Detección de fusión genética oncogénica mediante reacción en cadena de polimerasa múltiplex anclada seguida de secuenciación de próxima generación

Este protocolo se utiliza para la detección de fusiones genéticas críticamente informativas para muestras de tumores de pacientes. El estado de fusión de docenas de genes se evalúa simultáneamente en un solo ensayo. La ventaja de esta técnica es que puedo identificar fusiones genéticas independientemente de la identidad del socio de fusión a partir de muestras tumorales que han sido procesadas por fijación formulativa.

La detección de cierta fusión génica en la muestra de tumor clínico informa directamente el diagnóstico, pronóstico y selección de tratamiento en muchos tipos de cáncer. Es fundamental comprender que muchas fusiones llamadas por el algoritmo de análisis son artefactos. La tarea más difícil al analizar datos es distinguir entre las llamadas de artefacto y fusión real.

Comience diluyendo el ácido nucleico total para lograr la concentración deseada de ARN. Para cada muestra, transfiera 20 microlitros de la dilución a los tubos de tira de reactivo de cebado aleatorios en un bloque de aluminio pre-refrigerado y mezcle pipeteando arriba y abajo de seis a ocho veces. Gire brevemente las muestras, transfiera todo el volumen a una placa PCR de 96 pozos y selle con película selladora de placas.

Inserte la placa en un termociclador, cubra con la almohadilla de compresión y cierre la tapa. Incubar a 65 grados Celsius durante cinco minutos. Después de la incubación, transfiera todo el volumen del producto de cebado aleatorio en los tubos de tira de reactivo de la primera hebra.

Mezclar en pipeteando hacia arriba y hacia abajo y girar brevemente hacia abajo. Transfiera todo el volumen a una placa PCR de 96 pozos y selle con película RT. Inserte la placa en el termociclador y ejecute la reacción de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.

Realice la síntesis de ADNc de segunda hebra, y la reparación, y el paso de ligadura uno de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y proceda al segundo paso de ligadura. Para numerar el código de barras molecular o los tubos de tira del adaptador MBC, coloque los tubos horizontalmente con bisagras en la parte posterior y utilice un marcador permanente. Tome la placa de purificación del cordón del primer paso de ligadura y transfiera 40 microlitros de cada muestra a los tubos de tira del adaptador MBC, teniendo cuidado de no molestar el pellet del cordón.

Mezclar los reactivos por pipeteo, girar hacia abajo los tubos y transferir todo el volumen a la etapa de ligadura dos tubos de tira de reactivo. Mezcle las muestras, gítelas hacia abajo y colóquelas en un bloque termociclo. Deje la tapa calentada y ejecute el termociclador a 22 grados Centígrados durante cinco minutos, seguido de 4 grados Celsius de retención.

A continuación, prepare las cuentas de limpieza de ligadura mediante el vórtice y la adición de 50 microlitros a un nuevo conjunto de tubos de tira de PCR. Incubar el imán durante un minuto y desechar el sobrenadante. Retire los tubos de tira del imán y resuspendir las perlas en 50 microlitros de tampón de limpieza de ligadura pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Transfiera todo el volumen de la muestra desde el segundo paso de ligadura a la tira de cordón de limpieza de ligadura. Vórtice las muestras para mezclar y dejarlas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Vórtice la muestra una vez a mitad de la incubación.

Después, vórtice las muestras, gítelas hacia abajo e incubar el imán durante un minuto. Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de tampón de limpieza de ligadura fresca. Vórtice para resuspender, girar hacia abajo, y colocar en el imán durante un minuto.

Después de los dos lavados, realice un tercer lavado con agua ultrapura en lugar de tampón. Resuspender las perlas en 20 microlitros de hidróxido de sodio de 5 milímetros y transferir las muestras a una placa PCR de 96 pozos. Coloque la placa en un termociclador con una almohadilla de compresión y ejecútela a 75 grados Centígrados durante 10 minutos, seguido de una retención de 4 grados Centígrados.

