Name: Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a cuantificar gotas de lípidos en levaduras mediante microscopía de fluorescencia y análisis automatizado de imágenes. Este protocolo estandarizado permite evaluar el metabolismo lipídico en Saccharomyces cerevisiae y otras especies.

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Este trabajo fue apoyado por las becas de la Universidad Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 y SVV 260310. Agradecemos a Ond-ej éebesta por la ayuda con la microscopía y el desarrollo de la canalización de análisis de imágenes. Agradecemos al laboratorio de ReGenEx por las cepas de S. cerevisiae, y al laboratorio de JapoNet y Hironori Niki para las cepas de S. japonicus. La cepa ppc1-88 fue proporcionada por The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y fluorescencia cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa (Proyecto no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00/21515).

1. Preparación de soluciones y medios de comunicación
<ol><li>
Prepare la solución de tinción de lípidos.
	<ol>
<li>Para preparar la solución de tinción de lípidos en stock disolver 10 mg de BODIPY 493/503 en 10 ml de DMSO anhidro (concentración final 1 mg/ml). Disolver todo el contenido de un vial de 10 mg de BODIPY 493/503 para evitar la pérdida de material durante el pesaje. PRECAUCION: La DMSO puede pasar a través de la piel. Use el equipo de protección personal adecuado.</li>
		<li>Preparar la solución de tinción de lípidos de trabajo mezclando 100 l de la solución de material de 1 mg/ml DE BODIPY 493/503 y 900 ml de DMSO anhidro (concentración final 0,1 mg/ml).</li>
		<li>Aliquot el stock y las soluciones de trabajo, y almacenar a -20 oC. NOTA: Disolución BODIPY 493/503 es estable durante varios años a -20 oC. Sin embargo, la solución tiene que estar protegida de la humedad y la luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar la solución de stock para la visualización de los límites celulares, disolver 25 mg de dextran Cascade Blue (vial entero) en 2,5 ml de agua desionizada (concentración final 10 mg/ml). Aliquot la solución de stock y almacenar a -20 oC protegido de la luz.</li>
	<li>Para preparar la solución de recubrimiento deslizante del microscopio, disolver 5 mg de lectina de soja en 5 ml de agua desionizada (concentración final 1 mg/ml). Aliquot la solución de lectina y almacenar a -80 oC. NOTA: La solución de lectina es estable durante varios años a -80 oC. Las aliquots actualmente en uso pueden almacenarse a -20 oC.</li>
	<li>
Preparar los medios de cultivo.
	<ol>
<li>Para preparar 400 mL de complejo medio de cultivo SI para S. pombe y S. japonicus, disolver 2 g de extracto de levadura y 0,1 g de suplementos de SP (si es necesario para mutantes auxotrópicos) en 340 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 60 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.</li>
		<li>Para preparar 400 mL de medio de cultivo EMM definido para S. pombe y S. japonicus, disolver 4,9 g de caldo EMM sin dextrosa en 360 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 40 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas. NOTA: Para consultar las directrices generales sobre el cultivo de S. pombe y S. japonicus, véase25 y26, respectivamente.</li>
		<li>Para preparar 300 mL de complejo medio de cultivo YPAD para Saccharomyces cerevisiae,disolver 3 g de extracto de levadura, 6 g de peptona y 30 mg de sulfato de adenina en 270 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 30 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.</li>
		<li>Para preparar 300 ml de medio mínimo definido para S. cerevisiae, disolver 2 g de base de nitrógeno de levadura (sin aminoácidos) en 270 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 30 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas. NOTA: Para consultar las directrices generales sobre el cultivo de S. cerevisiae, véase27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivo celular
<ol><li>
Crecimiento de S. pombe o S. japonicus a fase exponencial o estacionaria temprana.
	<ol>
<li>Por la mañana, inocular 5 ml de medio YES con biomasa de levadura de festeja fresca. Incubar a 32oC con agitación (180 rpm) durante varias horas. NOTA: Para todos los cultivos, utilice frascos Erlenmeyer que tengan 10 veces el volumen de cultivo para garantizar una aireación adecuada. Algunos laboratorios prefieren cultivar levaduras de fissión a 30 oC, pero la temperatura de cultivo de 32 oC da como resultado tiempos de duplicación más cortos sin efectos perjudiciales para las células, reduciendo así el tiempo total necesario para realizar un experimento de25,28 .</li>
		<li>A última hora de la tarde del mismo día (después de al menos 6 horas de cultivo), diluir el cultivo con medio fresco de YES a un volumen de cultivo final de 10 ml para que alcance la densidad óptica deseada (OD) (o el número de células/ml) a la mañana siguiente, e incubar a 32oC con s rey (180 rpm). Es de ventaja conocer el tiempo de duplicación de cada cepa utilizada para determinar con precisión el factor de dilución (utilice la Ecuación 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> Donde elcultivo Ves el volumen de precultivo necesario para la dilución, Vfinal es el volumen total del nuevo cultivo (10 mL para cultivos estándar), ODfinal es la OD deseada para ser alcanzado el después de la mañana siguiente, lacorriente deOD es la DoD actualmente medida de la precultura, t es el momento del crecimiento celular hasta la cosecha, tlag es la duración de la fase de retraso (depende de las condiciones de laboratorio, se define empíricamente) y tDT es el tiempo de duplicación de la cepa. NOTA: Cuando se van a analizar las células de fase exponencial, no deje que los precultivos alcancen la fase estacionaria, ya que esto altera drásticamente la fisiología celular (incluido el contenido de LD) durante varias generaciones posteriores.</li>
