Name: Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprende a establecer modelos de xenoinjerto derivados del paciente y líneas celulares primarias de cáncer gástrico. Este método utiliza ratones NSG para preservar la heterogeneidad tumoral y mejorar la evaluación preclínica de terapias.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81572392); el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (2016YFC1201704); Consejo científico y técnico innovador jóvenes talentos del Programa de Apoyo Especial de Guangdong (2016TQ03R614).
Agradecemos específicamente a Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. por su ayuda en la preparación de las cifras.

Este estudio humano fue aprobado por la Junta de Revisión de la Etica Institucional del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen (SYSUCC, Guangzhou, China). El estudio en animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Sun Yat-sen. Nota: todos los experimentos se realizaron de conformidad con las leyes y directrices institucionales pertinentes, incluida la Orientación para la protección de la exposición ocupacional contra patógenos transmitidos por la sangre.
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Obtener los tejidos del cáncer gástrico (paso 0 de P0) directamente de la operación. La muestra tumoral debe ser mayor de 0,5 cm3.</li>
	<li>Preparar 3-4 ml de solución en stock: por ejemplo, RPMI-1640 medio (1x) complementado con suero bovino fetal 10% (FBS), 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina.</li>
	<li>Poner la muestra de tumor fresco en la solución de stock a 4 oC durante no más de 4 horas.</li>
</ol>2. Establecimiento del modelo PDX (Figura 1)
<ol><li>Para asegurar un área quirúrgica estéril, desinfecte todos los materiales con luz ultravioleta durante más de 30 minutos antes de transferirlos al laboratorio animal. Nota: la sala de operaciones debe ser desinfectada con luz ultravioleta durante 30 minutos, antes de limpiar el escritorio con desinfectante de suppositoria de ácido isocyanúrico dicloro. A continuación, se utiliza povidona-yodo para desinfectar la piel.</li>
	<li>Usando fórceps y tijeras, disecciona cuidadosamente los tejidos tumorales y recorta en varios trozos pequeños (aproximadamente 1 mm3 cubos) en condiciones estériles.</li>
	<li>Anestetizar hembras de 5 a 7 semanas de edad NOD-SCID-IL2rg (NSG) ratones por exposición a 1-1.5% isoflurano con una máquina de anestesia.<ol>
<li>Anestetiza el ratón hasta que deje de luchar pero mantiene la respiración uniforme. NOTA: El tubo de 50 ml es un equipo simple que funciona de forma similar a una máquina de anestesia. El uso de pomada veterinaria para evitar la sequedad es innecesario debido al corto tiempo de funcionamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haga una incisión de 1 cm en ambos flancos dorsales usando tijeras estériles e implante una pieza tumoral en cada flanco del ratón.<ol>
<li>Para asegurarse de que la pieza tumoral no se deslice, utilice fórceps estériles para interrumpir el tejido subcutáneo. Luego, corta un pedazo del tejido tumoral y colócalo en el sitio profundo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cierre el área del implante por sutura subcutánea con agujas de sutura quirúrgicas y marque las orejas del ratón con etiquetas de oído etiquetadas</li>
	<li>Esterilice la herida con yodo.</li>
	<li>Coloque suavemente los ratones en una jaula vacía después de la cirugía mientras mantiene la recumbencia esternal. Prestar mucha atención a la condición de los ratones; se despiertan y comienzan a caminar aproximadamente 3-4 minutos más tarde. Coloque ratones que se sometieron a cirugía en otra jaula nueva separada de aquellos que no fueron sometidos a cirugía.</li>
	<li>Evaluar el tamaño del tumor por palpación del sitio de implantación. Mida los tumores con una pinza Vernier dos veces por semana.</li>
	<li>Una vez que el tumor alcanza los 10 mm de diámetro, la condición animal empeora, o el tumor ulcera, eutanasia el ratón con un método aprobado por la IRB. Reimplant extraje fragmentos de tumores frescos en 2 nuevos ratones para el paso, o almacenó temporalmente los especímenes en PBS en hielo para el aislamiento de las líneas celulares primarias.</li>
</ol>3. Criopreservación de tejidos
NOTA: Esta parte hace referencia principalmente a los métodos para el kit Cryo de Live Tissue Kit. Los principales kits y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.
<ol><li>Eutanasia a los ratones con un método aprobado por el IRB cuando el tumor sea superior a 10 mm de diámetro.</li>
	<li>Usando fórceps y tijeras estériles, aísle lentamente el tumor de los ratones.</li>
