Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral
14 de agosto de 2019
Los virus de la gripe A son patógenos respiratorios contagiosos que causan epidemias anuales y pandemias ocasionales. Aquí, describimos un protocolo para rastrear infecciones virales in vivo usando una nueva luciferasa recombinante y bi-reportero expreso de fluorescencia IAV (BIRFLU). Este enfoque proporciona a los investigadores una excelente herramienta para estudiar IAV in vivo.
Los investigadores han generado previamente virus de la gripe recombinante que expresan reporteros de proteínas fluorescentes o bioluminiscentes. Parte de nuestra única expresión de genes reporteros en el virus de la gripe limita severamente su uso en experimentos. Nuestro protocolo describe el uso del virus de la gripe bireporterer que expresa genes de reporteros fluoresntes y bioluminiscentes, y por lo tanto supera su limitación.
La principal ventaja de esta técnica es el uso de un único virus de la gripe recombinante para estudios in vitro e in vivo. Al realizar esta técnica, es importante la inyección rápida de sustrato de luciferasa y la planificación adecuada del manejo de ratones, ya que el sustrato se metaboliza rápidamente. Además, se recomienda el afeitado de ratones para mejorar la detección de señal bioluminiscente.
Para infectar a los ratones, comience preparando el BIRFLU en 1X PBS. Mantener el virus sobre hielo hasta la inoculación. Compruebe la ausencia del reflejo de pellizcar del dedo del dedo para asegurarse de que el ratón está anestesiado, e inocularlo por vía intranasal con la dilución BIRFLU preparada.
Asegúrese de que todos los ratones estén respirando correctamente antes de devolverlos a sus jaulas. Abra el software de imágenes y pulse Inicializar y, a continuación, establezca los parámetros que se utilizarán para la creación de imágenes. Para monitorear a los ratones infectados con BIRFLU, afeite su pecho para mejorar la detección de la señal bioluminiscente.
Una vez que los ratones son anestesiados, utilice una aguja de calibre 22 para administrar retro-orbitalmente 100 microlitros de sustrato de Nluc luciferasa, diluidos de uno a 10 en PBS. Inmediatamente después de la inyección, coloque los animales en la cámara de aislamiento con el pecho hacia arriba. A continuación, coloque la cámara de aislamiento en el instrumento de imagen, cierre la puerta y adquiera imágenes.
Después de la toma de imágenes, devuelva los ratones a sus jaulas y monitoríelos hasta que se hayan recuperado por completo. Utilice la herramienta de ROI del software de imágenes para analizar los datos de bioluminiscencia adquiridos designando una región de interés y haciendo clic en la medida. Para realizar imágenes ex vivo de los pulmones del ratón, recoja los pulmones de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, inicie el software de adquisición de imágenes y establezca los parámetros para la toma de imágenes.
Una vez inicializada la máquina, coloque los pulmones en una bandeja de fondo negra y asegúrese de que los tejidos estén separados entre sí. Introduzca la bandeja en el imager, cierre la puerta y adquiera imágenes. Después de la toma de imágenes, retire los tejidos inmediatamente y guárdelos en hielo a cuatro grados centígrados si las muestras se procesarán el mismo día.
Si se procesan más tarde, congélalos rápidamente en un tubo sobre hielo seco y guárdelos a 80 grados centígrados. Para procesar las imágenes, seleccione la herramienta ROI, dibuje regiones de interés alrededor de cada uno de los pulmones individuales y haga clic en medir. BIRFLU se ha caracterizado in vitro por determinar los niveles de expresión de Venus, Nluc y NP en las células infectadas.
La expresión Venus y Nluc sólo se detectan en células infectadas por BIRFLU, mientras que NP se expresa en células infectadas por PR8 de tipo salvaje y infectadas por BIRFLU. No se observa ninguna expresión en las células infectadas por simulacros. Además, la actividad de Nluc se ha medido en sobrenadantes de cultivo de tejidos a las 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección.
Se detecta tan pronto como 24 horas después de la infección, y los niveles de expresión aumentan a las 96 horas. También se puede demostrar que la cinética de replicación de BIRFLU es comparable al virus PR8 de tipo salvaje. BIRFLU tiene la capacidad de expresar genes de reporteros fluorescentes y bioluminiscentes, y la correlación entre los dos se puede evaluar utilizando imágenes in vivo y ex vivo de un pulmón de ratón.
Los pulmones de ratones infectados con BIRFLU mostraron alta bioluminiscencia in vivo y fluorescencia ex vivo. También se han determinado los títulos virales y la estabilidad genética de BIRFLU in vivo. Los ensayos de placa en los virus de los pulmones de ratón mostraron que el virus puede formar placas y expresar ambos genes de los reporteros.
BIRFLU también podría utilizarse para evaluar la eficacia de los anticuerpos antivirales y neutralizantes contra la gripe. La salida de estos ensayos se correlacionaron entre sí y son rápidas y fáciles de hacer.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para el seguimiento de infecciones por el virus de la influenza A (IAV) in vivo utilizando un novedoso sistema de bi-reporteros, BIRFLU, que expresa tanto luciferasa como fluorescencia. Este enfoque innovador mejora el estudio de la IAV al permitir el análisis simultáneo in vitro e in vivo.
