Name: Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Descubre cómo cuantificar tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos usando presas fluorescentes como trazadores. Este método permite visualizar la transferencia de carbono y energía en redes tróficas microbianas.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Checa de Ciencias bajo la beca de investigación 13-00243S y 19-16554S otorgada a K. . y D. S., respectivamente. Este artículo también fue apoyado por el proyecto "Biomanipulación como herramienta para mejorar la calidad del agua de los embalses de presas" (No CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, en El Programa Operativo de Investigación, Desarrollo y Educación.

1. Recogida de muestras
<ol><li>
Colección de muestras de agua de depósito:el primer caso de estudio (Exp I; menor depredador natural in situ y sistema de abundancia de presas)<ol>
<li>Recoja muestras de agua de la ubicación deseada a una profundidad adecuada. Mantener las muestras en un enfriador con temperatura controlada llena a temperatura in situ (evitando el choque de temperatura; debe tenerse en cuenta que las tasas de absorción de los protistas dependen de la temperatura) durante el transporte al laboratorio. NOTA: Nuestro muestreo se llevó a cabo en el reservorio meso-eutrófico en forma de cañón de éímov (Bohemia del Sur, volumen 34,5 x 106 m3,profundidad máxima 43 m, tiempo medio de retención 100 días, dimicéptico). El sitio de muestreo se encuentra a una profundidad de 30 m, cerca de la presa. Una muestra mixta a una profundidad de 0,5 m fue recogida por un muestreador de 2 l Friedinger.</li>
		<li>Continúe con la sección 1.2 tan pronto como sea posible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de líquido de las trampas de plantas carnívoras de Utricularia reflexa: el segundo caso práctico (Exp II; un sistema con altas abundancias de depredadores y presas, volumen de muestra extremadamente pequeño)<ol>
<li>Agitar suavemente las plantas bajo el agua, retirar las del recipiente de cultivo y colocarlas en material absorbente para absorber el exceso de agua. Dependiendo de la robustez de las plantas y el tamaño de las trampas, elija 8-10 individuos de la planta.</li>
		<li>Divida cada brote en partes aproximadamente iguales contando los nodos de hojas que llevan órganos de captura. Cada segmento de brote servirá para recoger muestras mixtas que representan trampas jóvenes, de mediana edad y viejas.</li>
		<li>Coloque un capilar de vidrio fino y un vial de Eppendorf para la recogida de muestras en una bomba peristáltica. Proceda a insertar la punta capilar en la abertura de la trampa. Usando la bomba de vacío, succione todo el líquido de cada trampa hasta que se recojan 900 x 100 l de líquido de trampa para cada categoría de edad de trampa.</li>
		<li>Utilice submuestras triplicadas de 200 ml del fluido de trampa agrupado para experimentos de pastoreo de protistán. Procesarlos inmediatamente como se detalla en la sección 3. Conservar el resto de 300 ml de la muestra para todos los demás análisis de componentes microbianos que viven en el fluido, como se detalla a continuación (sección 2).</li>
		<li>Proceda inmediatamente a la sección 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fijación de muestras recogidas
<ol><li>Exp I y II: fijar submuestras de fluidode agua/trampa para la enumeración bacteriana (sección 4; aproximadamente 20 ml y 0,3 ml, respectivamente) con formaldehído durante al menos 1 h para obtener un volumen final del 2%: concentración de volumen en cada muestra. NOTA: Manipule el formaldehído exclusivamente en la campana de humos y use guantes en todo momento mientras manipula las muestras.</li>
</ol>3. Filtración de muestras
<ol><li>Dilución de la muestra (Exp I): no se necesita dilución para las muestras de agua del depósito. (Exp II): diluir la muestra de fluido de trampa 10x-100x con agua MQ libre de partículas para lograr una distribución adecuada de los microbios objetivo en superficies de filtro antes de contar a través de microscopía de epifluorescencia.</li>