	<li>Lave los tejidos tumorales con DPBS en un plato de 10 cm. Diseccionar y eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos de sangre y tejido conectivo con fórceps y tijeras.</li>
	<li>Cortar los tejidos tumorales a un espesor máximo de 1 mm con un molde.</li>
	<li>Lave las rodajas con DPBS en un plato de 10 cm. NOTA: El proceso de vitrificación implica el uso de tubos etiquetados V1/V2/V3 en los pasos 3.6-3.8. Los ingredientes principales son DMSO y sacarosa.</li>
	<li>Transfiera las rodajas en el tubo V1 con fórceps, e incubar el tubo a 4 oC durante 4 minutos.</li>
	<li>Vierta la solución V1 y las rodajas en un plato de 10 cm. Transfiera las rodajas en el tubo V2 con fórceps, e incubar el tubo V2 a 4 oC durante 4 minutos. Rodar e invertir el tubo brevemente, y colóquelo a 4 oC durante otros 4 minutos.</li>
	<li>Vierta la solución V2 y las rodajas en un plato de 10 cm. Transfiera las rodajas en el tubo V3 con fórceps, e incubar el tubo a 4 oC durante 5 minutos. Rodar e invertir el tubo brevemente, y colocarlo a 4 oC durante al menos 5 minutos. Asegúrese de que las rodajas se hundan en la parte inferior del tubo.<ol>
<li>Si varias rodajas permanecen flotantes, rodar e invertir el tubo brevemente, y colocar el tubo a 4 oC de nuevo hasta que todas las rodajas se hundan por completo; si es necesario, deseche las rebanadas flotantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vierta la solución V3 y las rodajas en un plato de 10 cm.</li>
	<li>Corte los soportes de tejido a la longitud adecuada y colóquelos en una gasa estéril. Transfiera las rodajas a los soportes. Envuelva los soportes con la gasa, y colóquelos en nitrógeno líquido usando fórceps, seguido de incubación durante 5 min.</li>
	<li>Etiquete los viales criogénicos con la información del tejido.</li>
	<li>Transfiera los soportes con rodajas de tejido en viales criogénicos, que se almacenan en nitrógeno líquido.</li>
</ol>4. Aislamiento de celdas primarias (Figura 2)
<ol><li>Esterilice fórceps y tijeras con vapor de alta presión a 121 oC durante 30 min.</li>
	<li>Reseque las muestras de cáncer gástrico de especímenes resecados o tejidos PDX cosechados. Coloque los tejidos sobre hielo y, a continuación, transfiera los tejidos a un plato de cultivo estéril de 10 cm.</li>
	<li>Diseccionar y eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos de sangre y tejido conectivo con fórceps y tijeras.</li>
	<li>Lave los tejidos tumorales una vez con DPBS que contenga 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina en un plato de 10 cm.</li>
	<li>Cortar el tejido tumoral en 1 mm3 trozos en la tapa del plato; el espesor máximo de cada pieza debe ser de 1 mm.</li>
	<li>Transfiera los tejidos a un tubo centrífugo de 50 ml con aproximadamente 7 ml de colágeno tipo 1 y solución de tripasina (1:14). Vórtice brevemente la mezcla.</li>
	<li>Incubar el tubo en un baño de agua a 37 oC durante 30-40 min. Vórtice la mezcla cada 5 min.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de medio RPMI-1640 (1x) complementado con 10% FBS al tubo. Vórtice bien la mezcla.</li>
	<li>Transfiera la mezcla a un nuevo tubo centrífugo de 50 ml mediante una filtración lenta a través de un filtro de 40 m. NOTA: Utilice filtros de 40 m para garantizar una mayor proporción de células cancerosas. Si es necesario, se pueden utilizar filtros de 100 m para preservar más tipos de células, como las células inmunológicas.</li>
	<li>Centrifugar los filtrados a 113-163 x g durante 5-7 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Lave el pellet con 5 ml de PBS y retire cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Si el pellet es rojo, contiene muchos eritrocitos. Resuspenda suavemente el gránulo con 500 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Después de una incubación de 5 minutos, agregue 5 ml de PBS y retire cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda el pellet con medio de cultivo, y transfiera la mezcla a un plato estéril de 10 cm.</li>
	<li>Sustituya el medio por un medio que contenga suero cada 2-3 días.</li>
	<li>Pasar las células primarias usando trippsina/EDTA cuando alcancen el 50% de confluencia.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Ca-a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El cáncer gástrico es una enfermedad agresiva con opciones terapéuticas limitadas; así, los modelos de cáncer gástrico se han convertido enun recurso crítico para permitir estudios de investigación funcional con traducción directa a la clínica 4,8,17. Aquí, hemos descrito los métodos y protocolos para establecer modelos de PDX de cáncer gástrico y líneas celulares primarias. Es importante destacar que las características morfoló...

