Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón
September 13th, 2019
Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de las células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, la formación y el tratamiento de la tumoresfera y el trasplante de aloinjertoado a partir de cultivos de tumoresferas.
El rabdomiosarcoma es una forma rara de sarcomas de tejido blando caracterizados histológicamente por morfología tisular y la expresión de marcadores miogénicos. Sin embargo, dada la existencia de diferentes subtipos de estos tumores y la heterogeneidad de los estímulos que contribuye a su formación, la identificación de la célula de origen ha sido muy difícil. Aquí describimos métodos reproducibles y confiables para la identificación de la célula de origen de los rabdomiosarcomas a partir de tejidos tumorales recién cosechados de ratones y este ensayo es el ensayo de formación de la tumorsfera.
Las principales ventajas del ensayo de formación de tumoresfera es que se basa en propiedades celulares que se sabe que están presentes en las células originarias de tumores y también se puede utilizar para la expansión y el enriquecimiento de la población celular específica. Además, su estructura esferoide imita el entorno tumoral, por lo que se pueden utilizar como estudios de detección de fármacos. Este método tiene el potencial de ser aplicado a otros tipos de tumores porque no requiere conocimiento previo de marcadores moleculares, pero puede requerir la optimización de las condiciones de cultivo.
La tumoral puede tardar algún tiempo en formarse, especialmente si se trata de identificar una población de células raras dentro del tumor. Por lo tanto, no se sugiere mirar su placa de subcultura todos los días, ya que podría afectar negativamente los resultados de sus experimentos. Comience calentando una placa de 10 centímetros con cinco mililitros de medios de aislamiento en una incubadora a 37 grados centígrados.
Pesar de 500 a 1.000 miligramos del tejido tumoral y colocarlo en el plato. Lleve la placa con el tejido tumoral a una capucha de cultivo estéril y úsela con una cuchilla de afeitar. Para una digestión óptima, asegúrese de que los tamaños de las piezas picadas sean uniformes.
Transfiera el tejido picado y los medios de aislamiento celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Lave la placa con otros cuatro mililitros de medios y agréguelo al tubo. Añadir 700 unidades por mililitro de solución de colagenasa al tubo e incubarlo en un baño de agua agitada a 37 grados centígrados durante 1 hora y media.
Después de la incubación, gire hacia abajo el tejido a 300 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante sin interrumpir el pellet, luego resuspender el pellet en 10 mililitros de segunda solución de digestión e incubar en el baño de agua de agitación durante 30 minutos más. Después de la segunda digestión, pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo y páselo a través de un filtro de nylon de 70 micrómetros en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
A continuación, lave el filtro con 10 mililitros de medios de aislamiento celular y gire hacia abajo el tejido a 300 g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 20 mililitros de medios celulares tumorales. Transfiera la suspensión a una placa de cultivo de 15 centímetros y coloque las células en una incubadora de 37 grados Celsius durante la noche.
Al día siguiente, cambie los medios para eliminar los desechos y las células muertas que pueden influir negativamente en la supervivencia celular. En este punto, evaluar la confluencia celular y permitir que las células crezcan en la incubadora hasta que alcance el 90%Monitorear las células todos los días y cambiar los medios cada dos días. Para la derivación de tumoresfera, utilice células en el Pasaje P1 o P2 para evitar la selección celular a través de múltiples pasajes.
Lave el plato celular con PBS y luego cúbralo con solución de desprendimiento. Colóquelos en la incubadora durante cinco a 10 minutos y luego confirme el desprendimiento mirando la placa bajo un microscopio de campo brillante. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue medios celulares tumorales a la placa y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo.
Gire las células hacia abajo a 300 veces g durante cinco minutos, elimine el sobrenadante y resuspendir las células en los medios de la tumorsfera. Después de resuspender las células, contarlas usando el azul de Trypan y calcular la concentración celular. Dora el número adecuado de células en una placa de baja fijación de 96 pozos y coloca las células en la incubadora hasta el final del experimento, teniendo cuidado de no perturbar la placa a menos que se repongan los medios.
