Un novedoso método de corrección de la nicotinamida adenina dinucleótido para la medición intracelular Ca2+ con Fura-2-Analog en células vivas
20 de septiembre de 2019
Debido a la superposición espectral de las longitudes de onda de excitación y emisión de nadáya y fura-2 análogos, la interferencia de señal de ambos productos químicos en las células vivas es inevitable durante la medición cuantitativa de [Ca2+]. Por lo tanto, se desarrolló un nuevo método de corrección en línea de interferencia de señal NADH para medir [Ca2+].
Sondas plurales excitables UV, tienen una contaminación de señal inherente, debido a los sonidos auto-plurales. La mayor parte del problema con NADH, está limitando el uso de una sonda plural. Se puede utilizar un método para corregir con precisión la florescencia externa de NADH, con el fin de extraer una señal de sonda plural verdadera y no contaminada.
Demostrando el procedimiento estará Jeong Hoon Lee, nuestro profesor asistente de investigación de mi laboratorio. Después de permitir que los miocitos se asienten en el fondo del tubo, aspirar el sobrenadante. Etiquete las células con dos mililitros de solución diluyente de fura-2-FFAM recién preparada durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.
Al final de la incubación, coloque el tubo en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 30 minutos en posición vertical antes de retirar el sobrenadante. A continuación, agregue cuatro mililitros de medio de cultivo de temperatura ambiente para almacenar a temperatura ambiente. Para la identificación de punto fura-2-ffa isobestico in situ monte las células diluidas en la etapa del microscopio y espere tres minutos a que las células se hundan hasta el fondo.
Profuse nadH-libre de NADH 37 grados Celsius solución libre de calcio en el cultivo celular y localizar una célula de destino. Profuse la solución de saponina durante 60 segundos antes de volver a profusar con la solución sin calcio sin NADH. Mida simultáneamente las señales emitidas fura-2-ff a 450 y 500 nanómetros, utilizando un escaneo de excitación de 350 a 365 nanómetros con un paso de 0,1 nanómetros y re-profuso con solución libre de calcio sin NADH.
A continuación resta las señales de la solución saturada de calcio de las señales en las condiciones libres de calcio. A continuación, calcule las desviaciones estándar de la emisión en cada excitación y seleccione la longitud de onda de excitación que muestra los valores mínimos de desviación estándar como puntos isobesticos individuales. Para utilizar un sistema de medición multiparamétrico para detectar la señal de fondo y corregir la señal dentro del área celular, monte células libres de tinte en el baño del microscopio y permita que las células se asienten durante tres minutos.
Profusa la solución sin calcio NADH en el baño durante unos cinco minutos a una velocidad de dos a tres mililitros por minuto y establezca el campo de objeto para cubrir la célula objetivo. Después de mover la celda fuera del campo, mida las señales de fondo de la ventana libre de celdas y establezca las señales como desplazamientos. Luego devuelva la celda a la posición inicial y mida las señales de fondo de la celda y el área de la celda.
Para calcular el factor R, utilice las señales de fondo y área de la célula adquirida antes de volver a montar las células libres de tinte en el microscopio y profusar con una solución libre de calcio. Mida las señales como se indica antes de profusar la suspensión celular con solución de malato. Después de medir las señales profusa las células con solución de piruvato seguida de profusión con solución de malate-piruvato y solución de rotenona.
A continuación, calcule la pendiente de cada señal. Aquí se muestran los cambios en el calcio mitocondrial antes y después de la corrección. Los resultados revelan claramente cambios sustanciales en el calcio mitocondrial con una concentración de calcio en reposo mitocondrial sin calcio citosolólico de 1,03 más o menos 0,13 micromolares y calcio mitocondrial máximo a un micromolar de calcio de 29,6 más o menos 1,61 micromolares.
El potencial de la transmembrana mitocondrial fue monitoreado con una profusión de dos nanomolares TMRE. El cambio en el potencial mitocondrial se calculó sobre la base de un potencial de membrana mitocondrial inicial supuesto de menos 150 milivoltios, lo que demuestra una disminución de la NADH en respuesta a la adición de calcio, con un efecto negliable sobre el potencial de la membrana mitocondrial. El pH mitocondiral no se vio por el aumento del calcio mitocondrial inducido por la carga de carboxy SNARF-1.
Los puntos isobesticos incorrectos dan lugar a una corrección incorrecta de R y NADH. Así que tenga cuidado de medir siempre correctamente el fondo libre de celdas y el área de la celda. Esta técnica se utiliza para preparar estudios dinámicos de calcio mitocondrial en los derrames bioanalíticos.