El cáncer gástrico es el quinto cáncer más común en todo el mundo y la tercera causa de muerte por cáncer. En 2018, más de 1.000.000 nuevos casos de cáncer gástrico fueron diagnosticados en todo el mundo, y se estima que 783.000 personas murieron por esta enfermedad1. La incidencia y mortalidad del cáncer gástrico sigue siendo muy alta en los países del noreste de Asia2,3. A pesar de los progresos significativos en el campo de las terapias oncológicas, el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico avanzado sigue siendo deficiente, con una tasa de supervivencia de cinco años de aproximadamente 25%4,5,6, 7,. Por lo tanto, es urgente el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer gástrico
El tratamiento del cáncer gástrico es desafiante debido a su alta heterogeneidad8,9. Por lo tanto, la cuestión de cómo abordar los desafíos de la heterogeneidad tumoral para realizar la medicina de precisión es fundamental para la investigación del cáncer. Los modelos in vitro e in vivo desempeñan un papel crucial para dilucidar los mecanismos heterogéneos y la biología del cáncer gástrico. Sin embargo, aunque hay numerosas líneas celulares de cáncer gástrico y muchos modelos de ratón transgénicos convencionales para la investigación preclínica, las desventajas de estos modelos limitan sus aplicaciones10. Debido a que las características de estos modelos han cambiado en el cultivo, ya no modelan la heterogeneidad tumoral, y sus respuestas no han sido capaces de predecir respuestas en humanos11. Estos problemas limitan severamente la posibilidad de identificar subgrupos de pacientes con cáncer que responderán a los medicamentos dirigidos. El cultivo a corto plazo de tumores primarios proporciona una manera relativamente rápida y personalizada de investigar las propiedades farmacológicas anticancerígenas, que probablemente será el sello distintivo del tratamiento personalizado contra el cáncer.
Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) se prefieren como modelo preclínico alternativo para la elaboración de perfiles de respuesta a fármacos12. Además, los modelos PDX ofrecen una poderosa herramienta para estudiar la iniciación y progresión del cáncer13,14. Los modelos PDX preservan la apariencia histológica de las células cancerosas, conservan la heterogeneidad intratumoral y reflejan mejor los componentes humanos relevantes del microambiente tumoral15,16. Sin embargo, la limitación de los modelos PDX ampliamente utilizados es la baja tasa de éxito para establecer y propagar tumores sólidos humanos en serie. En este estudio, se describen métodos decentemente exitosos para establecer modelos PDX y líneas celulares primarias.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m Filtro de células</td><td>Biologix, Shandong, China</td><td>15-1040</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio biológico</td><td>OLYMPUS, Tokio, Japón</td><td>Centrífuga OLYMPUS CKX41</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Mittelsachsen, Alemania.</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, EE. UU.</td><td>HERACELL 150i</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Basalmedia Technology, Shanghái, China</td><td>L40601</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de agua electrotermostático</td><td>Yiheng, Shanghái, China</td><td>DK-8AXX</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Wisent Biotechnology, Vancouver, Canadá</td><td>86150040</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter, China</td><td>CN2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tejido vivo Kit criogénico Celliver</td><td>Biotechnology, Shanghai, China</td><td>LT2601</td><td></td></tr><tr><td>Kit de descongelación de tejido vivo</td><td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td><td>LT2602</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>Biocytogen, Beijing, China</td><td>B-CM-002-4-5W</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina& estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, EE. UU.</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Solarbio, Pekín, China</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, EE. UU.</td><td>8118367</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de sutura quirúrgica con hilo</td><td>LingQiao, Ningbo, China</td><td>3/8 arco 4&times; 10</td><td></td></tr><tr><td>Moldes y cuchillas auxiliares procesados por tejidos</td><td>Celliver Biotechnology, Shanghái, China</td><td>LT2603</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, EE. UU.</td><td>2003779</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 1</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, EE. UU</td>. <td>17100017</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

