Name: Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a derivar y tratar tumorsferas a partir de células primarias de rabdomiosarcoma de ratón. Este método permite identificar la célula de origen tumoral y facilita el cribado de fármacos in vitro e in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por la beca AG-NS-0843-11 de Ellison Medical Foundation y la Beca Piloto NIH dentro de la Subvención de Apoyo del Centro OnCI para el Cáncer P30CA030199 a A.S.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Se han empleado múltiples métodos para el aislamiento y caracterización de los TPC de las poblaciones de células heterogéneas tumorales: ensayos clonogénicos tumorales, aislamiento FACS y ensayo de formación de tumoresfera. El ensayo clonogénico tumoral fue descrito por primera vez en 1971, utilizado para estudios con células madre, y sólo se aplicó posteriormente a la biología del cáncer29,30. Este método se basa en la propiedad intrínseca de las células madre c...

El cáncer es una enfermedad heterogénea; además, el mismo tipo de tumor puede presentar diferentes mutaciones genéticas en diferentes pacientes, y dentro de un paciente un tumor está compuesto por múltiples poblaciones de células1. La heterogeneidad presenta un desafío en la identificación de las células responsables de iniciar y propagar el cáncer, pero su caracterización es esencial para el desarrollo de tratamientos eficientes. La noción de células propagantes tumorales (TPC), una población rara de células que contribuyen al desarrollo tumoral, ha sido previamente ampliamente revisada2. A pesar de que los TPM se han caracterizado en múltiples tipos de cáncer, la identificación de marcadores para su aislamiento fiable sigue siendo un desafío para varios tipos de tumores3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. Por lo tanto, un método que no se basa en marcadores moleculares, sino más bien en las propiedades funcionales de TPC (alta auto-renovación y la capacidad de crecer en condiciones de baja fijación), conocido como el ensayo de formación de tumoresfera, puede ser ampliamente aplicado para el identificación de los TPC de la mayoría de los tumores. Es importante destacar que este ensayo también puede emplearse para la expansión de los Tpm y, por lo tanto, se aplica directamente a la detección de fármacos contra el cáncer y estudios sobre la resistencia al cáncer1,10.
El rabdomiosarcoma (RMS) es una forma rara de sarcoma de tejido blando más común en niños pequeñosde 11años. Althoug RMS se puede identificar histológicamente a través de la evaluación de la expresión de marcadores miogénicos, la célula de origen RMS no se ha caracterizado unívocamente debido a los múltiples subtipos tumorales y alta heterogeneidad de los estímulos de desarrollo tumoral. De hecho, estudios recientes han generado una discusión científica significativa sobre si el RMS es de origen miogénico o no miogénico, lo que sugiere que el RMS puede derivar de diferentes tipos de células dependiendo del contexto12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Se han realizado numerosos estudios sobre líneas celulares RMS empleando el ensayo de formación de tumoresfera para la identificación de vías implicadas en el desarrollo tumoral y caracterización de marcadores asociados a poblaciones altamente auto-renovables 18 , 19 , 20 , 21.
Sin embargo, a pesar del potencial del ensayo de formación de tumoresfera para identificar células RMS de origen, aún no se ha descrito un método confiable que pueda emplearse en células primarias de RMS. En este contexto, un estudio reciente de nuestro grupo empleó un ensayo optimizado de formación de tumoresfera para la identificación de las células RMS de origen en un ratón de distrofia muscular de Duchenne (DMD) modelo22. Múltiples tipos de células pretumigenas, aisladas de los tejidos musculares, se prueban por su capacidad para crecer en condiciones de baja fijación, permitiendo la identificación de células madre musculares como células de origen para RMS en contextos distróficos. Aquí se describe un protocolo reproducible y fiable para el ensayo de formación de la tumoresfera(Figura 1), que se ha empleado con éxito para la identificación de poblaciones celulares extremadamente raras que son responsables del desarrollo de RMS de ratón.