	<li>Filtrar 1-2 ml (Exp I) del agua del depósito o 10-30 l (Exp II) de la submuestra del líquido trampa para contar bacterianos en filtros negros de 0,2 m de tamaño poro, utilizando un embudo de filtración (25 mm de diámetro).</li>
	<li>Mancha los filtros con DAPI (4',6-diamidino-2'-phenylindole dihydrochloride, 0.2% concentración final) durante 4 min. NOTA: Evite la contaminación de la piel y la superficie de trabajo, y use guantes.</li>
	<li>Coloque el filtro con microbios concentrados en una gota de aceite de inmersión (para microscopía fluorescente) en una diapositiva del microscopio. Coloque otra gota de aceite en el centro del filtro y cubra con un cubreobjetos, asegurándose de que el aceite se distribuya uniformemente.</li>
	<li>En este punto, preferiblemente procese las muestras inmediatamente, o alternativamente, guárdelas en el congelador (-20 oC) durante varias semanas o meses hasta un análisis posterior.</li>
</ol>4. Enumeración de números bacterianos en los filtros
<ol><li>Coloque la corredera debajo del microscopio de epifluorescencia (con el conjunto de filtros correspondiente al DAPI fluorocromo). Coloque una rejilla de recuento de 10 x 10 en uno de los oculares. Mueva la diapositiva a una posición aleatoria.</li>
	<li>Cuantifique las células bacterianas (fluorescencia azul) en el área de la cuadrícula de recuento (bajo el aumento 1000x). En los recuentos, incluya las celdas que cruzan los bordes izquierdo e superior de la cuadrícula de recuento, excluyendo las situadas a través de los bordes derecho e inferior.</li>
	<li>Muévase a otra posición aleatoria y repita la enumeración en al menos 10-15 cuadrículas de recuento, lo que equivale a 500 celdas contadas en total.</li>
	<li>Establecer un factor de conversión para un microscopio y aumento determinados, basado en el conocimiento de la relación del área de una rejilla con el área de filtración efectiva total del filtro. Luego, divida el número total de células contadas por el número de cuadrículas contadas, produciendo un número promedio de bacterias por cuadrícula.</li>
	<li>Multiplique este último parámetro por el factor de conversión establecido y normalice el número resultante por ml de una muestra (dependiendo del volumen de la muestra filtrada) para obtener la abundancia bacteriana total por ml.</li>
</ol>5. Determinación de la abundancia de protistán
<ol><li>Fijar la muestra de agua (Exp I) o el fluido de trampa (Exp II) submuestras con glutaraldehído (1% concentración final, más adecuado para muestras con la presencia de partículas que contienen clorofila que deben ser procesadas días a semanas después de la fijación) o utilizando el técnica de decoloración formol-tiosulfato especificada a continuación. NOTA: Ambas técnicas de conservación previenen la gestión del material ingerido a partir de vacuolas alimentarias de protistas8.</li>
	<li>En cuanto a la técnica de decoloración formol-tiosulfato, añada 100 l/1 l de la solución de Lugol en 20 ml/200 ml de la submuestra de líquido de agua/trampa (Exp I/Exp II, respectivamente).</li>
	<li>Siga inmediatamente con la adición de 0,5 ml/50 l de formalina tamponada con borato y luego 20 l/2 l de tiosulfato sódico al 3% (Exp I/Exp II, respectivamente). NOTA: El tiosulfato sódico decolora el color amarillo de Lugol para permitir la observación de células bajo el microscopio de epifluorescencia8.</li>
	<li>Filtrar un volumen conocido de muestra (dependiendo del número de protistas objetivo) en filtros de policarbonato negro del tamaño de un poro de 1 m.</li>
	<li>Estimar el número de la especie protista es contando al menos 200 células bajo aumento 600x usando la cuadrícula de recuento (ver arriba).</li>