El uso de modelos preclínicos para avanzar en nuestra comprensión de la biología tumoral e investigar la eficacia de los agentes terapéuticos es clave para la investigación del cáncer. Aunque hay muchas líneas celulares de cáncer gástrica establecidas y muchos modelos de ratón transgénicos convencionales para la investigación preclínica, las desventajas de estos modelos in vitro e in vivo limitan sus aplicaciones. Debido a que las características de estos modelos han cambiado en la cultura, ya no modelan la heterogeneidad tumoral, y sus respuestas no han sido capaces de predecir respuestas en humanos. Por lo tanto, se están desarrollando modelos alternativos que representan mejor la heterogeneidad tumoral. Los modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX) preservan la apariencia histológica de las células cancerosas, conservan la heterogeneidad intratumoral y reflejan mejor los componentes humanos relevantes del microambiente tumoral. Sin embargo, por lo general toma 4-8 meses para desarrollar un modelo de PDX, que es más largo que la supervivencia esperada de muchos pacientes gástricos. Por esta razón, establecer líneas celulares primarias de cáncer puede ser un método complementario eficaz para los estudios de respuesta a fármacos. El protocolo actual describe los métodos para establecer modelos PDX y líneas celulares primarias de cáncer a partir de muestras quirúrgicas de cáncer gástrico. Estos métodos proporcionan una herramienta útil para el desarrollo de fármacos y la investigación de la biología del cáncer.

Aquí, los tejidos tumorales de una operación se conservaron en solución en stock hasta el siguiente paso. En 4 horas, los tejidos tumorales fueron cortados en trozos pequeños e implantados en los flancos dorsales de ratones NSG que habían sido anestesiados usando algodón empapado de isoflurano. Los tumores de más de 1 cm3 podrían ser resecadas para su implantación en nuevos ratones (Figura1)o cortadas cuidadosamente y conservadas en nitrógeno líquido siguiendo el protocolo. En est...

El protocolo actual describe métodos para establecer modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX) y líneas celulares primarias de cáncer a partir de muestras de cáncer gástrico quirúrgico. Los métodos proporcionan una herramienta útil para el desarrollo de fármacos y la investigación de la biología del cáncer.

