Name: Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprende microscopía de fluorescencia de alta resolución para estudiar la localización de proteínas y cambios morfológicos en células bacterianas vivas de Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus. Este protocolo permite el análisis a nivel de célula individual.

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Agradecemos a nuestros miembros del laboratorio por sus comentarios sobre este artículo. Este trabajo fue financiado por una beca de puesta en marcha de la Universidad del Sur de Florida (PE).

1. Condiciones generales de crecimiento
<ol><li>Inocular 2 ml de medio de crecimiento adecuado suplementado con antibióticos (cuando sea necesario) con una sola colonia de la(s) cepa(s) a la imagen. Incubar estos cultivos de semillas durante la noche a 22 oC en una incubadora de temblores. NOTA: Las condiciones específicas de crecimiento bacteriano utilizadas en este artículo se proporcionan en la sección de resultados representativos.</li>
	<li>Diluir los cultivos nocturnos 1:20 en medios frescos en un matraz de 125 ml, suplemento con antibióticos (cuando sea necesario).</li>
	<li>Cultivar el cultivo(s) a 37 oC en una incubadora de temblores hasta la fase logarítmica media (OD600 a 0,5). NOTA: El inductor o inhibidor podría añadirse directamente al cultivo o cultivos en crecimiento en la fase de crecimiento adecuada.</li>
	<li>Cosecha las células en las condiciones de cultivo deseadas para la preparación de muestras de microscopía como se describe en la siguiente sección.</li>
</ol>2. Preparación de la muestra
<ol><li>Preparar el 1% de agarosa combinando 0,25 g de grado de biología molecular, eEO bajo, agarosa con 25 ml de medio de crecimiento complementado con antibióticos apropiados (cuando sea necesario) para la microscopía de timelapse o agua estéril. Calentar la mezcla con la ayuda de un microondas durante aproximadamente 30 s y verter en una placa estéril de 100 mm x 15 mm Petri y dejar que se solidifique.</li>
	<li>Tome una alícuota de 5–50 l del cultivo celular dependiendo de la necesidad y manchar las células. Células de mancha con tintes apropiados en esta etapa (por ejemplo, añadir tinte fluorescente FM4-64 (mancha de membrana) para un experimento(Figura 1)).<ol>
<li>Pipetear una alícuota de 5 ol de la muestra de cultivo o muestra de vid manchada que se va a tomar una imagen en la parte inferior de un plato de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm (con un diámetro de micropozo de 14 mm y unrevestimiento No. 1.5; véase la Tabla de Materiales). ADVERTENCIA: No utilice cubiertas recubiertas de poli-L-lisina especialmente para la microscopía timelapse, ya que podrían inducir un patrón de crecimiento diferente (hemos observado esto con poli-D-lisina también; datos no mostrados) y / o afectar la dinámica deproteínas 6.</li>
		<li>Para minimizar el uso de colorantes, ten la suspensión celular de 3-4 l (cosechada a OD600 a 0,5; aproximadamente 2,7 x 107 y 3,4 x 107 para B. subtilis y S. aureus respectivamente por cultivo de 1 ml) directamente en el plato inferior de vidrio.</li>
		<li>Coloque una losa de agarosa precortada (11 mm de diámetro o de cualquier tamaño deseado para superponer el área del cubreobjetos; corte utilizando el extremo abierto de un tubo estéril o una cuchilla de afeitar) en la parte superior de la muestra y toque suavemente para asegurarse de que la losa de agarosa esté acostada contra el cubreobjetos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la toma de imágenes (ver sección siguiente), si el número de celdas en el campo de visión no es deseable, ajuste la densidad celular de la muestra a través de la dilución o concentración por centrifugación y modifique la proporción de células en la muestra utilizando medio de crecimiento/ búfer según sea necesario. NOTA: Para minimizar la autofluorescencia que emana del medio de cultivo, las células se pueden lavar en tampón (por ejemplo, en la salina tampón de fosfato 1x estándar) y resuspenderse en la cantidad adecuada de tampón antes de la toma de imágenes. Es posible que en este paso las células o vesículas más pequeñas no se conserven después de la centrifugación y, por lo tanto, se pierdan.</li>
	<li>Agregue agua utilizando una pipeta (gotas de 5 l) al espacio dentro de la placa de cultivo (alrededor de la cubierta) para evitar que la almohadilla de agarosa se seque y para ayudar a mantener la humedad durante el transcurso de la adquisición de la imagen, especialmente para los experimentos de timelapse.</li>
	<li>Permita que los platos de cultivo se equilibren a la temperatura dentro de la cámara de incubación, un compartimento opaco incorporado proporcionado por el fabricante, del microscopio durante 15-20 min. NOTA: Encienda el elemento calefactor y ajuste la cámara de incubación a la temperatura deseada varias horas antes de la toma de imágenes. Esto garantizará que el hardware se estabilice a la nueva temperatura. Para obtener imágenes prolongadas de timelapse, coloque un vaso de precipitados o un matraz con agua dentro de la cámara del microscopio, lejos del área de trabajo, para mantener la humedad.</li>