	<li>Reduzca el volumen de la muestra bajo vacío en el embudo de filtración por vacío bajo a aproximadamente 2 ml. A continuación, suelte la subpresión y añada el fluorocromo DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride13, 0.2% concentración final) durante 2 min.</li>
</ol>6. Determinación de la estructura comunitaria de los ciliados en muestras de plancton
NOTA: Las comunidades ciliada en hábitats de agua dulce son muy diversas14,15,16,18, y su determinación microscópica es un reto. La clasificación de los grupos ciliados en gremios funcionales10,14,16,17 permite un análisis más detallado de diferentes grupos ciliados como bacterívoros pelágicos.
<ol><li>Evalúe la estructura de la comunidad ciliada combinando lo siguiente:<ol>
<li>Muestras manchadas de DAPI en microscopía de epifluorescencia (para localizar las células ciliadas con fluorescencia brillante de macro y micronúcleos de diferentes tamaños y morfología) combinadas con la absorción de bacterias etiquetadas fluorescentesmente (FLB8;para más detalles, ver a continuación), el seguimiento de la capacidad de los ciliados para alimentarse de bacterias.</li>
		<li>Observación de muestras en vivo en casos seleccionados17,19. Para más detalles de los enfoques y criterios anteriores utilizados para agrupar ciliados en diferentes categorías taxonómicas, véanse las publicaciones anteriores16,17. NOTA: Estudios citados han indicado que entre los ciliados, las especies omnívoras de Stichotrichia (genera Halteria y Pelagohalteria)y Oligotrichia (a saber, Rimostrombidium spp.) son los consumidores pelágicos más importantes de bacterioplancton en la gran mayoría de los hábitats de agua dulce10,17,18.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Estimación de las tasas de pastoreo ciliado
<ol><li>Calcular las tasas de ingesta de cilios en bacterias basándose en los cambios en el número medio de trazador [es decir, FLB8 por ciliar relacionado con el tiempo de incubación (5-15 min)] y la cantidad de FLB añadida, representando como máximo entre el 5% y el 15% del total de bacterias.</li>
	<li>Para comparar las tasas de captación entre diferentes especies de protistán, normalice las tasas de captación como el número de bacterias por ciliado por hora, con cálculos basados en el tiempo de incubación real y la proporción del FLB trazador añadido. NOTA: En la Figura 1se muestra el esquema general de la aplicación del método FLB para estimar las tasas de bacterivory tanto celulares como específicos de especies y a granel en muestras naturales.</li>
	<li>Preparación de FLB a partir de cepas bacterianas autóctonas a un ambiente de agua dulce8<ol>
<li>Seleccione un tamaño adecuado (volumen de célula s/promedio de MCV) y morfología de las bacterias para que imite eficazmente los tamaños típicos de las células bacterioplancton/bacterianas en el sistema acuático que se está investigando. NOTA: Para Exp I, se utilizó una mezcla de cepas aisladas de la ubicación de estudio del género Limnohabitans y Polynucleobacter (es decir, bacterioplancton típico y muy abundante en lagos y estanques)20. Para más detalles sobre la morfología y el tamaño de las cepas, véanse las publicaciones anteriores3,17,18,21.</li>
		<li>Cosechar células bacterianas del cultivo por centrifugación (5.000 x g) durante 15 minutos en la fase estacionaria temprana y mezclarlas en una proporción numérica que produzca MCV - SD de las células en la mezcla correspondiente al MCV típico de bacterias en el lugar elegido.</li>
		<li>Suspenda los pellets en 10 ml de solución salina con fosfato (PBS; pH n.o 9).</li>
		<li>Añadir 2 mg de aminofluoresceína de color amarillo-verde 5-(4,6-diclorotriazina-2-yl) (DTAF, se une a las proteínas) a la suspensión celular en el tampón fosfato-salino, e incubar en un baño de agua de 60 oC durante 2 h.</li>
		<li>Después de la incubación, centrifugar las células hacia abajo, decantar la solución DTAF, y lavar y centrifugar 3veces con PBS.</li>
		<li>Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 20 ml del búfer PPi-salino.</li>
