1. La fusión de membrana homotípica ER está mediada en animales por la gtamin relacionada con GTPase atlastin2. El papel de Atlastin en la fusión homotípica es fundamental para las uniones de tres vías en ER periférico, que constituye una gran red interconectada de túbulos que se extienden a lo largo de la célula. Las atlastinas tienen una morfología de dominio conservada que consiste en una gran GTPase, un dominio medio de tres helix, un ancla de membrana hidrofóbica y una cola c-terminal citoplasmática corta3. Estudios in vitro con Drosophila atlastin recombinante han demostrado que cuando se reconstituye a liposomas, mantiene sus propiedades fusogénicas. Otras atlastinas, incluidos los homólogos humanos, no han podido recapitular la fusión in vitro. Aquí describimos una metodología para purificar un GST y polihistidina etiquetado sorcombinante Drosophila atlastin, reconstituirlo en liposomas, y decir fusión.
El estudio de la fusión de membrana in vitro presenta un desafío, ya que las proteínas fusogénicas suelen tener un anclaje de membrana. Para estudiarlos, es necesario reconstituirlos en bicapas de lípidos modelo. Las vesículas unilamelares grandes (LUV) son una herramienta útil para estudiar las interacciones con proteínas lipídicas. Presentamos aquí un sistema para hacer LUVs de diferentes composiciones lipídicas para la reconstitución de proteínas y ensayos de fusión. La reconstitución de proteínas integrales en LUVs puede lograrse mediante una variedad de métodos, entrelos que se incluyen la reconstitución orgánica mediada por disolventes, los mecanismos mecánicos o la reconstitución asistida por detergente 4. Aquí presentamos un método para reconstituir Drosophila atlastin en liposomas preformados mediante la eliminación de detergente. Las ventajas de este método de reconstitución incluyen altos rendimientos de reconstitución y la orientación adecuada de la atlastina en la bicapa lipídica. Además, a través de este método, la proteína no se seca ni se expone a disolventes orgánicos, manteniendo así la estructura y la función. Entre sus desventajas, la presencia de detergentes puede no ser ideal para todas las proteínas y los proteoliposomas finales pueden tener algún detergente incorporado en la bicapa lipídica. Se puede utilizar más diálisis para eliminar más detergente. Sin embargo, la diálisis puede tardar mucho tiempo y, por lo tanto, puede conducir a la pérdida de actividad proteica.
La evaluación de la actividad de fusión de atlastin se puede determinar mediante ensayos de mezcla de lípidos como se describió anteriormente2. Aquí, delineamos un método para medir la fusión mediada por atlastina a través de N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) lípidos etiquetados. Este ensayo requiere la fusión de proteoliposomas de donante (etiquetados) y proteoliposomas aceptadores (sin etiquetar). Una liberación de FRET se puede medir durante la reacción como la dilución de un par donante-aceptador de liposomas "etiquetados" a liposomas "sin etiquetar" como resultado de la mezcla de lípidos durante la fusión de membranas (Figura1)5. Si bien este ensayo sirve como un proxy para la fusión de membranas, se limita a distinguir entre la fusión de membrana y la hefusión, un estado en el que sólo se mezclan los foliolos exteriores. Para abordar este problema, una alternativa es el enfriamiento externo del prospecto de NBD por ditonita. Siguiendo la misma metodología que los ensayos de mezcla de lípidos NBD/rhodamine, al poner en temple el prospecto exterior cualquier liberación de NBD FRET por fusión se deba a la mezcla interna de hilos8.
Ensayos de fusión alternativos por dirección de mezcla de contenido acuoso interno de fusión completa sólo5. Ejemplos de esto son ensayos de terbium (Tb)/ácido dipicolinico (DPA) y ensayos de ácido trisulfónico aminonaftaleno (ANTS)/p-xileno bis(piridinium) bromuro (DPX). En los ensayos Tb/DPA, un grupo de liposomas con Tb encapsulado se mezclan y se fusionan con liposomas con DPA encapsulado; tras la fusión, la fluorescencia aumenta mediante la transferencia interna de energía de DPA a Tb dentro del complejo de 3 quelaciones [Tb(DPA)3]3- complejo de quelación6. Por el contrario, para los ensayos ANTS/DPX, la fluorescencia ANTS se aplaca con DPX7. Mientras que estos sistemas abordan la mezcla de contenido interno, se requiere una preparación más profunda de los liposomas para la eliminación de reactivos no encapsulados, así como la interacción no intencional de los fluoróforos.