		<li>En la mañana del día de la toma de imágenes, si el cultivo alcanzó un D.OD ligeramente más alto de lo requerido (en el caso de las células de fase exponencial), diluirlo con sies frescos y continuar la incubación durante al menos dos veces más de duplicación antes de la tinción de DDs. tinción (Sección 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crecimiento de S. cerevisiae a fase exponencial y estacionaria.
	<ol>
<li>Por la tarde, inocular 10 ml de medio YPAD con una pequeña cantidad de biomasa de levadura en ciernes frescae e incubar durante la noche a 30 oC con agitación (180 rpm).</li>
		<li>La mañana del día de la toma de imágenes, diluir el cultivo a 0,1 oD en 10 ml de medio YPAD y crecer hasta la DoD requerida (por ejemplo, OD 1 para la fase exponencial). Realice cualquier dilución de cultivo como se describe en el paso 2.1.2. Proceder a la tinción (Sección 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tinción de gotas de lípidos
<ol><li>Prepare un comprobante de cubierta del microscopio para cada muestra que se va a tomar una foto. Extienda 1 l de solución de recubrimiento deslizante en un resbalón de cubierta limpio utilizando el lado largo de una punta de pipeta colocada horizontalmente. Deje que la solución de recubrimiento se seque por completo y almacene los resbalones de la cubierta en un ambiente libre de polvo. NOTA: Los portaobjetos de vidrio y los cubreobjetos se pueden limpiar antes de su uso si es necesario. El procedimiento de limpieza consiste en lavar con detergente para lavar platos, enjuagar con agua, remojar durante la noche en ácido clorhídrico al 3% y lavar con agua destilada. Las diapositivas y los cubreobjetos limpios se almacenan en etanol puro hasta su uso.</li>
	<li>Mida el OD del cultivo celular o el número de celdas/ml, según sea necesario. Trate de alcanzar valores similares entre todas las cepas probadas para garantizar condiciones experimentales comparables.</li>
	<li>Pipetear 1 ml de cada cultivo celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Sólo para S. cerevisiae, agregue 5 sL de la solución de recubrimiento deslizante, vórtice brevemente e incubar a 30 oC con agitación durante 5 min.</li>
	<li>Añadir brevemente 1 l de la solución de tinción de lípidos a cada alícuota de cultivo y vórtice. A continuación, agregue brevemente 10 l de la solución de visualización de límites de celda y el vórtice. NOTA: No prepare soluciones premezcladas de ambas manchas, ya que esto conduce al enfriamiento por fluorescencia de BODIPY 493/503.</li>
	<li>Recoger las células por centrifugación (1.000 x g,3 min, RT) y eliminar casi todos los sobrenadantes (950 l). Resuspenda las células del sobrenadante restante.</li>
	<li>Pipetear 2 l de la suspensión de células densas sobre un resbalón de cubierta recubierto de lectina y colocarlo en un portaobjetos limpio del microscopio. Las celdas deben formar una monocapa. Proceder a la microscopía (Sección 4) lo más rápido posible para minimizar los artefactos en la toma de imágenes; proceso máximo de dos muestras a la vez.</li>
</ol>4. Configuración del microscopio y las imágenes
<ol><li>
Optimice las condiciones de imagen. NOTA: La configuración del microscopio requiere exposiciones prolongadas a fuentes de luz fuertes que podrían causar daños en la muestra y resultados de sesgo. Por lo tanto, configure las condiciones de creación de imágenes mediante una diapositiva de muestra dedicada que no se utilizará más para la cuantificación de LD.<ol>
<li>Concéntrese en las celdas utilizando contraste de fase o contraste de interferencia diferencial (DIC). NOTA: Las imágenes de contraste de fase o DIC se pueden tomar como referencia, pero no se utilizan durante el paso de análisis de imágenes automatizado.</li>
		<li>Establezca la configuración de la pila z para abarcar todo el volumen de la celda. La distancia vertical total depende del tamaño de la celda; el número de sectores ópticos depende de la apertura numérica del objetivo (función de dispersión de puntos en el eje z). Establezca el enfoque para que se mueva en relación con el plano focal central. NOTA: El número óptimo de rodajas a menudo es establecido por el software de control del microscopio y no necesita ser calculado manualmente. Las anchuras típicas de las células son de 3-5 m para S. pombe, 4-7 m para S. japonicus,y 3-7 m para S. cerevisiae.</li>
		<li>Para la imagen de los D, ajuste la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal verde (la excitación y el máximo de emisión de BODIPY son 493 y 503 nm, respectivamente). NOTA: BODIPY 493/503 es un fluorocromo muy brillante; sin embargo, puede blanquearse rápidamente con una intensidad lumínica demasiado fuerte. Además, los LU son móviles en células vivas, minimizando así el tiempo de exposición y capturando primero la pila z de canal verde completa (antes de cambiar al canal azul) para evitar artefactos borrosos. Además, tenga en cuenta el rango lineal de la cámara para la intensidad de la señal para evitar píxeles saturados.</li>