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente y las líneas celulares primarias se están convirtiendo en una parte integral del desarrollo de fármacos y la iniciación y progresión de la investigación en biología tumoral. Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente preservan la apariencia histológica de las células cancerosas, retienen la heterogeneidad intratumoral y reflejan mejor los componentes humanos relevantes del microambiente tumoral. Sus modelos son para representaciones más precisas del cáncer humano que las líneas celulares de cáncer tradicionales y tienen el potencial de mejorar la evaluación preclínica de nuevas terapias contra el cáncer.Además, estos modelos pueden ser útiles para comparar características moleculares o firmas tumorales entre diferentes subgrupos de pacientes con cáncer. Los ratones NSG se recomiendan como modelo inmunodeficient de ratón. Debido a la inmunodeficiencia grave de los ratones, la esterilidad debe mantenerse en todos los experimentos.En condiciones estériles, utilice fórceps y tijeras para diseccionar cuidadosamente los tejidos tumorales y recortarlos en varios trozos pequeños. Después de anestesiar el ratón, utilice tijeras estériles para hacer una incisión de un centímetro en ambos flancos dorsales. Use fórceps estériles para interrumpir el tejido subcutáneo.Luego, corta un pedazo del tejido tumoral y colóquelo en el sitio profundo. Cierre el área del implante por sutura subcutánea con agujas de sutura quirúrgicas. Esterilice la herida con yodo.Después de esto, coloque suavemente los ratones en una jaula vacía mientras mantiene la recumbencia esternal. Preste mucha atención a los ratones, ya que deben despertarse y comenzar a caminar después de aproximadamente tres a cuatro minutos. Coloque ratones que se sometieron a cirugía en una nueva jaula separada de las personas no sometidas a cirugía.Evalúe el tamaño del tumor mediante la palpación del sitio de implantación y mida con una pinza Vernier dos veces por semana. Después de eutanasiar los ratones, utilice fórceps estériles y tijeras para aislar lentamente el tumor de los ratones. Lavar los tejidos tumorales en DPBS en un plato de 10 centímetros.Se fórceps y tijeras para diseccionar y eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos sanguíneos y tejido conectivo. A continuación, usa un molde para cortar los tejidos tumorales a un grosor máximo de un milímetro. Lavar las rodajas tumorales con DPBS en un plato de 10 centímetros.Para comenzar el proceso de vitrificación, utilice fórceps para transferir las rodajas al tubo V1 e incubar a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos. Enrolle e invierta brevemente el tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante otros cuatro minutos. A continuación, vierta la solución V1 y las rodajas en un plato de 10 centímetros y use fórceps para transferir las rodajas al tubo V2. Incubar a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos.Rodar e invertir el tubo brevemente e incubarlo a cuatro grados centígrados durante otros cuatro minutos. Después de esto, vierta la solución V2 y las rodajas en un plato de 10 centímetros. Transfiera las rodajas al tubo V3 e incubar a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Enrolle e invierta brevemente el tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante otros cinco minutos. Asegúrese de que todas las rodajas se hundan hasta la parte inferior del tubo. Si varias rodajas permanecen flotando, enrolle e invierta el tubo brevemente e incubar a cuatro grados centígrados hasta que todas las rodajas se hundan completamente.A continuación, vierta la solución V3 y las rodajas en un plato de 10 centímetros. Corte los soportes de tejido a la longitud adecuada y colóquelos en una gasa estéril. Transfiera las rodajas a los soportes.Envuelva los soportes con gasa. Usando fórceps, coloque los soportes en nitrógeno líquido y déjelos incubar durante cinco minutos. Después de esto, etiquete los viales criogénicos con la información del tejido.Transfiera los soportes con rodajas de tejido a los viales, que se almacenarán en nitrógeno líquido. En primer lugar, resect muestras de cáncer gástrico de especímenes resecados o tejidos PDX cosechados. Coloque los tejidos sobre hielo y transfieralos a un plato de cultivo estéril de 10 centímetros.Utilice fórceps y tijeras para eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos sanguíneos y tejido conectivo. Lavar los tejidos tumorales una vez con DPBS que contiene penicilina y estreptomicina en una placa de 10 centímetros. A continuación, corta el tumor en trozos de la tapa del plato.El espesor máximo de cada pieza debe ser de un milímetro. Transfiera las piezas a un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga siete mililitros de una solución de colagenasa y tripina tipo 1. Vórtice la mezcla brevemente.Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 a 40 minutos, asegurándose de vórtice la mezcla cada cinco minutos. Después de esto, añadir un volumen igual de RPMI-1640 medio complementado con 10%FBS y vórtice la mezcla a fondo. Transfiera esta mezcla a un nuevo tubo centrífugo de 50 mililitros por filtración lenta a través de un filtro de 40 microlitro.Centrifugar los filtrados a una velocidad entre 113 y 163 veces g durante cinco a siete minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado este sobrenadante. Lavar el pellet con cinco mililitros de PBS y retirar cuidadosamente el sobrenadante.Si el pellet es rojo, contiene eritrocitos. Resuspender suavemente el pellet con 500 microlitros de tólisis de glóbulos rojos e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue cinco mililitros de PBS.Centrifugar a una velocidad entre 113 y 163 veces g durante cinco a siete minutos a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resusppend el pellet con medio de cultivo y transfiera la mezcla a un plato estéril de 10 centímetros. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono, asegurándose de reemplazar el medio por un medio que contenga suero cada dos o tres días.En este estudio, se establecen modelos de cáncer gástrico PDX y líneas celulares primarias. Se observa que los tumores de primera generación crecen más lentamente que los de generaciones posteriores, tardando tres semanas o más en alcanzar el tamaño adecuado. La tasa de éxito de la formación de tumores subcutáneos de primera generación es superior al 80% La identidad de las células cancerosas de los modelos PDX se confirma a partir de los modelos PDX mediante tinción H&E.La tasa de éxito de la formación de tumores a partir del tejido tumoral crioconservado se observa que es aproximadamente 95%Células tumorales pueden ser fácilmente reconocidas por diferencias en la morfología. Las células primarias son autenticadas independientemente por dos patólogos bajo un microscopio. Para una confirmación adicional, la tinción de H&E se utiliza para observar la morfología celular del cáncer después de la fijación.La tasa de aislamiento exitoso de las líneas celulares primarias es de aproximadamente 40%Estos modelos han demostrado ser predictivos de los resultados clínicos y están siendo utilizados para la evaluación preclínica de fármacos mediante una identificación de marcadores, estudios biológicos y estrategias de medicina personalizada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe el protocolo para generar metástasis por los organoides de CCR derivados de PDX marcados con lentivirus GFP en el bazo de un ratón inmunodeficiente. Las micrometástasis cancerosas que colonizan otros órganos se pueden detectar utilizando un microscopio de fluorescencia para evaluar la expresión de GFP.