		<li>Vortex la suspensión FLB y la pipeta 1,5 ml alícuotas en crioviales de 2 ml, luego mantener congelado (a -20 oC) en el tampón PPi-salino hasta su uso.</li>
		<li>Prefiltro PPi-saline buffer a través de un filtro de policarbonato de 0,2 m para su uso en el siguiente paso.</li>
		<li>Para determinar la concentración de FLB, transfiera una pequeña alícuota (generalmente 20-40 l) a 2 ml de tampón PPi-salino libre de partículas, sonicar a 30 W durante varias ráfagas de 2 s y filtre en un filtro negro de policarbonato de 0,2 m para su enumeración a través de epifluorescencia microscopía (aumento de 1.000X) en los ajustes de filtro óptico para DTAF (448 nm/520-540 nm).</li>
	</ol></li>
	<li>Técnica de trazador para la estimación del bacterivory ciliado<ol>
<li>Para experimentos de pastoreo en hábitats planctónicos naturales, dispensar muestras de 300 ml en matraces bien enjuagados e incubar a temperatura in situ durante 15 minutos (para permitir que los protistas se recuperen del amortiguador de manipulación).</li>
		<li>Añadir trazadores FLB para constituir 5%-15% del total de bacterias, con las cantidades añadidas dependiendo de la temporada y la temperatura del agua. NOTA: Hay un espectro muy amplio, dependiente de la temporada en las tasas de admisión específicas de las especies ciliadas que abarcan varios órdenes de magnitud (es decir, de 101-104 bacterias ciliar-1 por hora)10,16, 17,18,22,23,24.</li>
		<li>En períodos de mayor aparición de ciliados con altas tasas de admisión (generalmente durante el verano), también se ejecuta una incubación paralela con adiciones muy bajas de FLB, constituyendo sólo 2%-4% del total de bacterias para evitar la carga excesiva de vacuolos ciliados por el trazador FLB (ver ejemplos en la Figura 2).</li>
		<li>Incubar muestras de ciliado/plancton con FLB durante 5-15 min.</li>
		<li>Existen dos posibilidades de fijación de muestras para evitar la gestión del material ingerido a partir de vacuolas alimentarias de los protistas8. Terminar las incubaciones mediante la adición de 1% de glutaraldehído (concentración final que es más adecuada para muestras con partículas que contienen clorofila, como algas). Alternativamente, utilice 100 l/10 l de la solución de Lugol en 20 ml/200 ml de submuestra de líquido de agua/trampa, seguido inmediatamente por la adición de 0,5 ml/10 l de formalina tamponada con borato y, a continuación, 200 ml/2 l de tiosulfato sódico al 3% (Exp I/Exp II, respectivamente).</li>
	</ol></li>
	<li>Después de añadir el fijador, deje reposar las muestras durante al menos 1 h en la oscuridad a 4 oC para asegurar la preservación minuciosa de las células ciliada.</li>
	<li>Tomar submuestras de plancton naturales de 4-30 mL/10-30 l (Exp I/Exp II, respectivamente; el volumen depende de la abundancia de ciliar) y manchar con DAPI (concentración final 0,2% wt/vol; para más detalles, ver paso 3.2 anterior).</li>
	<li>Pasar a través de filtros negros de 1 m e inspeccionar a través de microscopía de epifluorescencia para contar los ciliados (aumento de 600x) y enumerar el número de trazadores FLB ingeridos (principalmente con aumento de 1000x) como se detalla en publicaciones anteriores2,17 . Inspeccione las muestras dentro de los 7 días posteriores a la conservación.</li>
	<li>Para estimar el pastoreo total protozoario/específico de la especie, multiplique las tasas medias de ingesta de todos los ciliados, o sólo de las especies ciliadas detectadas por la abundancia in situ.</li>
	<li>Ejemplo del cálculo de las tasas de admisión por célula a partir de los datos in situ del depósito de agua de éímov se describe de la siguiente manera:<ol>
<li>Supongamos que la concentración bacteriana es de 3,55 x 106 bacterias/ml y el trazador FLB añadido es de 0,25 x 106 FLB/mL, lo que produce una suma de 3,8 x 106 bacterias/ml de partículas bacterianas totales (bacterias naturales + FLB a 100% de las partículas de presas) protistas fagotróficas en la muestra natural. NOTA: Los trazadores FLB añadidos representan así el 6,58% (un proyecto de 0,25/0,038) de partículas bacterianas totales. El número medio de FLB por Halteria sp. es de 6,2 FLB en incubaciones de 5 minutos.</li>