		<li>Para crear una imagen de los límites de las celdas, establezca la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal azul (la excitación y el máximo de emisión de la dextran Cascade Blue son 400 y 420 nm, respectivamente). NOTA: La intensidad de la señal en el canal azul es necesaria para la segmentación de la imagen, pero no se utiliza para la cuantificación LD en sí. Por lo tanto, los ajustes óptimos en este canal no son cruciales para el análisis.</li>
		<li>Si es posible, cree un flujo de trabajo experimental automatizado en el software de control del microscopio para facilitar la toma de imágenes de varias muestras en condiciones estandarizadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez optimizadas las condiciones de imagen, se utilizarán muestras de imágenes para la cuantificación. Concéntrese en las celdas e infórmelas en canales verdes y azules como se describe en el paso 4.1. NOTA: Todas las imágenes deben adquirirse utilizando la misma configuración para permitir la comparación entre muestras. Imagen de varios campos de visión por muestra para obtener datos sólidos y representativos.</li>
	<li>Guarde las imágenes de la pila z del canal azul y verde como archivos TIFF multicapa de 16 bits (es decir, dos archivos por campo de visión). Incluya las palabras "verde" o "azul" en los nombres de archivo correspondientes. Continúe con el análisis de imágenes (Sección 5).</li>
</ol>5. Análisis de imagen
<ol><li>
Compruebe visualmente la calidad de las imágenes adquiridas.
	<ol>
<li>Abra imágenes microscópicas en ImageJ29,30 u otro software de análisis de imágenes adecuado.</li>
		<li>Elimine las pilas de imágenes que contengan un número considerable de celdas que se movieron durante la adquisición (y, por lo tanto, crearon artefactos de desenfoque).</li>
		<li>Elimine las pilas de imágenes que contengan partículas no celulares altamente fluorescentes en el canal azul (por ejemplo, suciedad en la diapositiva del microscopio o resbalón de la cubierta, impurezas en el medio de cultivo). NOTA: Los objetos no celulares muy brillantes en el canal azul pueden crear artefactos de detección de células o pueden interferir con la detección de celdas en sus proximidades.</li>
		<li>Elimine las pilas de imágenes que contengan una gran proporción de células muertas (es decir, células con mayor fluorescencia azul en comparación con las células vivas). NOTA: Mientras que la presencia de una pequeña proporción de células muertas en la muestra no suele ser un problema y estas células se descartan automáticamente durante el análisis, algunas células muertas o moribundas ocasionalmente pueden ser reconocidas como células vivas por el algoritmo de segmentación y por lo tanto sesgar los resultados reportados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analice imágenes en el software MATLAB.
	<ol>
<li>Cree una carpeta principal y copie todos los scripts de MATLAB en esta ubicación.</li>
		<li>Cree una subcarpeta ("pombe", "cerevisiae" o "japonicus") y copie los archivos de imagen TIFF de entrada en esta ubicación.</li>
		<li>Inicie MATLAB, abra el script MAIN.m y ejecútelo. En el menú seleccione las especies de levadura a analizar e inicie el procesamiento de imágenes. NOTA: Algunos de los parámetros necesarios para la detección de celdas y LD están predefinidos para la especie en particular, otros se determinan automáticamente durante el procesamiento de imágenes. Los valores preestablecidos se determinaron empíricamente y dependen de varios factores, como la ampliación objetiva, el tipo de cámara y la sensibilidad, y la configuración de imágenes. Si es necesario, los usuarios pueden editar los archivos de script para cambiar los ajustes preestablecidos específicos del organismo para reflejar mejor su configuración experimental. Es decir, durante el reconocimiento de celdas los tamaños de objeto aceptables se indican mediante los parámetros "minArea" y "maxArea", y la fracción mínima del volumen relleno dentro de los límites del objeto se proporciona mediante el parámetro "Solidity". Para el reconocimiento de LD, el umbral de brillo se da por el parámetro "th" (su valor se ve afectado principalmente por la profundidad de bits de la imagen y la intensidad de la señal de fluorescencia), y el tamaño máximo aceptable LD lo da el parámetro "MaxArea".</li>
		<li>Inspeccione y procese los archivos de salida según sea necesario utilizando un editor de hojas de cálculo o un paquete estadístico; el flujo de trabajo genera archivos CSV separados por punto y coma y archivos TIFF segmentados con objetos de celda y LDs detectados. NOTA: El flujo de trabajo segmenta las imágenes en objetos de fondo y de celda, donde cada objeto de celda puede estar compuesto de varias celdas adyacentes. Por lo tanto, la salida en los archivos "xxxx_cells.csv" no representa datos de una sola celda y solo debe utilizarse para calcular métricas por unidad de volumen de celda.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La comprensión del metabolismo lipídico y su regulación es importante tanto para la biología básica, como para las aplicaciones clínicas y biotecnológicas. El contenido de LD representa una lectura conveniente del estado del metabolismo de los lípidos de la célula, siendo la microscopía de fluorescencia uno de los principales métodos utilizados para la determinación del contenido de LD. El protocolo presentado permite la detección automatizada y la descripción cuantitativa de los D Individuales en tres especies de levadu...

