Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Basado en tecnología microfluídica, el aislamiento y caracterización de los CTC de las células sanguíneas normales no requieren el uso de biomarcadores específicos de CTC, y es compatible con el cultivo celular. Este protocolo facilita una alta tasa de extracción de CTC, y proporciona un análisis citológico extenso de los CTC, mediante la evaluación de las características citomorfológicas malignas. La expresión PD-L1 por CTCs tiene un valor predictivo en el manejo del cáncer de pulmón.

La mejora de su detección mediante esta prueba podría promover un mejor manejo del paciente a largo plazo. Otras aplicaciones de este protocolo incluyen la detección de aberraciones genéticas utilizando FISH, o la realización de análisis transcriptómicos en CTC, así como aislar células de origen fetal en madres. Demostrando el procedimiento estará Julie Balandier, una técnico de nuestro laboratorio.

Para el enriquecimiento preanálisis de células tumorales circulantes, primero recoja 7,5 mililitros de sangre en un tubo EDTA de potasio, y mantenga la muestra bajo agitación suave para evitar la sedimentación celular y la coagulación. Dentro de las seis horas de la recolección, utilice una pipeta serológica bajo un gabinete de seguridad microbiológica, para transferir hasta 7,5 mililitros de sangre entera a un nuevo tubo centrífugo de 50 mililitros, y centrifugar la muestra durante 10 minutos a 1600 veces G, a temperatura ambiente. Al final de la centrifugación, utilice una pipeta de transferencia para recoger la fracción de plasma sin alterar la capa de buffy, y diluya el plasma con un volumen equivalente de PBS, hasta 7,5 mililitros.

A continuación, agregue cuidadosamente el tampón de lysis de glóbulos rojos a la muestra de sangre, a un volumen final de 30 mililitros e invierta suavemente el tubo de recolección de sangre tres veces, antes de colocar el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación, y eliminar cuidadosamente todos menos los últimos cuatro a cinco mililitros de sobrenadante. Utilice una micropipeta filtrada para quitar el sobrenadante restante y utilice una micropipeta P1000 con una punta filtrada para agregar un mililitro de búfer de resuspensión por la pared del tubo.

Para evitar la introducción de burbujas, resuspender el pellet celular con pipeteo suave, hasta que la muestra sea homogénea. Cuando el pellet haya sido resuspendido, agregue tres mililitros adicionales de tampón de resuspensión a la pared del tubo, sin introducir burbujas, y mezcle suavemente las células de nuevo. Para el dispositivo microfluídico espiral que circula el enriquecimiento de células tumorales, primero cargue un nuevo chip microfluídico espiral en el dispositivo y cargue un tubo centrífuga vacío de 50 mililitros en cada uno de los puertos de entrada y salida.

Haga clic en prime para preparar el dispositivo microfluídico espiral durante tres minutos. Extracción de los tubos de entrada y salida al final del ciclo. Cargue la muestra de sangre resuspendida en el puerto de entrada y cargue un tubo cónico claro de 15 mililitros en el puerto de salida.

A continuación, haga clic en Ejecutar y seleccione el programa tres para iniciar el programa de enriquecimiento de células tumorales circulantes de 31 minutos. Al final del ciclo transfiera el tubo de salida a la centrífuga, y utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para eliminar todos los mililitros excepto los dos últimos del sobrenadante. A continuación, utilice una micropipeta para eliminar todos los 100 microlitros de sobrenadantes.

Para la tinción de inmunofluorescencia, cuente las células en un hemocitoómetro y diluya la muestra enriquecida a una de cada diez a quinta células por cada 100 microlitros de concentración de solución antianchazable al 0,2%. A continuación, utilice un hisopo de algodón empapado con 50 microlitros de solución antiencuadernación para humedecer el contorno de la cámara de muestra, y coloque un portaobjetos de vidrio de poli lisina en la cámara de muestra. Cierre la cámara y pipetee hacia arriba y hacia abajo tres veces para recubrir una punta de micropipeta con la solución de unión antes de resuspender la muestra en los últimos 100 microlitros del sobrenadante.