Después de completar el experimento, identifique las tumoresferas manualmente bajo un microscopio de campo brillante o utilizando el software Celigo. El número y el tamaño de las tumoresferas se pueden evaluar como resultado de este ensayo. Para preparar las tumoresferas para el trasplante de aloinjerto, reúna todas las tumoresferas obtenidas de un tipo o tratamiento celular específico.
Centrifugar las tumoressferas y quitar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de un milímetro seguida de una pipeta de 200 microlitros, luego lavarlos con 10 mililitros de PBS estéril. Vuelve a girar las tumoresferas y aspira la PBS. Añadir 500 microlitros a un mililitro de solución de desprendimiento celular en la parte superior del pellet de la tumorsfera e incubar las células en un baño de agua agitado a 37 grados centígrados.
Compruebe la progresión de la digestión cada 10 minutos. Todo el proceso tarda hasta 30 minutos. Si la digestión de la tumorsfera en el baño de agua agitado no es suficiente para obtener una solución de una sola célula, se sugiere una interrupción mecánica a través de pipeteo arriba y abajo.
Tenga en cuenta que después de girar las tumoresferas no forman un pellet estable, por lo que aspirar el sobrenadante debe hacerse cuidadosamente con una pipeta de un mililitro y pipetas de 200 microlitros. Una vez que se obtiene una solución de una sola célula, agregue un volumen de medios celulares tumorales y gríchelo a 300 veces g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Después de esta centrifugación, todos los pasos posteriores deben realizarse en hielo.
Resuspenda las células en medios celulares tumorales fríos y cuente las células vivas usando la exclusión azul de Trypan. Determinar el número adecuado de células para el aloinjerto y diluirlo en 50 microlitros de medios celulares tumorales fríos. Coloque una punta de pipeta en medios de células tumorales frías para enfriarla y luego úsela para tomar 50 microlitros de solución de ECM frío y agréguelo al tubo con células, asegurándose de no extraer el tubo ECM del hielo durante este proceso.
Mantenga las células sobre hielo hasta el trasplante y coloque una jeringa de insulina de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 29 sobre hielo. Después de confirmar que el ratón ha sido anestesiado correctamente, afeite el lado derecho del animal, aspire la solución celular en la jeringa enfriada e inyecte las células por vía subcutánea en el área afeitada. Si la inyección se realiza correctamente, se formará una protuberancia visible debajo de la piel.
Este protocolo se puede utilizar para formar tumoresferas de forma fiable para la identificación de poblaciones de células raras que son responsables del desarrollo del sarcoma de tejido blando. Una parte fundamental de este ensayo es la discriminación entre las tumoresferas y los grupos celulares, que presentan claras diferencias morfológicas. Para determinar la concentración óptima a la que una proteína de interés desencadena un efecto sobre las células tumorales, es necesario evaluar el nivel de expresión de los objetivos posteriores de la proteína.
Tres de los genes analizados mostraron una respuesta dependiente de la dosis al tratamiento de proteínas recombinantes y uno no. Con el fin de establecer un protocolo eficaz, se analizaron los efectos de la transfección en las células tumorales inherentes; se analizaron dos cantidades diferentes de reactivos y se evaluó la eficiencia con un plásmido de la GFP-reportero. Las cantidades más bajas de reactivo resultaron en una mayor eficiencia de transfección.
Se tuvo que implementar un protocolo de dos pasos para realizar la transfección en las células en suspensión. La transfección se realizó en las células adherentes y 24 horas más tarde fueron desprendidas y chapadas en suspensión;después de siete días, las tumoresferas controladas expresaban la GFP. Después de obtener, tratar y trasplantar tumores, es posible comparar el efecto de este tratamiento diferente en el crecimiento tumoral in vivo.