		<li>Para normalizar la suatoma por hora, utilice el siguiente cálculo: (6,2 x 12)/(6,58/100) a 1131 bacterias por célula de halteria/h. NOTA: Para obtener más ejemplos de distribuciones de las tasas de admisión individuales de Halteria sp. detectadas bajo temperaturas variables del agua, cantidades (como porcentajes) de FLB de trazador añadido y diferentes tiempos de incubación con FLB, véase la Figura 3.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Zingel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliates+are+the+dominant+grazers+on+pico-+and+nanoplankton+in+a+shallow%2C+naturally+highly+eutrophic+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake.</a> Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).</li>
<li>Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliate+epibionts+associated+with+crustacean+zooplankton+in+german+lakes%3A+distribution%2C+motility%2C+and+bacterivory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory.</a> Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).</li>
<li>Sirová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunters+or+gardeners%3F+Linking+community+structure+and+function+of+trap-associated+microbes+to+the+nutrient+acquisition+strategy+of+a+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant.</a> Microbiome. 6, 225(2018).</li>
<li>Šimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+traits+of+a+zoochlorellae-bearing+Tetrahymena+sp.+%28Ciliophora%29+living+in+traps+of+the+carnivorous+aquatic+plant+Utricularia+reflexa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).</li>
<li>Pitsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+Tetrahymena+utriculariae+n.+sp.+%28Ciliophora%2C+Oligohymenophorea%29+with+its+endosymbiotic+algae+%28Micractinium+sp.%29%2C+living+in+the+feeding+traps+of+a+carnivorous+aquatic+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).</li>
<li>Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+tracing+in+ecology%3A+Method+comparison+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Diet tracing in ecology: Method comparison and selection.</a> Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).</li>
<li>Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+methods+for+estimating+phago-mixotrophy+in+nanophytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton.</a> Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Dolan, J. D., Šimek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+ingested+matter+in+Strombidium+sulcatum%2C+a+marine+ciliate+%28Oligotrichida%29%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida).</a> Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).</li>
<li>Massana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grazing+rates+and+functional+diversity+of+uncultured+heterotrophic+flagellates%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates.</a> The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).</li>
<li>Grujčić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptophyta+as+major+freshwater+bacterivores+in+experiments+with+manipulated+bacterial+prey%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey.</a> The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Descifrar la interacción trófica en los sistemas acuáticos siempre es un desafío28,especialmente a escalas de nanoplancton que involucran a los protistas y sus presas, bacterias. Cuando se trata de vías de acumulación de nutrientes y cuantificación, la aplicación de métodos utilizados con éxito en niveles tróficos más altos es menos posible, debido a la alta complejidad de las interacciones bióticas. Estos incluyen, por ejemplo, enfoques estables de etiquetado de isótopos. Este protocolo muestra l...

