Name: Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende técnicas de inoculación de blastosporos de Metarhizium y recolección de hemolinfa en garrapatas Rhipicephalus microplus para estudiar respuestas inmunes y desarrollar métodos alternativos de control biológico.

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Este estudio fue financiado en parte por el Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível superior (CAPES) de Brasil, código de finanzas 001. La CAPES proporcionó una beca de doctorado para A.F. Marciano. Agradecemos al Consejo Nacional de desarrollo científico y tecnológico (CNPq) de Brasil por proporcionar una beca de doctorado para J. Fiorotti. Esta investigación también fue apoyada por becas de la Fundación Carlos Chagas Filho para la investigación del estado de Río de Janeiro (FAPERJ) y CNPq. V.R.E.P. Bittencourt es un investigador CNPq.

Las garrapatas utilizadas en el presente estudio se obtuvieron de una colonia artificial, mantenida en la Universidad Federal rural de Río de Janeiro, que los métodos han sido aprobados por el Comité de ética para el uso de animales vertebrados (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Marque las hembras engorgadas
<ol><li>Después de la recolección de garrapatas, lavar las hembras engorgadas con agua del grifo y sumergir en 0,5% (v/v) solución de hipoclorito sódico durante 3 min en un recipiente de vaso de vidrio 500 mL, para la higiene de cutícula (figura 1), luego secar todas las hembras usando toallas de papel estériles (figura 2).</li>
	<li>Divida las hembras en grupos ponderados homogéneos (con 20 hembras cada uno): un grupo sin tratamiento, un grupo de control inoculado con 5 μL de 0,1% de solución acuosa de monooleato de polioxietileno sorbitán (v/v), y un grupo infectado inoculado con 5 μL a 1,0 x 10 7 blastosporos ml-1. Nota: solo se utilizaron garrapatas no tratadas para la concentración de volumen y hemocitos. Se realizaron tres réplicas de cada grupo.</li>
</ol>2. la inoculación de patógenos entre el Scutum Logistic y el capitulum
Nota: en el presente estudio se utilizaron como ejemplo suspensiones fúngicas entomopatógenas.
<ol><li>Suspender las blastosporas fúngicas en 1 mL de una solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v) y ajustarse a una concentración final de 1,0 x 107 Blastosporos ml-1. Añadir una alícuota de 5 μL de la suspensión de Metarhizium blastosporos (figura 3) a la superficie de una película plástica de parafina. Nota: la suspensión de Metarhizium blastosporos se ajustó utilizando la cámara de Neubauer. Para acelerar el proceso de inoculación, se pueden añadir múltiples burbujas a la superficie de película de parafina plástica, cada burbuja correspondiente a 5 μL.</li>
	<li>Utilice una jeringa de insulina ultra fina de 1 mL y una aguja de 0,3 mm para tirar de la suspensión e inocularla en la garrapata. Recuerde sacar todo el aire de la jeringa antes de usarlo.</li>
	<li>Inocular 5 μL de suspensión fúngica en la garrapata hembra entre el Scutum Logistic y el capitulum. Inocular a las hembras del grupo de control con 5 μL de solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v) sin hongos. Nota: un pequeño volumen de hemolinfa puede estar presente en el agujero después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no vacunar el aire.</li>
</ol>3. inoculación de hongos entomopatógenos entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata
<ol><li>Inocular las hembras con suspensión fúngica (5 μL a 1,0 x 107 blastosporos ml-1) entre el Tigh de la pierna y el cuerpo de la hembra, utilizando una jeringa de insulina ultra fina de 1 ml acoplada a una aguja de 0,3 mm. Vacunar a las hembras del grupo de control con 5 μL de solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v). Nota: cuando se realiza la inoculación de Metarhizium blastosporos entre el Tigh de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, puede presentarse un pequeño volumen de hemolinfa en el Tigh después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no vacunar el aire.</li>