Estos métodos permitirán a los científicos responder a las preguntas todavía permanentes de la célula de origen del rabdomiosarcomas y, al mismo tiempo, establecer las bases para la detección de fármacos.
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Visión general
Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, formación y tratamiento de tumorsferas, así como trasplante alogénico a partir de cultivos de tumorsferas. La prueba de formación de tumorsferas se destaca por su capacidad para imitar el entorno tumoral y facilitar estudios de cribado de fármacos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Biología celular
Antecedentes
- El rabdomiosarcoma es un sarcoma de tejidos blandos poco común.
- Se caracteriza por una morfología de tejido específica y marcadores miogénicos.
- Existen desafíos en la identificación de la célula de origen debido a la heterogeneidad tumoral.
- Se utilizan tejidos tumorales recién recolectados de ratones para el estudio.
Propósito del estudio
- Identificar la célula de origen de los rabdomiosarcomas.
- Establecer un método confiable para la formación de tumorsferas.
- Permitir el cribado de fármacos utilizando modelos de tumorsferas.
Métodos utilizados
- Aislamiento de células primarias de rabdomiosarcoma de ratón.
- Formación de tumorsferas a partir de células aisladas.
- Tratamiento de tumorsferas con varios agentes.
- Trasplante alogénico de tumorsferas en ratones.
Principales resultados
- Aislamiento y cultivo exitosos de células primarias de rabdomiosarcoma.
- Formación de tumorsferas que imitan el microambiente tumoral.
- Potencial para aplicaciones de cribado de fármacos utilizando modelos de tumorsferas.
- Método aplicable a otros tipos de tumor con optimización.
Conclusiones
- La prueba de formación de tumorsferas es una herramienta valiosa para el estudio del rabdomiosarcoma.
- Este método puede mejorar nuestra comprensión de la biología tumoral.
- Ofrece una plataforma para probar agentes terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Identifying rare tumorigenic cell populations in rhabdomyosarcoma remains a critical challenge in pediatric oncology drug discovery. The tumorsphere assay enables functional enrichment of these populations, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides a predictive model for evaluating therapeutic candidates and prioritizing leads with higher translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating rare tumor-initiating cells from primary mouse RMS tissues.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional assessment of tumorigenic potential in vitro and in vivo.
- Scientific Value: Facilitates pathway clarification by linking recombinant protein treatment to downstream target expression in tumorspheres.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reproducible, low-attachment spheroid model that mimics the tumor microenvironment for compound screening.
- Operational Value: Enables standardized quantification of tumorsphere number and size as dose-dependent readouts for drug response.
- Scientific Value: Supports assay scalability by allowing transfection integration and controlled gene expression studies in suspension cultures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from in vitro tumorsphere formation to in vivo allograft validation of tumorigenic function.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating in vitro treatment effects with in vivo tumor growth outcomes.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by requiring dose-dependent downstream target modulation as a biomarker of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The tumorsphere assay integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling iterative de-risking of RMS therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating and enriching rare tumorigenic populations based on functional, not marker-dependent, properties.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized tumorsphere formation in low-attachment plates with quantifiable morphological endpoints.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (tumorsphere count, size, GFP reporter expression) enabling condition comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation via allograft transplantation of treated tumorspheres to assess in vivo tumorigenicity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform applicable across RMS subtypes and adaptable to other tumor types with culture condition optimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through functional tumorigenic assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined digestion, plating, and quantification protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking in vitro tumorsphere modulation to in vivo allograft outcomes, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating dose-dependent effects on tumorsphere formation and downstream target expression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue dissociation, sterile cell culture, and spheroid morphology assessment.
- Dependent on low-attachment culture plates, shaking water baths, centrifuges, and brightfield or Celigo imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of tumorsphere scoring criteria to ensure reproducibility across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different tumor types, particularly in optimizing collagenase concentration and digestion time.
- Includes practical limitations such as extended culture duration for rare population enrichment and avoidance of frequent plate disturbance to maintain spheroid integrity.