Componentes clave del estudio
Área de la Ciencia
- Virología
- Enfermedades Infecciosas
- Inmunología
Antecedentes
- Los virus de la influenza A son patógenos respiratorios significativos.
- Los virus recombinantes existentes típicamente expresan ya sea reporteros fluorescentes o bioluminiscentes.
- El sistema BIRFLU supera las limitaciones de la expresión de un solo reportero.
- Este método permite el seguimiento integral de las infecciones virales.
Propósito del estudio
- Desarrollar un sistema de doble reportero para un seguimiento mejorado de la IAV.
- Facilitar tanto estudios in vitro como in vivo utilizando un único virus recombinante.
- Evaluar la efectividad de tratamientos antivirales y respuestas inmunes.
Métodos utilizados
- Preparación de BIRFLU en 1X PBS para la inoculación de ratones.
- Inoculación intranasal de ratones con BIRFLU.
- Administración de sustrato de luciferasa para la imagen bioluminiscente.
- Imagen ex vivo de los pulmones de los ratones para evaluar la replicación viral y la expresión del reportero.
Resultados principales
- BIRFLU expresa con éxito tanto reporteros fluorescentes como bioluminiscentes.
- Se observó alta bioluminiscencia y fluorescencia en ratones infectados.
- Los títulos virales y la estabilidad genética fueron confirmados mediante ensayos de placa.
- La cinética de replicación de BIRFLU fue comparable al virus PR8 de tipo salvaje.
Conclusiones
- BIRFLU es una herramienta poderosa para el estudio de las infecciones por la IAV.
- Este sistema de doble reportero puede mejorar la comprensión de la dinámica viral.
- Proporciona una plataforma para evaluar la eficacia antiviral y las respuestas inmunes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
The dual-reporter influenza virus (BIRFLU) enables simultaneous fluorescence and bioluminescence tracking of viral infection, addressing a key limitation in antiviral and vaccine development where single-reporter systems restrict multiplexed readouts. This approach supports mechanistic de-risking by correlating reporter expression with viral replication kinetics, providing predictive confidence in preclinical efficacy studies. The system’s compatibility with in vivo imaging and ex vivo tissue analysis positions it as a translational tool for go/no-go decisions in influenza-targeted therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of virus-host interactions through dual-modality tracking of infection dynamics in live systems.
- Operational Value: Reduces need for parallel assays by combining fluorescent and luminescent readouts in a single virus, improving throughput in target validation workflows.
- Predictive Value: Correlation between Venus and Nanoluc signals with viral titers supports quantitative assessment of antiviral effects, aiding lead compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable, replication-competent virus for consistent signal generation across screening campaigns, minimizing variability from reporter loss.
- Operational Value: Allows ex vivo lung imaging with standardized ROI analysis, enabling reproducible quantification of viral burden across compound treatment groups.
- Scalability: Compatible with plaque assay and titer determination, supporting scalability from primary screening to lead optimization stages.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated genetic stability and comparable replication kinetics to wild-type PR8 ensure relevance of findings to natural infection models.
- Biomarker Alignment: Dual-reporter output allows cross-validation of bioluminescent and fluorescent signals as surrogate markers for viral load in preclinical studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Ability to evaluate antiviral efficacy and neutralizing antibodies in vivo supports data-driven progression decisions, reducing late-stage failure risk.
Pipeline & Workflow Integration
BIRFLU fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where dual-modality imaging supports iterative design-make-test-analyze cycles.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral entry, replication, and host response by enabling real-time tracking of infection in vivo.
- Screening: Facilitates assay readiness through quantifiable bioluminescent and fluorescent outputs compatible with high-content and high-throughput imaging platforms.
- Analytics: Generates correlative datasets (Venus fluorescence, Nanoluc luminescence, viral titers) that enable cross-platform validation and statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro infection metrics to in vivo disease modeling through sustained reporter expression and genetic stability over multiple passages.
- Enterprise Reuse: The BIRFLU backbone can be adapted to express alternative reporters or antigens, supporting platform reuse across multiple influenza strain studies or vaccine vector development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in viral dynamics through synchronized multimodal detection.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization by eliminating well-to-well variability associated with co-infection of separate reporter viruses.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing early, correlated readouts of antiviral activity and immune response in relevant disease models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-parametric efficacy data that inform capital allocation across antiviral and vaccine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, in vivo imaging, and luciferase substrate handling due to rapid metabolite clearance.
- Dependent on access to in vivo imaging systems capable of sequential bioluminescent and fluorescent detection.
- Necessitates standardized animal preparation (e.g., chest shaving, anesthesia monitoring) to ensure signal consistency across cohorts.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of reporter expression levels and imaging depth compensation.
- Practical limitation: The influenza genome’s constrained capacity restricts insert size, limiting the choice of reporter genes to compact variants like Venus and Nanoluc.