Una vez que las muestras se hayan enfriado a 4 grados celsius, coloque la placa sobre un imán durante al menos tres minutos y proceda con la primera PCR. Prepare las reacciones de PCR añadiendo dos microlitros de imprimadores GSP1 a cada pozo de la primera tira de reactivos de PCR. Transfiera 18 microlitros del segundo producto de limpieza de ligadura a los primeros tubos de tiras de reactivos de PCR y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Gire hacia abajo las muestras y transfiéralas a una placa PCR de 96 pozos. Colóquelos en el termociclador y ejecute PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Proceda con la purificación del cordón añadiendo 20 microlitros del producto PCR a una placa de fondo en U llena de 24 microlitros de perlas de purificación por pozo.

Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar y dejar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos, luego incubar la placa en el imán durante dos minutos. Deseche el supernante de las cuentas y lávelos dos veces con 200 microlitros de 70% etanol. Después del lavado final, retire todo el etanol y deje que la muestra se seque durante dos minutos.

Retire la placa del imán y resuspender las perlas en 24 microlitros de 10 milímetros Tris-HCl y pH 8.0. Incubar el imán durante tres minutos y luego volver a colocar la placa sobre el imán durante dos minutos. Comience la cuantificación de la biblioteca preparando de una a cinco diluciones del segundo producto PCR en Tris-HCl de 10 milímetros.

Siga esto por una dilución en serie de 1:199, 1:199 y 20:80 en Tris-HCl de 10 milímetros con 05%polisorbato. Configure la PCR clave añadiendo seis microlitros de mezcla maestra a cada pocómo de una placa óptica de 96 pocillos, seguido de cuatro microlitros de la dilución o estándar apropiado. Gire hacia abajo la placa y cárguelo en el instrumento qPCR.

Realice qPCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Una vez completada la cuantificación de la biblioteca, diluya todas las bibliotecas a dos nanomolares con Tris-HCl de 10 milímetros. Haga una piscina de biblioteca combinando 10 microlitros de cada biblioteca normalizada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, prepare la biblioteca de amplión desnaturalada, o piscina DAL, combinando 10 microlitros de la piscina de la biblioteca con 10 microlitros de hidróxido de sodio normal 0,2 e incubando la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, añadir 10 microlitros de 200 milímetros Tris-HCl a pH 7.0, seguido de 970 microlitros de HT1 Hybridization Buffer. Haga el tubo de carga final combinando 300 microlitros de HT1, 25 microlitros de 20 picomolar PhiX y 675 microlitros de la piscina DAL.

Agregue todo el volumen del tubo de carga al pozo de muestra del cartucho de reactivo del secuenciador y cargue el cartucho en el secuenciador. Comience seleccionando la muestra de control positivo y asegúrese de que todas las fusiones esperadas e isoformas oncogénicas se han detectado y se enumeran en la pestaña de evidencia sólida. Para cada ejemplo, inspeccione el promedio de sitios de inicio únicos por valor de control GSP2 y, a continuación, visualice las lecturas auxiliares para cada fusión potencial haciendo clic en el vínculo Visualizar que lleva al usuario a una vista JBrowse basada en web de amontonamientos de lecturas de soporte de fusión individuales.

Confirme que las lecturas están en su mayoría libres de discordancia, pero más de 30 bases de las lecturas se alinean con el socio de fusión, y que las secuencias adyacentes al punto de interrupción entre los genes y los sitios de unión de imprimación están libres de inserciones o eliminaciones. Es fundamental asegurarse de que cada fusión de llamadas esté generalmente libre de desalineación y que una parte significativa de las lecturas se alinee con el socio de fusión. Este protocolo se ha utilizado para investigar el estado de fusión genética en una muestra de adenocarcinoma pulmonar.

El resumen muestra fuertes fusiones de evidencia y la página Leer estadísticas muestra las métricas del ejemplo. Esta muestra muestra una buena calidad de ARN por lo que se notificarían resultados negativos si no se encontraran fusiones. Una llamada de fusión legítima tiene un alto número de lecturas de soporte, un alto porcentaje de lecturas de la imprimación que soporta la fusión y un gran número de sitios de inicio.

La visualización de las lecturas muestra una buena alineación con las regiones grandes del socio de fusión. Por el contrario, una llamada de fusión artefacto tiene métricas de soporte más bajas y una alta tasa de error al asignar al asociado. Las llamadas de fusión artefacto realizadas por el algoritmo de análisis son comunes.

Es fundamental inspeccionar manualmente cada llamada para asegurarse de que representa una fusión genética real en la muestra del paciente.