<table><tbody><tr><td>Reactivo de disociación celular Accutasa</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Separe las células adherentes y disocie las tumoresferas</td></tr><tr><td>Celigo</td><td>Nexcelom</td><td>Celigo</td><td>Citómetro de imagen basado en placa de micropocillos para células adherentes y en suspensión</td></tr><tr><td>Colagenasa, Tipo II</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td>Enzima de digestión tisular</td></tr><tr><td>Dispasa II, proteasa</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>Enzima de digestión tisular</td></tr><tr><td>DMEM medio de alto contenido glucémico</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Componente de las células tumorales medio</td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medios</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Componente de los medios de la tumosfera</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>S312500</td><td>Componente del tampón FACS</td></tr><tr><td>EGF proteína de ratón recombinante</td><td>Gibco</td><td>PMG8041</td><td>Componente de los medios</td></tr> <tr><td>de la tumosferaFACSAria II Citometría de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>650033</td><td>Clasificador de células activadas fluorescentes</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td>Componente de las células tumorales Medios</td></tr><tr><td>Fluriso (Isofluornae) agente anestésico</td><td>MWI Vet Supply</td><td>502017</td><td>Reactivo anestésico para animales</td></tr><tr><td>FxCycle Violet Stain</td><td>Life Technologies</td><td>F10347</td><td>Discriminar células vivas y muertas</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210072</td><td>componente del tampón FACS</td></tr><tr><td>F10 Media</td><td>Life Technologies</td><td></td> de Ham's <td>Componente 11550043 del tampón FACS</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16050114</td><td>Componente de los medios de aislamiento celular</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Lipofectamine 3000 Reactivo</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de transfección ThermoFisher L3000015Matriz de membrana Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB40234</td><td>Proporciona soporte a las células trasplantadas</td></tr><tr><td>N-2 Supplemtns (100X)</td><td>Gibco</td><td></td><td>17502048 Componente de los medios de la tumosfera</td></tr><tr><td>Neomicina-Polimixina B Sulfatos-Bacitracina Zinc Pomada oftálmica</td><td>MWI Vet Supply</td><td>701008</td><td>Ungüento para los ojos PBS</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Componente del tampón FACS y utilizado para lavar las células</td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Addgene</td><td>6084-1</td><td>GFP plásmido</td></tr><tr><td>Penicilina - Estreptomicocina</td><td>Life Technologies</td><td>15140163</td><td>Componente de la tumosfera y las células tumorales</td></tr><tr><td>medios Recombinantes Humanos y beta; FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>10018B</td><td>Componente de los medios de tumosfera</td></tr><tr><td>Ratón recombinante Flt-3 Ligando Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>427-FL-005</td><td>Proteína recombinante</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>Discriminar células vivas y muertas</td></tr></tbody></table>

derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de rhabdomyosarcomas de ratón

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

El rabdomiosarcoma (RMS) es el sarcoma de tejido blando más común en niños. Aunque los esfuerzos significativos han permitido la identificación de mutaciones comunes asociadas con la RMS y han permitido la discriminación de diferentes subtipos de SRM, todavía existen grandes desafíos para el desarrollo de nuevos tratamientos para mejorar aún más el pronóstico. Aunque se identifica por la expresión de marcadores miogénicos, todavía hay una controversia significativa sobre si el RMS tiene orígenes miogénicos o no miogénicos, ya que la célula de origen todavía se entiende mal. En el presente estudio, se proporciona un método fiable para el ensayo de tumoresfera para rmS de ratón. El ensayo se basa en las propiedades funcionales de las células tumorales y permite la identificación de poblaciones raras en el tumor con funciones tumorigénicas. También se describen los procedimientos para analizar proteínas recombinantes, integrar protocolos de transfección con el ensayo de tumoresfera y evaluar los genes candidatos implicados en el desarrollo y crecimiento tumoral. Además, se describe un procedimiento para el trasplante de tumoresferas de aloinjertos en ratones receptores para validar la función tumorigénica in vivo. En general, el método descrito permite la identificación y prueba fiables de poblaciones tumorigénicas RMS raras que se pueden aplicar a los RMS que surgen en diferentes contextos. Por último, el protocolo se puede utilizar como una plataforma para la detección de drogas y el desarrollo futuro de terapias.

Detección de tumoresferas El aislamiento celular se optimizó para obtener la máxima heterogeneidad de las poblaciones celulares presentes en el tejido tumoral. En primer lugar, dado que los tejidos aislados presentaban áreas morfológicamente diferentes, para aumentar las posibilidades de aislar poblaciones uniformes de células raras, se realizó un muestreo de múltiples áreas del tumor(Figura 1A,primer panel a la izquierda). En segundo luga...

Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de las células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, la formación y el tratamiento de la tumoresfera y el trasplante de aloinjertoado a partir de cultivos de tumoresferas.

Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

El rabdomiosarcoma es una forma rara de sarcomas de tejido blando caracterizados histológicamente por morfología tisular y la expresión de marcadores miogénicos. Sin embargo, dada la existencia de diferentes subtipos de estos tumores y la heterogeneidad de los estímulos que contribuye a su formación, la identificación de la célula de origen ha sido muy difícil. Aquí describimos métodos reproducibles y confiables para la identificación de la célula de origen de los rabdomiosarcomas a partir de tejidos tumorales recién cosechados de ratones y este ensayo es el ensayo de formación de la tumorsfera.Las principales ventajas del ensayo de formación de tumoresfera es que se basa en propiedades celulares que se sabe que están presentes en las células originarias de tumores y también se puede utilizar para la expansión y el enriquecimiento de la población celular específica. Además, su estructura esferoide imita el entorno tumoral, por lo que se pueden utilizar como estudios de detección de fármacos. Este método tiene el potencial de ser aplicado a otros tipos de tumores porque no requiere conocimiento previo de marcadores moleculares, pero puede requerir la optimización de las condiciones

tumorsphere-derivation-treatment-from-primary-tumor-cells-isolated

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo describe el aislamiento, el enriquecimiento y mantenimiento de las células madre tumorales meduloblastoma derivados de ratones mutantes con ectópico actividad de la vía sonic hedgehog.

Aislamiento, enriquecimiento y mantenimiento de las células madre meduloblastoma

Se describe un método para propagar los tumores humanos en ratones retinoblastoma. Las células tumorales se inyectan directamente en los ojos de ratones inmunes deficientes. Los tumores secundarios se han establecido con éxito utilizando las células cosechadas directamente de tumores humanos y tumorspheres cultivadas.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.

El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

La presencia de células madre del cáncer (CSC) en sarcomas óseos se ha vinculado recientemente a su patogénesis. En este artículo, presentamos el aislamiento de células madre cancerosas a partir de cultivos celulares primarios obtenidos de biopsias humanas de osteosarcoma convencional (OS) utilizando la capacidad de las células madre cancerosas de crecer bajo condiciones no adherentes.

Establecimiento de Cultivos Celulares del Cáncer Humano de osteosarcoma convencional Tallo

El siguiente protocolo se centra en el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente (STS). Este modelo podría ayudarnos a entender mejor el fondo molecular y perfil farmacológico de estos raros tumores malignos y podría representar un punto de partida para futuras investigaciones destinadas a mejorar la gestión de STS.

Establecimiento de un cultivo primario de Sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente

Describimos un protocolo detallado para el aislamiento de células que inician tumores de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma humano mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, utilizando el antígeno leucocito humano-1 (HLA-1) como marcador negativo, y para la validación y caracterización de estas células que inician tumores HLA-1 negativos.

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

El objetivo de esta metodología es identificar células madre cancerosas (CSC) en líneas celulares cancerosas y muestras de tumores humanos primarios con el protocolo de formación de esferas, de manera robusta, utilizando ensayos funcionales y caracterización fenotípica con citometría de flujo y occidental Blot.

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

En este protocolo, describimos un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejido blando para la prueba (neo)terapias adyuvantees.

Un modelo de ratón de sarcoma de tejido blando insegurado incompletamente para terapias adyuvante de pruebas (Neo)

Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.

Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso

Aquí se presenta un protocolo para usar hipertermia controlada, generada por ultrasonido enfocado de alta intensidad guiado por resonancia magnética, para desencadenar la liberación de fármacos de liposomas sensibles a la temperatura en un modelo de ratón rabdomiosarcoma.

Hipertermia generada por ultrasonido focalizado de alta intensidad guiada por resonancia magnética: un método de tratamiento factible en un modelo de rabdomiosarcoma murino

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Aprenda a derivar y tratar tumorsferas a partir de células primarias de rabdomiosarcoma de ratón. Este método permite identificar la célula de origen tumoral y facilita el cribado de fármacos in vitro e in vivo.

Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón

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