</ol>4. colección de hemolinfa dorsal
<ol><li>Utilice la parte de goma de un conjunto de infusión alada, un tubo capilar de 0,3 mm y una punta filtrada para realizar la colección de hemolingh.</li>
	<li>Interrumpir la cutícula dorsal femenina con una aguja de 0,3 mm.</li>
	<li>Después de la interrupción, aplique una presión suave en la parte anterior del cuerpo de la garrapata. Observe un líquido casi transparente tirando del sitio de interrupción. Recoja la hemolinfa chupando el líquido a través de la punta del filtro acoplado a la parte de goma de un conjunto de infusión alada, y un tubo capilar de 0,3 mm. Nota: no presione el cuerpo de la garrapata difícilmente durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el intestino medio y contaminar la hemolymph. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el fluido sin contaminar.</li>
</ol>5. colección hemolymph de la pata de la garrapata
<ol><li>Inmovilizar la garrapata, cortar un trozo de una pata delantera con un par de tijeras. Nota: una o más patas se pueden cortar, así como, la misma pierna se puede cortar más de una vez.</li>
	<li>Aplique una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observar una burbuja líquida transparente que aparece en el sitio de corte y recogerla con el tubo capilar, como se describe en el paso 4,3. Nota: no presione el cuerpo de la garrapata difícilmente durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el intestino medio y contaminar la hemolymph. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el fluido sin contaminar.</li>
</ol>6. procesamiento de hemolymph
<ol><li>Tras la recolección de hemolinfa, deposite en microtubos de 1,5 ml previamente rellenos con 30 μl de Cóctel proteasa y 82 μl de tampón salino. Mantenga los microtubos en hielo a lo largo de la colección de hemolinfa.</li>
	<li>Centrifugadora de muestras (500 x g durante 3 min a 4 ° c). Se formará un pellet blando de hemocitos después de la centrifugación de hemolafila. Nota: para la cuantificación de la hemolésica, cuantificar el volumen hemolúh obtenido contando el volumen total dentro del microtubo y descontando el volumen de Cóctel de proteasa y tampón salino.</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante (hemolymph libre de células). Resuspende suavemente las células en, por ejemplo, la cultura L-15 de Leibovitz ajustada a pH 7,0-7.2. Cuantificar los hemocitos colocando 10 μL de hemocitos resuspendido en una cámara Neubauer.</li>
</ol>7. preparación de la diapositiva de muestreo de hemocitos
<ol><li>Corta la pata delantera de la garrapata con un par de tijeras.</li>
	<li>Aplique una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observe una burbuja líquida transparente que aparece en el sitio de corte.</li>
	<li>Aplicar las gotas de hemolinfa directamente en las diapositivas de microscopio limpias, después de eso, utilizar métodos apropiados para manchar las células.<ol>
<li>Para manchar los hemocitos con Giemsa, secar al aire la hemolésica en la corredera durante 30 min, fijarla a temperatura ambiente con metanol durante 3 min, y mancha en la solución de Giemsa (relación 1:9 de la solución tampón de Sorensen, pH 7,2) durante 30 min a temperatura ambiente. Lave las diapositivas con agua corriente para eliminar el exceso de tinte, secar al aire la diapositiva y evaluar las células a 400x en un microscopio óptico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Parasitologia+Veterin%C3%A1ria%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La inoculación de patógenos es útil cuando el estudio tiene como objetivo investigar la acción in vivo de microorganismos en modelos de artrópodos experimentales porque asegura que el patógeno está dentro del huésped. La técnica también se puede aplicar para inocular moléculas como la interferencia de ARN (ARNi). La inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum se considera más fácil de llevar a cabo, pero con frecuencia daña el órgano de Genée deteriorar la viabilidad de los óvulos12,<...