Los lípidos desempeñan un papel crucial en la energía celular y el metabolismo del carbono, la síntesis de componentes de membrana y la producción de sustancias bioactivas. El metabolismo de los lípidos se ajusta según las condiciones ambientales, la disponibilidad de nutrientes y la fase1del ciclo celular. En los seres humanos, el metabolismo de los lípidos se ha conectado a enfermedades, como la obesidad, la diabetes tipo II y el cáncer2. En la industria, los lípidos producidos por microorganismos, como las levaduras, representan una fuente prometedora de combustibles diésel renovables3. Las células almacenan lípidos neutros en las llamadas gotas lipídicas (LD). Estos cuerpos evolutivamente conservados se componen de triacilgliceroles, ésteres de esteril, una monocapa fosfolípido externa y proteínas asociadas1. Los LM se originan en el retículo endoplasmático, ejercen dinámicas de ciclo celular o fase de crecimiento, y son importantes para la homeostasis lipídica celular1. El número de LD y la morfología se pueden utilizar como un proxy conveniente al analizar el metabolismo de los lípidos bajo diversas condiciones de crecimiento o al examinar un panel de mutantes. Dada su naturaleza dinámica, las técnicas capaces de analizar las propiedades de los DNl individuales son de particular interés en los estudios del metabolismo lipídico.
Varias especies de levadura se han utilizado para describir las vías metabólicas relacionadas con los lípidos y su regulación, o se utilizan en la biotecnología para producir compuestos o combustibles interesantes1. Además, para levaduras modelo, tales como la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae o la levadura de fismo distantemente relacionada Schizosaccharomyces pombe, se encuentran disponibles bibliotecas de cepas de eliminación en todo el genoma que se pueden utilizar para un alto rendimiento pantallas4,5. Recientemente la composición y dinámica de LD se han descrito en S. pombe6,7,8,9, y mutantes relacionados con el metabolismo lipídico se han aislado en el modelo emergente de levadura Schizosaccharomyces japonicus10.
Numerosas técnicas están disponibles para estudiar el contenido y la dinámica de LD. La mayoría emplea algún tipo de tinción de Lutsisconlos con colorantes lipofílicos como Nile Red o BODIPY 493/503. Este último muestra espectros de excitación y emisión más estrechos, y una mayor especificidad hacia los lípidos neutros (LD) en comparación con los fosfolípidos (membranas)11. Los métodos fluorimétricos y de citometría de flujo se han utilizado con éxito en varias especies de hongos para descubrir genes y condiciones de crecimiento que afectan al contenido de lípidos de almacenamiento12,13,14,15. Si bien estos métodos son adecuados para aplicaciones de alto rendimiento, no pueden medir el número y la morfología de los D Individuales en las células, lo que puede diferir drásticamente entre las condiciones de crecimiento y los genotipos. La dispersión coherente de Raman o la microscopía holográfica digital son métodos sin etiquetas que producen datos a nivel de LD, pero requieren equipos especializados y costosos16,17,18. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, puede proporcionar datos detallados sobre el contenido de LD, al tiempo que utiliza instrumentos comúnmente disponibles y herramientas de software de análisis de imágenes. Existen varios flujos de trabajo de análisis que cuentan con varios grados de sofisticación y automatización en la detección de celdas/LD a partir de datos de imagen, y están optimizados para diferentes tipos de celdas, como células metazoanas con grandes LD19,20 , 21, o levaduras en ciernes17,22,23. Algunos de estos enfoques solo funcionan en 2D (por ejemplo, en imágenes de proyección máxima), lo que puede no describir de forma fiable el contenido de LD celular. Hasta nuestro conocimiento, no existen herramientas para la determinación del contenido de LD y la morfología a partir de datos microscópicos de levadura de fesión. El desarrollo de análisis automatizados y robustos a nivel de LD traería mayor sensibilidad y mayor potencia estadística, y proporcionaría información rica sobre el contenido de lípidos neutros, idealmente en múltiples especies de levaduras.
Hemos desarrollado un flujo de trabajo para el análisis de contenido LD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de células de levadura. Las celdas vivas se tiñen con BODIPY 493/503 y Cascade Blue dextran para visualizar los DD y determinar los límites de las celdas, respectivamente. Las células se inmovilizan en diapositivas de vidrio y se someten a imágenes de pila z utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar. Las imágenes son procesadas por una canalización automatizada implementada en MATLAB, un paquete ampliamente utilizado (comercial) para análisis estadísticos. La canalización realiza el preprocesamiento de imágenes, la segmentación (células frente al fondo, la eliminación de celdas muertas) y la identificación de LD. Los datos enriquecidos a nivel de LD, como el tamaño de LD y la intensidad de la fluorescencia, se proporcionan en un formato tabular compatible con las principales herramientas de software de hoja de cálculo. El flujo de trabajo se utilizó con éxito para determinar el impacto de la disponibilidad de la fuente de nitrógeno en el metabolismo de los lípidos en S. pombe24. Ahora demostramos la funcionalidad del flujo de trabajo en S. pombe, S. japonicus y S. cerevisiae,utilizando condiciones de crecimiento o mutantes que afectan el contenido de LD celular.