Transfiera la solución celular a la cámara de muestra y citopte la muestra en una centrífuga dedicada a 400 rotaciones por minuto durante cuatro minutos, a una aceleración baja. Al final de la centrifugación, coloque un aislador de silicona alrededor del área de deposición y deje que el portaobjetos se seque bajo un armario de seguridad microbiológico durante dos minutos, luego fije la muestra de citospun con 100 microlitros de 4%paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de dos minutos con 200 microlitros de PBS por lavado, a temperatura ambiente. Después del último lavado, bloquee cualquier unión no específica con 30 minutos de incubación en el bloqueo del reactivo a temperatura ambiente, seguido de etiquetado con 100 microlitros de la solución de anticuerpos de interés.

Coloque el portaobjetos etiquetado en un plato de petri de 100 por 15 mililitros sobre un pedazo de papel absorbente humedecido con dos mililitros de agua estéril, y coloque el plato cerrado, a cuatro grados centígrados durante la noche, protegido de la luz. A la mañana siguiente, lave la muestra tres veces con PBS como se ha demostrado, y monte la muestra con 10 microlitros de una solución de montaje adecuada y un resbalón de cubierta de vidrio. A continuación, selle el resbalón de la cubierta con esmalte de uñas transparente.

Para crear imágenes de las muestras de citospun, cargue la diapositiva en un microscopio fluorescente recto con una plataforma motorizada X Y y seleccione un objetivo de 20x y los canales adecuados de acuerdo con los fluoróforos utilizados para el etiquetado de anticuerpos. Encienda la lámpara de mercurio y adapte el microscopio y el software asociado a un brote semiautomizado. Cuando la lámpara esté lista, en el menú de adquisición, defina los cuatro canales, establezca el tiempo de exposición y defina las teselas que desea escanear.

Haga clic en los iconos y en el experimento avanzado y defina el área que desea escanear. A continuación, ajuste el enfoque en la pantalla y haga clic en Iniciar experimento. Al final del experimento, exporte los archivos TIF para cada canal y asigne específicamente el nombre del archivo para incluir la muestra, el número de veces, el tinte y el número de subtajas.

Para el análisis de imágenes, abra el software de análisis de imágenes desde el sitio web de Broad Institute y haga clic en archivo, canalización desde archivo y análisis de cuatro canales CTC. Suelte los archivos en la lista de archivos y actualice los metadatos para agrupar los archivos por iconos. A continuación, haga clic en analizar imágenes para abrir el archivo de hoja de cálculo correspondiente a los parámetros de intensidad de medición.

Sin el protocolo de descontaminación optimizado, se observa una alta contaminación bacteriana en cultivos tisulares de líneas celulares A549 enriquecidas después de sólo 24 horas, causando la muerte y cambios citomorfológicos en las células eucariotas. Por el contrario, después del protocolo de limpieza, las células A549 vivas se obtienen en cultivos 2D después de 10 horas de cultivo de tejidos y extracción media, bajo condiciones de cultivo 3D, y dentro de muestras de pacientes. Utilizando un ensayo de tinción inmunofluorescente líquido o un ensayo de tinción inmunofluorescente en diapositivas recubiertas de polilizadoína con citospino, se puede observar una clara distinción en el número de núcleos enumerados entre los dos ensayos.

Sin el paso de citospino, es difícil diferenciar los glóbulos blancos de las células tumorales, debido a los contornos borrosos en los preparativos de las células no citospinales. Aquí se pueden observar diferentes hallazgos representativos de diferentes muestras de pacientes, con el recuento residual de los glóbulos blancos en particular determinado determinado para ser fuertemente variable, y dependiendo de toda la muestra de sangre. También se observó una alta variabilidad en las submodas de células tumorales circulantes obtenidas.

Cada celda en el citoestra es identificada por el software de análisis de imágenes, y permite el seguimiento de la célula y manualmente para confirmar los resultados según sea necesario. De hecho, un análisis piloto demostró una concordancia entre la enumeración manual y la enumeración de software de análisis de imágenes. La configuración de la placa de petri húmeda diseñada internamente para la hibridación proteína-anticuerpo es crítica, ya que el dispositivo permanece suficientemente húmedo durante todo el tiempo de incubación.