La garrapata del ganado, rhipicephalus microplus, es un ectoparásito hematófago con un enorme impacto negativo en el ganado en las zonas tropicales. Esta garrapata es el vector de agentes patógenos como Babesia bovis, Babesia bigemina, y ANAPLASMA MARGINALE que, combinados con el daño de hemofeeding directo, pueden reducir la producción de leche y carne, causar anemia y finalmente la muerte. Las pérdidas causadas por este ectoparásito se calcularon en 3,24 mil millones dólares anualmente en Brasil1. Se exigen métodos sostenibles y el uso de agentes entomopatógenos se considera una alternativa prometedora para reducir el uso de acaricidas químicos2,3,4.
Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium spp., son enemigos naturales de los artrópodos, incluidas las garrapatas, y algunos aislados pueden utilizarse como biocontroladores. Estos patógenos infectan activamente al huésped a través de la cutícula y colonizan su cuerpo2,5,6. A medida que la infección se desarrolla, las respuestas celulares y humorales son mediadas por el sistema inmunológico de la garrapata. El análisis de la garrapata hemolinfa se divulga como una herramienta útil para evaluar las respuestas inmunitarias después del reto con patógenos7,8.
La respuesta inmunitaria de los artrópodos se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral consiste en procesos de hemaglutinación y producción de proteínas/péptidos antimicrobianos, mientras que la respuesta inmunitaria celular se realiza a través de los hemocitos. Estas células están presentes en la hemolinfa de todos los artrópodos y se reportan para desarrollar un papel expresivo en los estudios que implican la respuesta inmune innata9, ya que está directamente relacionado con los procesos de phagocitosis y encapsulación. En consecuencia, los estudios sobre los hemocitos pueden ayudar a investigar la vía de la muerte y comprender procesos como la autofagia, la apoptosis y la necrosis. En algunos invertebrados como bivalvos, la colección de los hemocitos se enfrenta a limitaciones como la alteración celular, el volumen bajo de hemolécula obtenida y la baja concentración de células recuperadas10. Con mucha frecuencia, dependiendo de la metodología aplicada, se obtiene una concentración reducida de células, afectando directamente a la cuantificación y análisis de las células.
El número de hemocitos circulantes en la hemolafila es variable entre los diferentes artrópodos y puede cambiar en la misma especie debido a diferentes etapas fisiológicas como el sexo, la edad, y la etapa de desarrollo del artrópodo11. Los hemocitos también se pueden encontrar adherida a algunos órganos y se liberan en la circulación justo después del proceso de infección11. Sin embargo, la mayoría de los estudios informaron utilizar insectos, mientras que las garrapatas siguen siendo menos exploradas con respecto a su fisiología y patología. A pesar de la inoculación de patógenos y la recolección de hemolinfa en garrapatas son técnicas menos utilizadas, el establecimiento de métodos estándar ayuda al desarrollo de estudios más precisos.
El objetivo del presente estudio fue comparar los métodos más utilizados para la recolección de hemolinfa y la inoculación de patógenos en garrapatas R. microplus , evaluando la eficacia de la adquisición de hemolágenos y la concentración de hemocitos.

<table><tbody><tr><td>Solución alcalina de hipoclorito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Caucho flexible</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa tinte</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina (aguja)</td><td>BD</td><td>SKU:&nbsp; 324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo L-15 de Leibovitz&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>MARCA</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de Neubauer&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Gibco 15140163</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