Los prokaryotes heterotróficos son un componente biológico clave en los sistemas acuáticos y representan una fracción significativa de la biomasa de plancton1,2,3. Los factores que controlan su abundancia, diversidad y actividad son cruciales para entender su papel en el ciclo biogeoquímico (es decir, el destino del carbono orgánico y otros nutrientes y el flujo de energía de los prokaryotes a niveles tróficos más altos). El pastoreo de protozoos es uno de estos factores importantes. Bacterivory de nanoflagelados y ciliados heterotróficos impone un fuerte control descendente sobre la abundancia procariótica, la función comunitaria, la estructura, la diversidad e incluso la morfología celular y la tasa de crecimiento de determinados grupos bacterianos4, 5,6. En algunos sistemas, los protistas sirven como la principal causa de mortalidad bacteriana6,7.
El enfoque estándar utilizado para evaluar el bacterivory protozoario, que se ha utilizado desde hace algún tiempo, implica el uso de bacterias etiquetadas fluorescentesmente (FLB) como análogos de presas y microscopía de epifluorescencia. Las tasas de captación específicas de células se pueden determinar cuantificando el número de partículas de presa etiquetadas en vacuolas de alimentos protistán durante un curso de tiempo seleccionado8. Este enfoque tiene varias ventajas. Tracer se añade a muestras naturales con conjuntos naturales de depredadores y presas. Hay una manipulación mínima de la muestra antes de la incubación, la alteración mínima de la muestra por el trazador FLB añadido, y los tiempos de incubación son cortos para asegurar que los resultados sonoros obtenidos en condiciones cercanas a in situ. Alternativamente, en entornos con un bajo número de protistas bacterívoros o zooplancton (por ejemplo, sistemas marinos en alta mar), las tasas de desaparición de FLB añadidas a las muestras en cantidades bajas (2%-3% trazador) se pueden detectar a través de citometría de flujo a largo plazo (12-24 h) experimentos de incubación. A continuación, los números de FLB en los puntos inicial y final (integrando el impacto de todos los bacterívoros) se cuantifican mediante citometría de flujo (para más detalles, véase la publicación anterior9). Sin embargo, este parámetro sólo representa tasas totales agregadas de bacterivory que no pueden atribuirse directamente a ningún grupo o especie de protistán y pasto de zooplancton en particular.
En general, cuantificar las tasas de mortalidad bacteriana específicas de las especies de protistán o morfotipos en el medio acuático con precisión y con significado ecológico puede ser difícil. Algunos protistas son pastores selectivos, y el tamaño y la forma celular del trazador FLB añadido pueden distorsionar las tasas naturales de ingestión de presas10,11. Además, la actividad y el metabolismo del protistán son altamente sensibles a la temperatura12; por lo tanto, la cantidad de trazador FLB añadido debe manipularse cuidadosamente para cada tipo de muestra individual (no sólo en función de la abundancia natural, el tamaño y la morfología de las bacterias y los tipos predominantes de bacterívoros, sino también de la temperatura). La mayoría de los estudios se centran en la actividad de pastoreo de protistano a granel; sin embargo, el bacterivory de especies específicas de protistán a menudo tiene un valor de información mucho más alto y puede ser preferible. En este caso, se necesita el conocimiento taxonómico de las especies protistas presentes en una muestra y comprensión de su comportamiento. Por lo tanto, se requieren cantidades considerables de tiempo y mano de obra para obtener resultados sólidos sobre las tasas específicas de bacterivo de especies atribuibles a un grupo o especie de protistán en particular.
A pesar de estas dificultades, este enfoque sigue siendo la herramienta más adecuada actualmente disponible para evaluar el bacterivory protistán en entornos naturales. Aquí se presenta un método completo y fácil de seguir para utilizar flb como marcador en estudios de ecología microbiana acuática. Se tienen en cuenta todos los aspectos problemáticos mencionados del enfoque y se describe un flujo de trabajo mejorado, con dos experimentos de entornos contrastantes, así como de especies ciliadas contrastantes como ejemplos.
El primer estudio de caso se llevó a cabo en un entorno epilimónico a partir del depósito de agua mesófico de la República Checa, que muestra abundancias de pastoreo y bacterias comparables a la mayoría de los cuerpos de agua dulce superficiales (cf.5,7). El segundo estudio de caso se llevó a cabo en el entorno altamente específico dentro de las trampas de la planta carnívora acuática Utricularia reflexa, que alberga un número extremadamente alto de ambos ciliados mixotricos de pastoreo (Tetrahymena utriculariae) y células bacterianas. Se muestran cálculos de las tasas de pastoreo específicas de las células y las existencias de pie bacteriana en ambos tipos de muestras. A continuación se discute una serie de interpretaciones ecológicas de los resultados, y finalmente se sugieren ejemplos de posibles estudios de seguimiento.