</ol>3. Imágenes
<ol><li>El día del experimento, encienda el sistema del microscopio. Inicie el software de imágenes (consulte Tabla de materiales)haciendo clic en el icono correspondiente en el escritorio. Inicializar el microscopio haciendo clic en la opción Inicializar microscopio (botón representado con un microscopio) en el cuadro de diálogo de inicio del software. Asegúrese de que el objetivo se reduce por completo utilizando el ajuste grueso del microscopio antes de la inicialización. NOTA: Después de la inicialización, deben aparecer tres cuadros de diálogo adicionales además del menú de inicio: resolve3D, recopilación de datos y monitor de filtro.</li>
	<li>Coloque una gota de aceite de 1.517 (índice de refracción) en el objetivo de inmersión en aceite 100x suministrado por el fabricante (Apertura numérica 1,4, Distancia de trabajo a 0,12 mm; ver Tabla de materiales). NOTA: Es importante elegir el aceite de inmersión adecuado para la temperatura a la que se llevan a cabo las imágenes.</li>
	<li>Cargue el plato inferior de vidrio que contiene la muestra en la carcasa metálica (ataúd) y deslice suavemente en la abrazadera del escenario.</li>
	<li>Utilice la perilla de ajuste gruesa para elevar el objetivo hasta que el aceite entre en contacto con la parte inferior de vidrio del plato. Utilice la pieza ocular y la perilla de ajuste fina para enfocar la muestra. Una vez que las células estén enfocadas, gire la perilla de la pieza ocular al modo de cámara moviendo el interruptor selector situado en la parte delantera del cuerpo del microscopio hacia la izquierda.</li>
	<li>Comience a experimentar con el software de imágenes. En la ventana resolve3D, seleccione el icono de experimento Diseño/ejecución representado por un matraz. Debería aparecer un nuevo cuadro de diálogo titulado diseño/experimento de ejecución.<ol>
<li>Establezca el número de pilas Z y el grosor de la muestra mediante la ficha diseño y, a continuación, seccionamiento en el cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución. NOTA: Para los experimentos en la sección de resultados representativos, se utilizaron 17 pilas Z a intervalos de 200 nm para imágenes fijas y cuatro pilas Z a intervalo de 200 nm para microscopía de lapso de tiempo.</li>
		<li>Para medir el grosor de las celdas de la muestra, ajuste manualmente el plano Z de forma incremental utilizando las flechas arriba y abajo del cuadro de diálogo resolve3D. Marque dónde las celdas se desenfocan como límite superior e inferior para la adquisición de imágenes. Importe esta información antes de ejecutar el experimento.</li>
		<li>Para ayudar a minimizar la fototoxicidad y el fotoblanqueo durante la toma de imágenes de timelapse, reduzca el número de pilas Z y elija el plano medio de las celdas para la adquisición de imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Seleccione el conjunto de filtros adecuado para el experimento utilizando la ficha diseño y, a continuación, canales en el cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).<ol>
<li>Además, seleccione una referencia para la recopilación de información POL/DIC. Ajuste la transmisión porcentual (intensidad de la luz) y la duración de la exposición para los canales individuales seleccionados antes de la toma de imágenes seleccionando las opciones adecuadas en el cuadro de diálogo resolve3D. NOTA: En un campo de visión de prueba que no se tiene en cuenta para la prueba del experimento, estos ajustes para identificar si los parámetros seleccionados obtienen datos significativos de fluorescencia sin que falte señal débil o que la sobresaturan. A continuación, importe estos parámetros para la configuración experimental.</li>
	</ol></li>
	<li>Abra la lista de puntos seleccionando el botón Lista de puntos en el cuadro de diálogo resolve3D. Debería aparecer un nuevo cuadro de diálogo de lista de puntos autorizados. Marque varios campos de vista que se utilizarán en el experimento buscando campos de visión adecuados mediante los controles de etapa del microscopio y seleccionando la opción de punto de marca en el cuadro de diálogo de lista de puntos. NOTA: Se tendrá que seleccionar un punto de sustitución cada vez que el microscopio se vuelva a enfocar en un punto de la lista de puntos. Esto se puede hacer enfocando el microscopio en el punto apropiado de la lista y luego seleccionando el botón de reemplazar punto. Es importante no tocar la perilla de ajuste analógico grueso / fino al reenfocar; utilizar sólo el software para ajustar el enfoque.</li>
	<li>Establezca los parámetros de timelapse seleccionando primero el diseño y, a continuación, la pestaña timelapse en el cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución. Active la casilla de verificación timelapse. Introduzca los parámetros de timelapse adecuados en términos de imágenes de timelapse/tiempo total.</li>
	<li>Establezca los puntos que se van a crear en la lista de puntos seleccionando primero el diseño y, a continuación, la ficha Puntos del cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución. Seleccione la opción de lista de puntos de visita e introduzca los puntos que se van a crear una imagen en el cuadro de texto separados por comas o guiones si se trata de una secuencia completa.</li>