divulgar la colección hemolymph y la inoculación de metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Las garrapatas son ectoparásitos hematóviles obligados y rhipicephalus microplus tiene una gran importancia en la medicina veterinaria porque causa anemia, pérdida de peso, depreciación del cuero de los animales y también puede actuar como un vector de varios patógenos. Debido a los costos exorbitantes para controlar estos parásitos, daños al medio ambiente causados por el uso inadecuado de acaricidas químicos, y el aumento de la resistencia contra los parasiticidas tradicionales, control alternativo de las garrapatas, mediante el uso de hongos entomopatógenos, por ejemplo, se ha considerado un enfoque interesante. Sin embargo, pocos estudios han demostrado cómo el sistema inmunológico de la garrapata actúa para luchar contra estos entomopatógenos. Por lo tanto, este protocolo demuestra dos métodos utilizados para la inoculación de entomopatógenos en hembras engorgadas y dos técnicas utilizadas para la recolección de hemológeno y la cosecha de hemocitos. La inoculación de patógenos en la inserción de la pierna en el cuerpo de la hembra de la garrapata permite la evaluación de los parámetros biológicos de las hembras a diferencia de la inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum, que con frecuencia daña el órgano de Genéu. La colección de hemolinfa dorsal produjo una recuperación de mayor volumen que la recogida a través de las piernas. Algunas limitaciones de la recolección y procesamiento de hemolinfa de garrapata incluyen i) altas tasas de alteración de los hemocitos, II) contaminación de la hemolafila con alteraciones en el intestino medio, y III) baja recuperación del volumen de hemolh. Cuando la hemolinfa se recoge a través del corte de la pierna, la hemoléh tarda en acumularse en la abertura de la pierna, favoreciendo el proceso de coagulación. Además, se obtienen menos hemocitos en la colección a través de la pierna en comparación con la colección dorsal, a pesar de que el primer método se considera más fácil de realizar. La comprensión de la respuesta inmune en las garrapatas mediadas por agentes entomopatógenos ayuda a revelar su patogénesis y desarrollar nuevos objetivos para el control de la garrapata. Los procesos de inoculación aquí descritos requieren muy bajos recursos tecnológicos y se pueden utilizar no sólo para exponer las garrapatas a microorganismos patógenos. Del mismo modo, la colección de la hemolafila de garrapata puede representar el primer paso para muchos estudios fisiológicos.

En este artículo se aborda la inoculación y los métodos de recolección de hemolinfa aplicados a las garrapatas. Después de la inoculación entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, un poco de líquido (hemolymph) puede ser secretada durante el proceso; sin embargo, es importante notar que cuando la inoculación está terminada, no hay líquido o tejidos presentes en la punta de la aguja o en el sitio de inoculación, asegurando que la suspensión fúngica fue completam...

El análisis de la hemolinfa de garrapata representa una importante fuente de información sobre cómo algunos patógenos causan enfermedades y cómo las garrapatas responden inmunológicamente a esta infección. El presente estudio demuestra cómo inocular propágulos fúngicos y recolectar hemolinfa de las hembras engorgadas de rhipicephalus microplus .

Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos, Rhipicephalus microplus, popularmente conocido como la garrapata de ganado tiene un enorme impacto económico negativo en el ganado en las áreas tropicales. Además, las crecientes preocupaciones sobre las condiciones ambientales degradadas y las preocupaciones de salud pública causadas por el uso inapropiado de acaricidas químicos y el aumento de la resistencia de las poblaciones de garrapatas a los parásitos tradicionales, están estimulando la investigación sobre métodos de control alternativos, como el uso de hongos entomopatógenos. Estos entomopatógenos infectan activamente los huéspedes artrópodos, a través de su cutícula y colonizan su cuerpo.El artrópodo puede tener diferentes respuestas a la infección fúngica. El sistema inmunitario artrópodo se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral implica el proceso de hemaglutinación y la producción de moléculas antimicrobianas, mientras que los hemocitos median la respuesta inmune celular.La mayoría de los estudios sobre la respuesta inmunitaria artrópoda se notifican utilizando insectos, mientras que las respuestas a las garrapatas permanecen menos exploradas. Además, la inoculación de patógenos y la recolección de hemolímpia de garrapatas son técnicas poco extendidas necesarias para comprender mejor la respuesta inmunitaria del artrópodo. En consecuencia, este video address techniques-used para filmar la inoculación, la colección de hemólimpas y el procesamiento.Dado que la recolección de hemocitos de garrapatas enfrenta algunas limitaciones, como la interrupción de las células, la obtención de un valor bajo de hemolymph y la baja concentración de células recuperadas. Infectar directamente en la configuración y el análisis de las células. Después de la recolección de garrapatas, lave a las hembras engordadas.Use agua del grifo y sumerjala en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% durante tres minutos en un recipiente de vaso de precipitados de vidrio de 500 mililitros. Para la higiene de la cutícula, divida las hembras en grupos homogéneos con 20 hembras cada una. Se realizaron tres réplicas de cada grupo.Metarhizium robertsii blastosporas se utilizaron en el proceso de inoculación. Añadir un líquido de cinco microlitros metarhizium blastospores suspensión a la superficie de una película de parafina de plástico. Para acelerar el proceso de inoculación, se pueden añadir múltiples burbujas a la superficie de película de parafina de plástico, cada burbuja correspondiente a cinco microlitros.Utilice una jeringa de insulina ultrafina de un milímetro y una aguja de 0,3 milímetros para colocar una suspensión e inocularla en la garrapata. Recuerde sacar todo el aire de la jeringa antes de usarla. Inocular 5 microlitros de suspensión de hongos en la garrapata hembra entre el escutum y el capitulo.Un pequeño volumen de hemolymph puede estar presente en el encuadre después de la incisión de la aguja. Tenga cuidado de no inocular el aire. Inocular a las hembras con suspensión de hongos entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra utilizando una jeringa de insulina ultrafina de un mililitro acoplada a una aguja de 0,3 milímetros.Cuando la inoculación de las blastosporas de metarhizium se realiza entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, un pequeño volumen de hemolymph puede estar presente en el muslo después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no inocular el aire. Utilice la parte de goma de una infusión alada establecer un tubo capilar de 0,3 miliimetros y una punta de filtro para realizar la colección de hemolímpido.Interrumpir la cutícula dorsal femenina con una aguja de 0,3 milímetros. Después de la interrupción, aplique una presión suave sobre la parte anterial del cuerpo de la garrapata. Observe una agrupación líquida casi transparente fuera del sitio de interrupción.Recoger la hemolymph chupando el líquido a través de la punta del filtro acoplado a una parte de goma de un conjunto de infusión alado y un tubo capilar de 0,3 milímetros. No presione el cuerpo de la garrapata apenas durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el punto medio y contaminar la hemolímpido. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el líquido sin contaminación.Inmoviliza la garrapata. Corta un trozo de una pierna delantera. Una o más piernas se pueden cortar, así como la misma pierna se puede cortar más de una vez.Aplique una presión suave sobre la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observe que una burbuja líquida transparente aparece en el lado cortado y recójala con el tubo capilar. No presione el cuerpo de la garrapata apenas, durante su movilización porque esto puede interrumpir el punto medio y contaminar la hemolímpido.Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el líquido sin contaminación. Después de la recolección de hemólimpas, depositarlo en 1,5 mililitros microtubo previamente lleno de 30 microlitros de cóctel proteasa y 82 microlitros tampón de solución salina. Mantenga los microtubos sobre hielo durante toda la colección de hemólimpos.Las muestras de centrífuga y el pellet suave de los hemocitos se formarán después de la centrifugación de la hemolímplo. Para la cuantificación de la hemolímpida, cuantifique el volumen de hemolímpido obtenido contando el volumen total dentro del microtubo y descontando el volumen de cóctel proteasa y tampón salino. Retire con cuidado la hemolinfa libre de células y vuelva a suspender suavemente las células.Cuantifique los hemocitos colocando 10 microlitros de hemocitos re-suspendidos en la cámara Neubauer. Para la re-suspensión de las células se utilizó un medio de cultivo. Cortar la pierna delantera de la garrapata, aplicar una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata, observar una burbuja líquida transparente aparecen en el sitio de corte.Aplique las gotas de hemólimpa directamente en las diapositivas limpias del microscopio. Después de eso, utilice los métodos apropiados para manchar las células. La inoculación entre el muslo de la pierna y la garrapata del cuerpo femenino también puede dañar los órganos internos de la garrapata, como la parte media y los túbulos malpighianos.Cuando la garrapata en la parte media de la torcha es interrumpida por la aguja en la colección de hemólimpa dorsal, el líquido obtenido es rojo, no transparente. Esto indica una colección de hemolymph incorrecta. En este caso, la hemolímpido se desechará a medida que esté contaminada.La contaminación por hemolímpla también se puede observar cuando la garrapata está infectada naturalmente con altas cargas de patógenos, o en los pasos finales después del proceso de muerte causado por patógenos inoculados. El volumen de hemolymph obtenido después de la colección dorsal es mayor que el volumen obtenido en la colección a través de la pierna. A pesar de la facilidad de contaminación es mayor en el primer método de recolección.La concentración de hemocitos también fue significativamente mayor en la colección dorsal. Cuando se realiza la correcta colección de hemocitos se puede obtener un buen frotis y es posible distinguir diferentes hemocitos después de la tinción. Este video proporcionó información sobre los métodos para realizar la inoculación del patógeno, específicamente los hongos entomopatógenos, en las garrapatas y recoger su hemolímpia.Las técnicas aquí presentadas requieren recursos tecnológicos muy bajos en nuestros pasos clásicos para los estudios sobre la fisiología de las garrapatas, la patología de las garrapatas y la respuesta inmunitaria de la garrapata. La correcta recolección de las células artrópodas y la hemolímpia libre de células es crucial para ofrecer información confiable para estudios posteriores. Por esta razón, también es importante ser consciente de los errores más comunes observados en la ejecución de estas técnicas.Además, las propuestas de este estudio determinarán el lugar más apropiado para la recolección de hemólimpas mediante la deformación o corte de las piernas, teniendo en cuenta la diferencia en el volumen obtenido y la probabilidad de contaminación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.