<table><tbody><tr><td>Cámara CCD monocromática de 12 bits Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Sal de hemisulfato de adenina, &ge; 99%</td><td>Merck</td><td>A9126-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>para la tinción de lípidos neutros</td></tr><tr><td>D-(+) - Glucosa, &ge; 99.5%</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextrano, Azul en cascada, 10.000 MW, Aniónico, Lisina fijable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>para la tinción negativa de células</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, &ge; 99.5%</td><td>Merck</td><td>D4540</td><td>o pureza superior, mantenga anhidro en tamices moleculares</td></tr><tr><td>Caldo EMM sin dextrosa</td><td>Para medio</td><td>PMD0405</td><td>medio también se puede preparar a partir de componentes individuales</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ software</td><td>NIH</td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente; para la inspección visual de datos microscópicos</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de alta precisión, 22 mm x 22 mm, n.º 1,5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>utilizan cualquier cubreobjetos # 1,5</td></tr><tr><td>Image Processing Toolbox for MATLAB, versión 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lectina de Glycine max (soja)</td><td>Merck</td><td>L1395</td><td>para la inmovilización celular en portaobjetos</td></tr><tr><td>Software MATLAB, versión 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio, 26 mm x 76 mm, 1 mm de espesor</td><td>Knittel Glass</td><td>L762601.2</td><td>utilice cualquier portaobjetos de microscopio que se adapte a su platina de microscopio, limpie a fondo antes de cargar las células</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus CellR con movimiento automático del objetivo del eje z</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros Pentaband</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td> campo <td>claro, los canales verde y azul son suficientes</td></tr><tr><td>Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplementos SP</td><td>Formedium</td><td>PSU0101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ordenador de oficina estándar capaz de ejecutar MATLAB&</td><td>nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, versión 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Peptona universal M66 para microbiología</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Objetivo UPLSAPO 60XO</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