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Descripción general
Este estudio aborda el desafío de la interferencia de señal proveniente de NADH y análogos de fura-2 al medir las concentraciones de calcio en células vivas. Se desarrolló un nuevo método de corrección en línea para mejorar la precisión de las mediciones de [Ca2+] en presencia de contaminación por señal de NADH.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Interferencia de la señal en mediciones de fluorescencia
- Medición de calcio en células vivas
- Desarrollo de técnicas de corrección
Antecedentes
- La superposición espectral de las longitudes de onda de excitación y emisión complica las mediciones.
- El NADH puede limitar la utilidad de múltiples sondas en microscopía de fluorescencia.
- Las mediciones precisas de [Ca2+] son cruciales en estudios celulares.
Métodos Utilizados
- Medición de fluorescencia con fura-2
- Ensayos celulares con miocitos
- Técnicas de corrección de señal y medición de fondo
Resultados principales
- Se observaron cambios significativos en las concentraciones de calcio mitocondrial.
- Se desarrolló un enfoque sistemático para corregir la interferencia de NADH.
- Se validó la técnica mediante procedimientos experimentales rigurosos.
Conclusiones
- El estudio demuestra con éxito un método para mejorar la precisión de las mediciones de fluorescencia.
- Esto tiene implicaciones para los análisis cuantitativos en biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición precisa del calcio intracelular es fundamental para la validación de objetivos en el descubrimiento de fármacos, particularmente en las vías de señalización mitocondrial. La autofluorescencia de NADH introduce una interferencia significativa en los ensayos basados en fura-2, comprometiendo la fiabilidad de los datos y aumentando las tasas de falsos positivos en las fases iniciales de cribado. Este método de corrección de NADH mejora la confianza predictiva al aislar las señales reales de calcio, apoyando la desvinculación mecanicista en programas de objetivos cardiovasculares y metabólicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el manejo del calcio mitocondrial como hipótesis terapéutica en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad mecanicista al separar la autofluorescencia de NADH de las señales verdaderas de fura-2.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en el blanco mediante mediciones cuantitativas de flujo de calcio libres de interferencias.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos posteriores mediante el establecimiento de fluorescencia corregida por NADH.
- Reproducibilidad: Estandariza la selección de la longitud de onda de excitación mediante la determinación del punto isobéstico, minimizando la variabilidad entre ensayos.
- Capacidad de multiplexación: Permite la medición simultánea de NADH, calcio y pH o potencial de membrana utilizando conjuntos distintos de excitación/emisión.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicable directamente a modelos de disfunción mitocondrial en trastornos neurodegenerativos y metabólicos.
- Continuidad traslacional: Conecta observaciones de flujo de calcio en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante señales corregidas de fura-2-FF.
- Avance ajustado al riesgo: Permite tomar decisiones más confiables de avance o interrupción al reducir las señales falsas en ensayos de calcio mitocondrial.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos y la validación mecanicista preclínica, específicamente para dianas mitocondriales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al aislar señales dependientes del calcio de la interferencia metabólica en ensayos con células vivas.
- Detección: Mejora la preparación del ensayo mediante la sustracción del fondo y la corrección de desplazamientos, aumentando la relación señal-ruido para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas ratiométricas mediante el cálculo del factor R usando la emisión corregida a 450 nm y 500 nm.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante el monitoreo simultáneo del calcio y del potencial de membrana mitocondrial utilizando TMRE.
- Reutilización Empresarial: Establece un marco de corrección reutilizable aplicable a diversos tipos celulares y sondas fluorescentes propensas a interferencia por NADH.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al eliminar los falsos positivos inducidos por NADH en la señalización de calcio.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante la identificación sistemática del punto isobéstico y la sustracción del fondo.
- Valor estratégico: Apoya decisiones más sólidas de avance/no avance al reducir el ruido biológico en cascadas de cribado de etapas iniciales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos mitocondriales mediante lecturas funcionales fiables y libres de interferencias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y manejo de sondas ratiométricas.
- Necesita instrumentación capaz de escanear longitudes de onda de excitación (350–365 nm) y detectar emisiones duales (450 nm, 500 nm).
- Exige estandarización entre equipos en la medición de señales de fondo y en los protocolos de corrección de desplazamiento.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes protocolos de preparación de células sin tinción.
- Depende de mediciones minuciosas de la señal de fondo sin células y del área celular para evitar la selección incorrecta del punto isobéstico.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