<table><tbody><tr><td>Columnas de cromatografía de polietileno de 10 mL Biored</td><td></td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 75 mm Tubos de vidrio de sílex</td><td>VWR</td><td>608225-402</td><td></td></tr><tr><td>47 mm de diámetro, 0,45 &mu; m poro whatman filtros de membrana estéril</td><td>whatman</td><td>7141 104</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos placa blanca</td><td>NUNC</td><td>437796</td><td></td></tr><tr><td>Anapoe X-100</td><td>Anatrace</td><td>9002-931-1</td><td></td></tr><tr><td>Disruptor celular</td><td>Avestin</td><td>Avestin Emulsiflex C3</td><td></td></tr><tr><td>DOPS (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sodio)Avanti</td><td></td> <td>840035P-10mg</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Research organics inc.</td><td>6381-92-6 Cóctel de</td> inhibidores de proteasa sin EDTA de <td>ácido etilendiaminotetraacético</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Extrusora completa de inhibidores de proteasa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z373400&nbsp;</td><td>Extrusora básica Liposofast</td></tr><tr><td>Sistema de cromatografía líquida GE Akta Prime</td><td>GE Pharmacia</td><td>8149-30-0006</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de glutatión agarosa</td><td>Sigma aldrich</td><td>G4510-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>EMD</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>36051-31-7</td><td>Guanosina 5' trifosfato sodio sal hidrato</td></tr><tr><td>HEPES, sin ácido</td><td>Omnipur</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>fluka</td><td>5670</td><td></td></tr><tr><td>Columna de resina de cromatografía de afinidad de metales inmovilizada (IMAC)</td><td>GE Healthcare</td><td>17040801</td><td>1 mL HiTrap Quelante HP columnas de cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas</td></tr><tr><td>Iohexol</td><td>Corporación química y científica precisa</td><td>AN 7050 BLK</td><td>Accudenz/Nycodenz</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Research products international corp.</td><td>I56000-100.0</td><td>IPTG,</td></tr><tr><td>L-Glutatión sin</td> dioxano reducido <td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5g</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Omnisolv</td><td>MX0488-1</td><td></td></tr><tr><td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio))</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>NBD-DPPE</td></tr><tr><td>n-Dodecil &beta;-D-maltósido</td><td>Chem-Impex International</td><td>21950</td><td></td></tr><tr><td>Perlas adsorbentes de poliestireno no polar</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td>SM2 Biobeads</td></tr><tr><td>Policarbonato de grabado de nucleporos 19 mm 0,1 &mu; membrana de poros</td><td>m Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Optima LE80K Ultra centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilcolina, L-&alfa;-dipalmitoil [colina-metil-3H]</td><td>ARC</td><td>ART0284</td><td>Lípidos titulados lector de</td></tr><tr><td>placas</td><td>TECAN TECAN</td><td>infinite M200</td> lector <td></td></tr><tr><td>de placas POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td>POPC</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>MP</td><td>151944</td><td></td></tr><tr><td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lisamina rodamina B sulfonilo) (sal de amonio))</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>Rh-DPPE</td></tr><tr><td>Cóctel de centelleo</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-272</td><td>Ecoscint XR Solución de centelleo para muestras acuosas o no acuosas</td></tr><tr><td>Centelleo </td><td>viales Beckman</td><td>592928</td><td>Tapón de giro rápido Mini Poly-Q Vial</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>T1063-1kU</td><td>Trombina de plasma humano</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultratransparentes 5 mm x 41 mm</td><td>Beckman</td><td>344090</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice de 9 a 13 mm Soporte de tubo</td><td>VWR</td><td>58816-138</td><td>Inserto para tubos</td></tr> <tr><td>de vidrio de sílex en vórticeRetenedor de inserto de vórtice</td><td>VWR</td><td>58816-132</td><td>Retenedor necesario para el soporte del tubo de vórtice</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>2.235074</td><td>Vortex Genie 2 modelo G560</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol grado de biología molecular</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitución asistida por detergente de drosophila atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

La fusión de membranas es un proceso crucial en la célula eucariota. Las proteínas especializadas son necesarias para catalizar la fusión. Las atlastinas son proteínas residentes de retículo endoplasmático (ER) implicadas en la fusión homotípica del ER. Aquí detallamos un método para purificar una glutatión S-transferasa (GST) y poli-histidina etiquetada Drosophila atlastin por dos rondas de cromatografía de afinidad. El estudio in vitro de las reacciones de fusión requiere que las proteínas de fusión purificadas se inserten en una bicapa lipídica. Los liposomas son membranas modelo ideales, ya que la composición y el tamaño de los lípidos pueden ajustarse. Con este fin, describimos un método de reconstitución mediante la eliminación de detergente para Drosophila atlastin en liposomas preformados. Si bien hay varios métodos de reconstitución disponibles, la reconstitución mediante eliminación de detergente tiene varias ventajas que lo hacen adecuado para atlastinas y otras proteínas similares. La ventaja de este método incluye un alto rendimiento de reconstitución y una orientación correcta de la proteína reconstituida. Este método se puede extender a otras proteínas de membrana y para otras aplicaciones que requieren proteoliposomas. Además, describimos un ensayo de mezcla de lípidos basado en FRET de proteoliposomas utilizados como medida de la fusión de membranas.