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La colección de la hemolinfa garrapata infectada, las glándulas salivales y la saliva es importante para estudiar la forma transmitida por garrapatas patógenos causan enfermedades. En este protocolo se demuestra cómo recoger las glándulas salivales y la hemolinfa de la...

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La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí.

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Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.

Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

Aquí, presentamos un protocolo evaluar espacial y temporal la presencia de microbiota viable en agallas de señal usando un acercamiento modificado todo montaje de hibridación in situ.

Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

El presente protocolo describe el aislamiento de microARN de las glándulas salivales de las garrapatas y las vesículas extracelulares purificadas. Este es un procedimiento universal que combina reactivos y suministros de uso común. El método también permite el uso de un pequeño número de garrapatas, lo que resulta en microARN de calidad que se pueden secuenciar fácilmente.

Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

La electroporación es un método rápido y ampliamente adoptado para introducir ADN exógeno en el género Rickettsia. Este protocolo proporciona un método de electroporación útil para la transformación de bacterias intracelulares obligadas en el género Rickettsia.

Un método de electroporación para transformar Rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas

Describimos un método para recolectar hemolinfa cuantificable de manera eficiente de artrópodos pequeños para su posterior análisis.

Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

En este artículo se presenta la metodología para la exposición de humanos a larvas de Ixodes scapularis para investigación clínica. La técnica es relativamente simple, tolerable por los voluntarios de investigación, y puede ser modificada de acuerdo con las necesidades experimentales. Dicha investigación con seres humanos debe llevarse a cabo bajo protocolos de estudio clínico aprobados por las autoridades reguladoras correspondientes.

Un modelo para la exposición experimental de humanos a larvas de garrapatas Ixodes scapularis

Aquí, presentamos un protocolo para recolectar saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio, después de la disección de una garrapata alimentada individualmente, para estudiar la localización específica del tejido de los patógenos transmitidos por garrapatas para avanzar en la comprensión de la competencia del vector y las interacciones patógeno-microbioma.

Extracción de saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio de garrapatas individuales (Acari: Ixodidae)

Este método describe el desarrollo de un sistema de alimentación sanguínea in vitro para garrapatas que incorpora una cámara impresa en 3D y una membrana de silicona fabricada en laboratorio. El sistema permite la alimentación artificial de garrapatas, facilitando el muestreo en diversas fases de alimentación y utilizando bajos volúmenes de sangre, proporcionando una herramienta invaluable para estudiar garrapatas ixódidas.

Sangre de garrapata alimentándose a través de una membrana artificial en una cámara impresa en 3D en investigación de garrapatas Ixodid

Aprende técnicas de inoculación de blastosporos de Metarhizium y recolección de hemolinfa en garrapatas Rhipicephalus microplus para estudiar respuestas inmunes y desarrollar métodos alternativos de control biológico.

Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados (Video) | JoVE Journal

Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

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