El metabolismo de los lípidos y su regulación son de interés tanto para las ciencias básicas y aplicadas de la vida como para la biotecnología. En este sentido, varias especies de levadura se utilizan como modelos en la investigación metabólica de lípidos o para la producción de lípidos industriales. Las gotas lipídicas son cuerpos de almacenamiento altamente dinámicos y su contenido celular representa una lectura conveniente del estado metabólico lipídico. La microscopía de fluorescencia es un método de elección para el análisis cuantitativo de gotas de lípidos celulares, ya que se basa en equipos ampliamente disponibles y permite el análisis de gotas de lípidos individuales. Además, el análisis microscópico de imágenes se puede automatizar, lo que aumenta considerablemente el rendimiento general del análisis. Aquí, describimos un flujo de trabajo experimental y analítico para la detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos individuales en tres especies de levaduras de modelo diferentes: las levaduras de fission Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus, y la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Las gotas de lípidos se visualizan con BODIPY 493/503, y el dextran fluorescente impermeable a la celda se agrega a los medios de cultivo para ayudar a identificar los límites celulares. Las células se someten a microscopía de epifluorescencia 3D en canales verdes y azules y las imágenes de la pila z resultantes se procesan automáticamente mediante una canalización matlab de MATLAB. El procedimiento genera datos cuantitativos enriquecidos sobre el contenido de gotas de lípidos celulares y las características individuales de las gotas de lípidos en un formato tabular adecuado para análisis posteriores en hojas de cálculo principales o paquetes estadísticos. Proporcionamos análisis de ejemplo del contenido de gotas de lípidos bajo diversas condiciones que afectan el metabolismo celular de los lípidos.