	<li>Antes de iniciar un experimento, edite los nombres de archivo y las ubicaciones de archivo mediante la pestaña Ejecutar del cuadro de diálogo Diseño/ejecución. La ubicación del archivo se puede cambiar seleccionando el botón de configuración, seleccionando la carpeta de datos y, a continuación, seleccionando la carpeta adecuada o creando una nueva. Cambie los nombres de archivo introduciendo el nuevo nombre de archivo en el cuadro de texto Nombre de archivo de imagen.</li>
	<li>Comience el experimento seleccionando el botón de reproducción en el cuadro de diálogo Iniciar experimento. NOTA: Para timelapse, compruebe continuamente el enfoque en cada campo de visión a lo largo del experimento utilizando la configuración DIC (para evitar el fotoblanqueo innecesario) y vuelva a enfocar y actualice la información en la lista de puntos a medida que las celdas tienden a perder el foco con el tiempo.</li>
</ol>4. Procesamiento de imágenes
<ol><li>Abra los archivos de imagen sin procesar (R3D) deseados para la generación de figuras. NOTA: Los archivos guardados recientemente se pueden encontrar mediante el botón de carpeta de datos del cuadro de diálogo de inicio del software de imágenes.</li>
	<li>Ejecute el programa de desconvolución, para eliminar la luz de fluorescencia desenfocada7,8, con el fin de producir un archivo de imagen D3D desconvolved. Seleccione la pestaña de proceso en el cuadro de diálogo de inicio y, a continuación, seleccione deconvolve. Aparecerá un nuevo cuadro de diálogo titulado deconvolve.<ol>
<li>Establezca los parámetros de desconvolución arrastrando el número de imagen adecuado (ubicado en la esquina superior izquierda de cada archivo de imagen) a la entrada del cuadro de diálogo de deconvolución. En el cuadro de diálogo de desconvolución, seleccione el botón de más opciones y anule la selección de la casilla de verificación de desplazamiento del borde de recorte después del procesamiento (de lo contrario, las imágenes no se pueden superponer sobre el archivo DIC correspondiente).</li>
		<li>Haga clic en el botón hacerlo en el cuadro de diálogo de deconvolución para desconvolver el archivo de imagen sin procesar. NOTA: Los parámetros de desconvolución podrían ajustarse según lo indicado en el manual de instrucciones del fabricante del software para obtener los resultados deseados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si es necesario, realice la resta manual de ruido de fondo y el ajuste de brillo/contraste en cualquiera o todos los canales de longitud de onda (color). Para ello, seleccione el botón de ajuste de contraste en el archivo de imagen desconvoluda.</li>
	<li>Guarde la imagen como un archivo TIFF seleccionando primero la opción de archivo en la parte superior del cuadro de diálogo D3D. A continuación, seleccione Guardar como TIFF, identifique y seleccione pilas Z adecuadas (que están dentro del foco), seleccione o anule la selección de los conjuntos de filtros deseados.</li>
	<li>Realice la cuantificación de datos utilizando cualquier software suministrado por el fabricante o programas de libre disponibilidad, como ImageJ5.<ol>
<li>Para la cuantificación del tamaño de celda, haga clic en la pestaña de la herramienta en el archivo de imagen D3D adecuado y, a continuación, seleccione la opción de medir distancias. Mida las distancias seleccionando los puntos inicial y final en el archivo de imagen deseado con el ratón a través de los clics izquierdos. NOTA: Es mejor acercar la imagen durante la cuantificación del tamaño de la celda.</li>
		<li>Para la cuantificación de la señal de fluorescencia, utilice la opción de inspector de datos en la pestaña de herramientas del archivo de imagen D3D adecuado. NOTA: Lo mejor es acercar la imagen y tener sólo filtros relevantes seleccionados al completar la cuantificación de la señal de fluorescencia.</li>
		<li>Para cuantificar la señal de fluorescencia, dibuje una caja con la opción de columna/fila establecida en una dimensión específica. Seleccione un área con la señal que desea cuantificar y registre el valor. Mida la señal de fondo utilizando el mismo cuadro de tamaño para seleccionar un área inmediatamente fuera de las celdas. Restar el valor de fondo del valor registrado de la señal de fluorescencia obtenida dentro de la célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
<li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li>
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<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
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<li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li>
<li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623(2019).</li>
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<li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+TEM%3A+new+insights+from+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li>
<li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li>