Establecimiento de un modelo experimental de metástasis en ratones: implantación de células organoides que expresan GFP en el modelo PDX para detectar micrometástasis

La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

Aquí se describe un protocolo para el establecimiento y cultivo derivado de humano y ratón 3 dimensiones (3D) gástrico organoides y el método para la transferencia de organoides 3D a una monocapa de 2 dimensiones. También se describe el uso de la monocapa epitelial gástrica como un análisis nuevo de cero-herida para estudios de regeneración.

Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración

Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades...

Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea

Los modelos PDX de metástasis del sistema nervioso central representan las características fenotípicas y moleculares de la metástasis humana, lo que los convierte en excelentes modelos para estudios preclínicos. Aquí se describe cómo establecer modelos PDX y las rutas de inoculación que se utilizan mejor para estudios preclínicos.

El establecimiento y la utilización de modelos de xenoinjerto derivados del paciente de metástasis del sistema nervioso central

El presente protocolo establece y caracteriza un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), ya que los modelos PDX se están convirtiendo rápidamente en el estándar en el campo de la oncología traslacional.

Establecimiento y caracterización de modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de carcinoma anaplásico de tiroides y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello

Este protocolo describe la implantación ortotópica de células cancerosas derivadas del paciente en la pared del ciego de ratones inmunodeficientes. El modelo recapitula la enfermedad metastásica del cáncer colorrectal avanzado y permite la evaluación de nuevos fármacos terapéuticos en un escenario clínicamente relevante de metástasis pulmonares y hepáticas.

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

Los organoides gástricos derivados de pacientes encuentran un uso cada vez mayor en la investigación, sin embargo, faltan protocolos formales para generar organoides gástricos humanos a partir de digestión de una sola célula con densidad de siembra estandarizada. Este protocolo presenta un método detallado para crear organoides gástricos de forma fiable a partir de tejido de biopsia obtenido durante la endoscopia superior.

Establecimiento y caracterización de organoides gástricos derivados de pacientes a partir de biopsias de cuerpo gástrico benigno y epitelio antral

Este protocolo describe un método eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama en ratones. La técnica consiste en la disociación enzimática del tumor seguida de una inyección directa en las almohadillas de grasa mamaria, lo que permite una implantación de alto rendimiento. La validación exhaustiva garantiza la fidelidad del modelo, lo que facilita estudios rigurosos en varios subtipos de cáncer de mama.

Disociación de alto rendimiento e implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama

El siguiente protocolo se centra en el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente (STS). Este modelo podría ayudarnos a entender mejor el fondo molecular y perfil farmacológico de estos raros tumores malignos y podría representar un punto de partida para futuras investigaciones destinadas a mejorar la gestión de STS.

Establecimiento de un cultivo primario de Sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente

Aprende a establecer modelos de xenoinjerto derivados del paciente y líneas celulares primarias de cáncer gástrico. Este método utiliza ratones NSG para preservar la heterogeneidad tumoral y mejorar la evaluación preclínica de terapias.

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

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