Todo el procedimiento se resume en la Figura 1 para las levaduras de fisión (el flujo de trabajo de levadura en ciernes es análogo), y a continuación proporcionamos ejemplos de cómo el flujo de trabajo se puede utilizar para estudiar el contenido de LD en tres especies de levadura diferentes en diversas condiciones conocidas para afectar el contenido de LD celular. Cada ejemplo representa un único experimento biológico.
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Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Este protocolo facilita los análisis cuantitativos a pequeña y gran escala del contenido de lípidos de almacenamiento celular en una variedad de especies de levaduras y lo hace de manera imparcial y estandarizada. La técnica permite el procesamiento rápido de imágenes microscópicas y proporciona salidas cuantitativas detalladas para comparar fácilmente muestras como varios mutantes y células cultivadas bajo diversas condiciones. Para comenzar, siga el protocolo de texto que lo acompaña para preparar las soluciones de tinción, los medios de cultivo y las células.Asegúrese de que las células estén sanas y en la fase de crecimiento deseada antes de ejecutar el experimento. A continuación, prepare un cubreobjetos de microscopio para cada muestra a tomar imágenes. Extienda un microlitro de solución de recubrimiento deslizante en un cubreobjetos limpio utilizando el lado largo de una punta de pipeta colocada horizontalmente.Deje que la solución de recubrimiento se seque por completo y, a continuación, almacene los cubreobjetos en un ambiente libre de polvo. A continuación, medir las densidades ópticas de los cultivos celulares, y para que los cultivos se analicen en la misma fase de crecimiento, tratar de alcanzar valores similares entre todos los cultivos probados para asegurar condiciones experimentales comparables. Luego, pipetear un mililitro del cultivo celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Sólo para las células S.cerevisiae, agregue cinco microlitros de la solución de recubrimiento deslizante al tubo también. Luego, voró brevemente todos los tubos de microcentrífuga, e incubarlos a 30 grados Celsius con temblor durante cinco minutos. A continuación, agregue un microlitro de la solución de tinción de lípidos a cada alícuota de cultivo, y vórtice brevemente.A continuación, agregue 10 microlitros de la solución de visualización de límites de celda y vórqueles brevemente una segunda vez. Recoger las células centrifugando a 1.000 veces la gravedad durante tres minutos a temperatura ambiente. Cuando termine de girar, retire 950 microlitros del sobrenadante y resusppend las celdas en el sobrenadante restante usando una pipeta.A continuación, pipetear dos microlitros de la suspensión de células densas en un cubreobjeto recubierto de lectina. A continuación, coloque el cubreobjetos en una diapositiva de microscopio limpia para formar una monocapa celular y proceda a la microscopía lo más rápido posible para minimizar los artefactos en la toma de imágenes. La configuración del microscopio requiere exposiciones prolongadas a fuentes de luz fuertes que podrían causar daños en la muestra y sesgar los resultados.Por lo tanto, configure las condiciones de imagen utilizando una diapositiva de muestra dedicada que no se utilizará más para la cuantificación de gotas de lípidos. Coloque la muestra dedicada en la etapa de una configuración del microscopio de contraste de fase o de interferencia diferencial y concéntrese en las células. En el software del microscopio, establezca los ajustes de la pila Z para que abarquen todo el volumen de la célula.La distancia vertical total depende del tamaño de la celda y el número de sectores ópticos depende de la apertura numérica del objetivo. A continuación, establezca el foco para que se mueva en relación con el plano focal central. Para crear una imagen de gotas de lípidos, establezca experimentalmente la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal verde.Tenga cuidado al tomar imágenes, ya que BODIPY es un fluorocromo muy brillante que puede ser rápidamente fotoblancada. Además, minimice el tiempo de exposición para evitar la sobresaturación. Capture primero el canal verde completo Z-stack antes de cambiar al canal azul para evitar desenfocar las gotas de lípidos móviles.Para crear una imagen de los límites de las celdas, establezca experimentalmente la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal azul. Si es posible, configure y utilice un flujo de trabajo experimental automatizado en el software de control del microscopio para facilitar la toma de imágenes de varias muestras en condiciones estandarizadas. Es importante destacar que todas las imágenes deben adquirirse utilizando la misma configuración para permitir una comparación adecuada entre muestras.Una vez optimizadas las condiciones de imagen, concéntrese en las celdas e irégenes en los canales verde y azul. Imagine varios campos de vista por muestra para obtener datos sólidos y representativos. Guarde las imágenes de la pila Z del canal azul y verde como archivos TIFF multicapa de 16 bits.Asegúrese de incluir las palabras verde o azul en los nombres de archivo correspondientes. Abra imágenes microscópicas en ImageJ y elimine las pilas de imágenes que contengan un número considerable de celdas que se movieron durante la adquisición. Estos aparecen en diferentes posiciones en secciones Z individuales.A continuación, elimine las pilas de imágenes que contengan partículas no celulares altamente fluorescentes en el canal azul. Esto