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<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology%3A+from+localization+to+dynamics%2C+from+ensembles+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).</li>
<li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Biology%22%5BJournal%5D)">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La microscopía ha seguido siendo un pilar en los estudios relacionados con organismos microbianos. Dado su tamaño de célula a escala de micrones, los estudios a nivel de una sola célula se han basado tradicionalmente en la microscopía electrónica (EM). Aunque EM se ha convertido en una técnica bastante poderosa en los últimos años, tiene sus propias limitaciones intrínsecas además del acceso limitado de los usuarios16. Las mejoras en las técnicas de microscopía de fluorescencia y el desarrollo de ...

El campo de la biología celular bacteriana se ha visto significativamente mejorado por los recientes avances en las técnicas de microscopía1,2. Entre otros instrumentos, los microscopios que son capaces de realizar experimentos de microscopía de fluorescencia timelapse siguen siendo una herramienta valiosa. Los investigadores pueden monitorear varios eventos fisiológicos en tiempo real utilizando proteínas fluorescentes tales como, fusión de reporteros transcripcionales y traslacionales basados en proteínas fluorescentes verdes (GFP), fluorescentes D-aminoácidos (FDAA)3,o usar otras manchas para etiquetar la pared celular, la membrana y el ADN. Por lo tanto, no es de extrañar que la microscopía de fluorescencia siga siendo popular entre los biólogos de células microbianas. Además de simplemente mostrar los fenotipos finales, proporcionar información sobre cómo surgen los fenotipos observados mediante la microscopía timelapse podría agregar un valor significativo a los hallazgos y potencialmente ofrecer pistas sobre qué procesos celulares están siendo blanco de posibles candidatosa medicamentos 4.
En este artículo se proporcionan los protocolos para realizar imágenes de alta resolución utilizando un microscopio de fluorescencia de campo ancho totalmente motorizado, invertido (véase la Tabla de Materiales). Estos protocolos podrían adaptarse a las necesidades de otros microscopios de fluorescencia que son capaces de realizar microscopía timelapse. Aunque el software discutido aquí corresponde al software específico suministrado por el fabricante como se indica en la Tabla de Materiales,el software comúnmente suministrado por otros fabricantes de microscopios o el ImageJ5de libre disposición, tienen herramientas equivalentes para analizar datos de microscopía. Para condiciones en las que el timelapse no es propicio, se podrían llevar a cabo experimentos de curso de tiempo como se describe en este artículo. Los protocolos descritos aquí proporcionan una guía detallada para estudiar los cambios fenotípicos en dos especies bacterianas diferentes: B. subtilis y S. aureus. Consulte la Tabla 1 para las cepas utilizadas.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Fisher BioReactivos</td><td>BP160-100 Grado de</td><td>Biología Molecular - Baja EEO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher BioReactivos</td><td>BP1755-10</td><td>Sin</td></tr> <tr>dioxano<td>Microscopio</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Soporte de microscopio invertido Olympus IX-71 personalizado; Torre de iluminación personalizada y módulo iluminador de luz transmitida. Objetivos: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm); ACEITE OLY 100X (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prisma Nomarski para 100X Objetivo; Cámara CoolSnap HQ2; Montaje SSI 7 colores; Cámara de control ambiental - opaca.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>Inhibidor de FtsZ</td></tr><tr><td>SoftWorx</td><td>GE</td><td></td><td>Software de imagen suministrado por el fabricante</td></tr></tbody></table>

microscopía de fluorescencia de células vivas para investigar la localización de proteínas subcelulares y cambios de morfología celular en bacterias

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Las investigaciones de factores que influyen en la división celular y la forma celular en las bacterias se realizan comúnmente junto con la microscopía de fluorescencia de alta resolución, ya que las observaciones realizadas a nivel de población pueden no reflejar realmente lo que ocurre a un nivel de célula única. La microscopía timelapse de células vivas permite a los investigadores monitorear los cambios en la división celular o la morfología celular que proporcionan información valiosa sobre la localización subcelular de proteínas y el momento de la expresión génica, como sucede, para ayudar potencialmente a responder preguntas biológicas importantes. Aquí, describimos nuestro protocolo para monitorear los cambios fenotípicos en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus usando un microscopio de desconvolución de alta resolución. El objetivo de este informe es proporcionar un protocolo simple y claro que pueda ser adoptado por otros investigadores interesados en llevar a cabo experimentos de microscopía de fluorescencia para estudiar diferentes procesos biológicos en bacterias y otros organismos.