La eficacia de la reconstitución de atlastin alastinas se presenta en la Figura2. Los proteoliposomas reconstituidos flotaron en un gradiente discontinuo de iohexol. La proteína no incorporada se sedimentó en la capa inferior (B) o en la capa media (M). La proteína reconstituida flotaría hasta la capa superior (T). Las muestras del gradiente fueron cosechadas y analizadas por tinción SDS-PAGE y Coomassie. La cuantificación del gel por densitometría muestra una eficiencia muy alta de reconsti...

La fusión de membranabiológica es catalizada por proteínas de fusión especializadas. La medición de las propiedades fusogénicas de las proteínas se puede lograr mediante ensayos de mezcla de lípidos. Presentamos un método para purificar la Drosophila atlastin recombinante, una proteína que media la fusión homotípica de la sala de urgencias, reconstituyéndola a liposomas preformados, y probando la capacidad de fusión.

Reconstitución asistida por detergente de Drosophila Atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

El protocolo de reconstitución y fusión detallado aquí es una manera eficiente de estudiar las proteínas unidas a la membrana en un modelo de bicapo lipídica y mezcla de lípidos por proteínas de fusión. Aquí describimos una reconstitución asistida por detergente de Drosophila atlastin recombinante, una proteína de fusión de ER, en liposomas de fosfatidilcolina preformados. La fusión de los proteoliposomas de atlastina se mide mediante un ensayo de mezcla de lípidos basado en FRET.Una de las principales ventajas de la reconstitución asistida por detergente es que la proteína del detergente no está expuesta al secado ni a los disolventes. También mostramos aquí que la orientación de la reconstitución de la atlastina es muy eficiente. Otra ventaja del ensayo de mezcla de lípidos basado en FRET es que los liposomas no necesitan ser cargados con ningún tinte, y no hay necesidad de ningún paso de dialios adicionales.Para comenzar este procedimiento, prepare las existencias de mezcla de lípidos en cloroformo, como se describe en el protocolo de texto. Añadir una microcurie por mililitro de DPPC a las mezclas de lípidos, asegurándose de reservar al menos ocho microlitros de este stock. Transfiera la cantidad deseada de las mezclas de lípidos en tubos de vidrio de sílex.Luego seque las mezclas de lípidos bajo una corriente suave de gas nitrógeno durante aproximadamente 10 minutos hasta que no se visible más cloroformo. Seque aún más la película lipídica resultante en un desecador aspirando durante 30 minutos. Después de esto, añadir suficiente A100 con 10%glicerol, dos mililitrolares 2-mercaptoetanol, y un EDTA milimolar a la película lipídica para llevar la concentración de nuevo a 10 milimolar.Resuspender la película de lípidos por vórtices ligeramente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Congela los lípidos hidratados en nitrógeno líquido. Para descongelar los liposomas, deje que la solución se siente a temperatura ambiente durante 30 segundos, luego transfiéralas de nuevo al agua para una descongelación más rápida.Repita este ciclo de congelación y descongelación un total de 10 veces. Después de esto, utilice un mini-extrusor para pasar los lípidos a través de filtros de policarbonato, con un tamaño de poro de 100 nanómetros, 19 veces. Para determinar la concentración total de lípidos de los liposomas, añadir cuatro microlitros de lípido y lisosomas a tres mililitros de cóctel de centelleo.Mida el promedio de recuentos por minuto para stock y liposomas, y calcule la concentración de liposomas, como se describe en el protocolo de texto. Almacene los liposomas a cuatro grados centígrados durante una semana. En primer lugar, mezcle la cantidad adecuada de tampón, detergente adicional y proteína en un tubo de 0,5 mililitros, como se describe en el protocolo de texto.Añadir rápidamente los liposomas, e inmediatamente vórtice durante cinco segundos para homogeneizar la mezcla. Incubar la reacción en un nutator a cuatro grados centígrados durante una hora. Durante esta incubación, pesar 0,2 gramos de perlas adsorbentes de poliestireno y transferirlos a un tubo de microcentrífuga.Agregue un mililitro de metanol al tubo y mezcle durante un minuto para desgasar las cuentas. Luego, aspirar el metanol con una aguja de calibre 21 o superior. Para comenzar a lavar las cuentas, agrégueles agua.Deje que las cuentas se mezclen con el agua durante cinco minutos, luego aspire el agua. Repita este proceso de lavado de agua cuatro veces. Después de esto, añadir agua para llevar la