a menudo es causado por la suciedad en la superficie de la imagen o las impurezas en el medio de cultivo y puede interferir con la detección de células en sus proximidades. Además, elimine las pilas de imágenes que contengan una gran proporción de celdas muertas.Estas imágenes mostrarán celdas con mayor fluorescencia azul en comparación con las células vivas. Si bien la presencia de algunas células muertas en la muestra no suele ser un problema y estas células se descartan automáticamente durante el análisis, algunas células muertas o moribundas ocasionalmente pueden ser reconocidas como células vivas por el algoritmo de segmentación y, por lo tanto, sesgar los resultados notificados. Para comenzar el análisis en MATLAB, primero cree una carpeta principal y copie todos los scripts de MATLAB en esta ubicación.A continuación, cree subcarpetas con los nombres de las distintas especies de levaduras y copie las imágenes TIFF respectivas en estas ubicaciones. Ahora, inicie MATLAB, abra el script MAIN. m, y ejecute el script.En el menú, seleccione las especies de levadura que desea analizar e inicie el procesamiento de imágenes. Inspeccione y procese los archivos de salida según sea necesario mediante un editor de hojas de cálculo o un paquete estadístico. El flujo de trabajo produce archivos CSV separados por punto y coma y archivos TIFF segmentados con objetos de celda detectados y gotas de lípidos.Aquí se muestran células S.pombe de tipo salvaje que se cultivaron en el medio complejo YES o en el medio EMM definido. En comparación con las células cultivadas en el medio YES, se detectaron menos gotas de lípidos y una mayor intensidad de tinción por unidad de volumen celular en el medio EMM. Además, las gotas lipídicas individuales formadas en el medio EMM eran más grandes y mostraban una mayor intensidad total de tinción.Esto está de acuerdo con los hallazgos anteriores de un aumento del contenido de lípidos almacenados en células cultivadas en EMM. A continuación, estas imágenes muestran células S.japonicus de cultivos exponenciales y estacionarios tempranos cultivados en el medio YES. Las células que entraban en fase estacionaria mostraron una disminución notable del número de gotas lipídicas por unidad de volumen celular, mientras que la intensidad de fluorescencia de gotas lipídicas normalizada en volumen disminuyó ligeramente entre las dos condiciones.Las primeras gotas de lípidos en fase estacionaria eran típicamente moderadamente más grandes en tamaño y tenían una intensidad de fluorescencia total moderadamente mayor en comparación con las gotas de las células que crecen exponencialmente. En las células S.cerevisiae cultivadas en fase exponencial versus estacionaria, las células estacionarias contenían algo menos de gotas lipídicas por unidad de volumen en comparación con las células de crecimiento exponencial. Sin embargo, su intensidad de fluorescencia de gotas normalizada por volumen casi se duplicó.Este fuerte aumento en el contenido general de gotas lipídicas se debió a la intensidad de fluorescencia mucho mayor y al volumen de gotas lipídicas individuales en fase estacionaria. Después de este procedimiento, los datos de salida se pueden agregar en un paquete estadístico como R para crear gráficas de resultados resumidos y ejecutar pruebas estadísticas sobre cualquier diferencia observada en el contenido de gotas de lípidos. En principio, la canalización de procesamiento de imágenes se puede utilizar para el análisis del contenido de gotas de lípidos en otros microorganismos o para analizar otras estructuras subcelulares similares a puntos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Aquí, describimos un protocolo para obtener el lípido gotitas índice (LD) para estudiar la dinámica de triacilgliceroles en las células cultivadas en experimentos de alto rendimiento. El ensayo de índice de LD es un método sencillo y fiable que utiliza BODIPY 493/503. Este ensayo no es necesario dispendious extracción o análisis de la microscopia.

Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

Microscopía 4D de levadura

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

El presente estudio describe metodologías basadas en la descelularización para visualizar y cuantificar la deposición de tejido adiposo intramuscular (IMAT) a través del volumen muscular intacto, así como cuantificar las métricas de los adipocitos individuales que componen IMAT.

Cuantificación basada en la descelularización de la infiltración grasa del músculo esquelético

La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.

La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano

La lipofagia es una forma selectiva de autofagia que implica la degradación de las gotas de lípidos. Las disfunciones en este proceso se asocian con el desarrollo del cáncer. Sin embargo, los mecanismos precisos aún no se comprenden completamente. Este protocolo describe enfoques de imágenes cuantitativas para comprender mejor la interacción entre la autofagia, el metabolismo de los lípidos y la progresión del cáncer.

Explorando la regulación del catabolismo de las gotas lipídicas a través de la lipofagia

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprenda a cuantificar gotas de lípidos en levaduras mediante microscopía de fluorescencia y análisis automatizado de imágenes. Este protocolo estandarizado permite evaluar el metabolismo lipídico en Saccharomyces cerevisiae y otras especies.

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

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