<table><tbody><tr><td>0.2-y micro; Filtros del tamaño de los poros&nbsp;</td><td>Suministros SPI, https://www.2spi.com/</td> <td>B0225-MB</td><td>Negro, policarbonato Filtros de membrana de grabado de pista, diámetro apropiado para aparatos de filtrado utilizados</td></tr><tr><td>5-(4,6-diclorotriazina-2-il) aminofluoresceína (DTAF)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas automáticas con volúmenes ajustables&nbsp;</td><td>Cualquier marca, varios tamaños</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>22 000 x g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crioviales</td><td>Cualquier marca, tamaño</td><td></td><td></td>de 2 mL</tr><tr><td>DAPI (4&agudo;,6-Diamidino-2&agudo;-diclorhidrato de fenilindol)</td><td>Cualquier marca&nbsp;</td><td></td><td>1 mg ml-1</td></tr><tr><td>Microscopio de epiflorescencia</td><td>Aumento de 400 x hasta 1000 x</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtros apropiados para la visualización en el rango</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> DAPI y DTAF <td>Rejilla de conteo en uno de los oculares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato de filtrado</td><td>Por lo general, con un diámetro de 25 mm&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Una marca para microscopía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Una marca para microscopía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión para microscopía</td><td>Aceite específico con baja fluorescencia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lugol&acute; s solución</td><td>Cualquier marca o ver comentario</td><td></td><td>Haga una solución alcalina Lugol' de la siguiente manera: Solución 1 - disolver&nbsp; 10 g de yoduro de potasio en 20 ml en agua MQ, luego agregar 5 g de yodo. Solución 2: agregue 5 g de acetato de sodio &nbsp; hasta 50 ml de agua MQ. Agregue la solución 2 a la solución 1 y mezcle bien</td></tr><tr><td>Formalina estabilizada con metanol</td><td>Cualquier marca disponible para fines</td><td></td><td></td>de microscopía</tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio y cubreobjetos</td><td>Cualquier marca producida para fines de microscopía&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua MQ para diluir muestras</td><td>Cualquier marca &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH = 9)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>0,05 M Na2HPO4-NaCl, ajustada a pH 9</td></tr><tr><td>PPi-solución salina</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>0,02 M Na4P2O7-NaCl solución. Añadir 0,53 g de Na4P2O7 a 100 ml de agua MQ más 0,85 g de NaCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo de muestreo&nbsp;</td><td>Apropiado para obtener una muestra representativa&nbsp;</td><td></td> p<td>. ej., Muestreador de Friedinger para plancton lacustre</td></tr><tr><td>Solución de tiosulfato de sodio</td><td>Se</td><td>utiliza cualquier marca</td><td></td> de solución al 3% en el protocolo</tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td> de 30 W <td>Cualquier marca que permita una mezcla completa de los solutos y las muestras</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Cualquier marca que permita mantener la temperatura a 60 °C; C</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