loda de perlas adsorbentes de poliestireno a un volumen de un mililitro, con una concentración final de 0,2 gramos por mililitro.Calcular la cantidad de perlas adsorbentes de poliestireno necesarias para absorber todo el detergente de cada muestra, como se describe en el protocolo de texto. Cortar una punta de pipeta para recoger la suspensión de cuentas. Transfiera la cantidad calculada de lodo de cordón a un tubo de 0,5 mililitros y aspire el agua.Agregue las muestras al tubo que contiene las perlas e incubar en un nutator a cuatro grados centígrados durante una hora. Transfiera las muestras a un tubo fresco que contenga nuevas cuentas, asegurándose de dejar las cuentas viejas detrás. Incubar de nuevo utilizando las mismas condiciones.Repita este proceso de transferencia e incubación de las perlas dos veces. Después de esto, transfiera la muestra a un nuevo tubo que contenga cuentas frescas e incubar por la noche a la mañana a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la muestra de las perlas y la centrífuga a 16.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar los agregados de proteína insoluble.Recuperar el sobrenadante, y determinar la concentración final de lípidos por conteo de centelleo líquido, como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar, lleve los proteoliposomas donantes y aceptadores a una concentración de 0,15 mililitros cada uno en A100 que contenga glicerol, beta-mercaptoetanol, EDTA y cloruro de magnesio. Transfiera cada reacción a un pozo en una placa plana de 96 pozos adecuada para la lectura de fluorescencia, asegurándose de preparar al menos cuatro reacciones, incluyendo un triplicado y un control negativo sin IGCP.Coloque la placa en un lector de placas precalentado a 37 grados Centígrados. Mida la fluorescencia NBD cada minuto durante cinco minutos. A continuación, agregue gtP de cinco milímetros para inducir la fusión.Mida la fluorescencia NBD cada minuto durante una hora utilizando la misma excitación y emisión que antes. Después de esto, añadir cinco microlitros de 2.5%n-Dodecyl beta-D-maltosido a los pozos para disolver los proteoliposomas, y medir la fluorescencia máxima NBD cada minuto durante 15 minutos utilizando la misma excitación y emisión. En este estudio, drosophila atlastin recombinante se purifica y reconstituye en liposomas preformados.La eficiencia de la reconstitución de la atlastina se determina mediante proteoliposomas reconstituidos flotantes en un gradiente discontinuo de iohexol. Las muestras de las capas de gradiente superior, medio e inferior se cosechan y analizan mediante la tinción SDS-PAGE y Coomassie. La cuantificación del gel por densitometría muestra una eficiencia muy alta de reconstitución con pérdidas insignificantes, con el 96% de la proteína total que se encuentra como proteoliposomas que flotaban en la capa superior.Menos del 1% de la proteína no se puede reconstituirse y se encuentra en la capa media, y sólo el 3% no se ha reconstituido ni se agrega y se sedimenta en la capa inferior. La orientación de la atlastina después de la reconstitución se cuantifica mediante ensayos de escote de trombina. Las muestras se analizan con tinción SDS-PAGE y Coomassie y se cuantifican por densitometría.La mayor parte de la proteína reconstituida se corta, con sólo el 7% protegido de la proteasa. La cinética y la extensión de la fusión proteoliposoma mediada por atlastina se analizan mediante ensayos de mezcla de lípidos. Se realiza una incubación de cinco minutos antes de inducir la fusión con GTP en el punto de tiempo cero.Después de una hora, n-Dodecyl beta-D-maltoside fue añadido para solubilizar los proteoliposomas y obtener la máxima liberación de transferencia de resonancia fluorescente. El máximo de fusión en la carrera se considera que es 11% de la fluorescencia máxima. Los lípidos se disuelven en cloroformo.Al preparar las mezclas de lípidos, asegúrese de hacer esto rápidamente, en una capucha química y en hielo para evitar cualquier evaporación. Es posible analizar los proteoliposomas de atlastina por microscopía para visualizar los efectos de un ancla de membrana en la forma y el tamaño del liposoma. Este método se ha ampliado para estudiar otras proteínas ancladas a la membrana y cómo se comportan en una bicacapa de lípidos modelo.Este protocolo utiliza lípidos valorados para cuantificar las mezclas de lípidos. Asegúrese de tomar las precauciones necesarias al trabajar con materiales radiactivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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