La diluación de las interacciones tróficas, como la depredación y sus efectos, es una tarea frecuente para muchos investigadores en ecología. El estudio de las comunidades microbianas tiene muchas limitaciones, y determinar las tasas de depredadores, presas y depredadores a menudo es difícil. Aquí se presenta un método optimizado basado en la adición de presas etiquetadas fluorescentes como un trazador, que permite una cuantificación fiable de las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos y la estimación de la transferencia de nutrientes a niveles tróficos más altos.

Ejemplo de experimento que se ejecutó en el embalse de agua de Oímov (Bohemia del Sur, CZ), que es un sitio natural con menor depredador natural in situ y abundancia de presas. Se informa de datos representativos de la especie ciliada omnívora Halteria grandinella, que es un pastor abundante y eficiente de partículas de picoplancton (&lt;2 m)10,16,17,18 ,<s...

Aquí se presenta un protocolo para una técnica monocelular basada en microscopía de epifluorescencia para cuantificar las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos con alta precisión y resolución taxonómica.

Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Este enfoque es significativo porque nos permite visualizar y estimar los flujos de carbono y energía de los prokaryotes a niveles tróficos más altos en las redes de alimentos microbianos a una resolución muy alta. Esta es la única técnica actualmente disponible para determinar qué especies protistas consumen bacterias in situ, y al mismo tiempo cuantificar la tasa de este proceso a un nivel de una sola célula. Dado que las bacterias son los únicos microbios significativos que cambian el carbono orgánico disuelto a la partícula de carbono orgánico, el conocimiento de los actores involucrados y las tasas a las que esto sucede constituye la base para entender los ecosistemas acuáticos en general. Recomendamos encarecidamente que los investigadores se familiaricen con su sistema de estudio antes de llevar a cabo cualquier experimento de pastoreo. Esto implica luz y epifluorescencia de la inspección de microscopía de las muestras, y el conocimiento de los principales taxones presentes y su dinámica estacional. Demostrar el procedimiento será Jitka Jezberov

fluorescently-labeled-bacteria-as-tracer-to-reveal-novel-pathways

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Bacterioplancton ambientales se incuban con un modelo del carbono orgánico disuelto (COD) y un reactivo compuesto de ADN de etiquetado, bromodesoxiuridina (BrdU). Después, DOC-degradantes células se separan de la comunidad a granel en base a su elevada incorporación de BrdU utilizando fluorescencia clasificación de células activadas (FACS). Estas células son identificadas por los posteriores análisis molecular.

Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton

Fuente: Pioli, R., et al., Patrón de microorganismos y micropartículas a través del ensamblaje secuencial asistido por capilaridad. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el método de capturar células individuales de Escherichia coli (E. coli) marcadas con fluorescencia en trampas microfluídicas utilizando una suspensión libre de carbono y un flujo controlado, seguido de la adición de nutrientes para desencadenar el crecimiento y las imágenes de fluorescencia de las microcolonias.

Patrones microfluídicos y seguimiento basado en fluorescencia del crecimiento bacteriano unicelular

Fuente: Chetrit, D., et al. Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver características espaciotemporales del sistema de secreción punto/ icm de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demuestra la preparación e imagen de bacterias patógenas marcadas con fluorescencia. Las almohadillas de agarosa se preparan y colocan primero dentro de un marco adhesivo. Se aplica una suspensión de bacterias genéticamente modificadas que expresan una...

Preparación de muestras e imagen de bacterias marcadas con fluorescencia

Se describe un método basado en proteínas fluorescentes de células vivas para iluminar vacuolas celulares (inclusiones) que contienen Chlamydia. Esta estrategia permite la determinación rápida y automatizada de la infectividad de Chlamydia en muestras y se puede utilizar para investigar cuantitativamente la dinámica de crecimiento de la inclusión.

El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

Un ensayo de toda bioinformador celda con Burkholderia sartisoli RP037-MCHE fue desarrollado para la detección de fracciones de un contaminante orgánico (es decir, fluoreno) disponible para la degradación bacteriana después de transporte activo por micelios puente poros llenos de aire en un sistema modelo saturado de agua.

Todo un enfoque bioinformador celular para evaluar Transporte y Biodisponibilidad de los Contaminantes Orgánicos en Sistemas no saturadas de agua

El papel de surtido (segregación espacial) en escenarios de evolución puede ser examinada usando sistemas microbianos simples en el laboratorio que permiten el ajuste de la distribución espacial controlada. Mediante la modificación de la densidad celular fundador, varios niveles de surtido pueden ser visualizados utilizando cepas bacterianas marcadas con fluorescencia en las biopelículas de colonias de Bacillus subtilis.

Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

Este protocolo de imágenes celulares de células bacterianas vivas permite visualizar las interacciones entre múltiples especies bacterianas a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten la observación de cada especie bacteriana en monocultivo o cocultura para interrogar las interacciones entre especies en comunidades bacterianas multiespecies, incluida la motilidad celular individual y la viabilidad.

Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula

Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Descubre cómo cuantificar tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos usando presas fluorescentes como trazadores. Este método permite visualizar la transferencia de carbono y energía en redes tróficas microbianas.

Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos (Video) | JoVE Journal

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