Fenotipos GpsB Anteriormente hemos demostrado que Sa-GpsB es una proteína esencial ya que el agotamiento de GpsB utilizando un ARN antisentido da como resultado la lisis celular9. Aquí describimos cómo la aparición de varios fenotipos de división celular y cambios en la localización de proteínas podrían capturarse utilizando el protocolo de microscopía timelapse descrito en este artículo. Para ello, las cepas de S. aureus RB143 [SH1000 que albergan pEPSA5 (vector vacío...

Este artículo proporciona una guía paso a paso para investigar la dinámica de localización subcelular de proteínas y para monitorear los cambios morfológicos usando microscopía de fluorescencia de alta resolución en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Este protocolo facilita la observación directa de varios cambios fenotípicos a nivel de una sola célula y permite el monitoreo continuo de la localización de proteínas y el tiempo de expresión génica. La principal ventaja de la microscopía de fluorescencia es que es un método sencillo para monitorear varios procesos biológicos, como la división celular y los cambios en la morfología celular en las células vivas. Asegúrese de prestar especial atención al protocolo de preparación de muestras y explorar el software del microscopio para poder localizar los ajustes y las opciones enumerados en este protocolo.Una representación visual de este protocolo es fundamental porque permite a los usuarios ver y aprender los pasos significativos de la técnica a medida que configuran sus propios experimentos. Comience por etiquetar una alícuota de cinco a 50 microlitros del cultivo celular de interés con un tinte de tinción de membrana apropiado y agregar cinco microlitros de las células bacterianas manchadas en un resbalón de cubierta en la parte inferior de un plato de cultivo de vidrio de 35 mililitros. Coloque una losa de agarosa de 11 milímetros de diámetro sobre la muestra y toque suavemente para asegurarse de que la losa esté plana contra el resbalón de la cubierta.A continuación, agregue aproximadamente cinco microlitros de agua alrededor del resbalón de la cubierta para evitar que la almohadilla de agarosa se seque y permita que el plato de cultivo se equilibre a la temperatura dentro de la cámara de incubación de un microscopio de desconvolución de alta resolución durante 15 a 20 minutos. Para crear una imagen de la muestra, utilice la perilla de enfoque de ajuste grueso para asegurarse de que el objetivo se reduce por completo antes de inicializar el microscopio dentro del software del microscopio. Coloque una gota de 1.517 de aceite de índice de refracción en el objetivo de inmersión en aceite de 100x y transfiera el plato de fondo de vidrio que contiene la muestra al ataúd de carcasa metálica.Deslice suavemente la placa en la abrazadera del escenario y utilice la perilla de ajuste gruesa para elevar el objetivo hasta que el aceite entre en contacto con la parte inferior de cristal del plato. Utilice el ocular y la perilla de ajuste fino para enfocar la muestra y cambie al modo de cámara. En el software de imágenes de la ventana Resolver 3D, seleccione el icono Diseñar/Ejecutar experimento.Aparecerá un nuevo cuadro de diálogo titulado Diseñar/Ejecutar experimento. Abra las fichas Diseño y Sección en el cuadro de diálogo para establecer el número de pilas Z y el grosor de la muestra. Para medir el grosor de las celdas de la muestra, ajuste incrementalmente el plano Z utilizando las flechas arriba y abajo del cuadro de diálogo Resolver 3D, haciendo que las celdas desenfocan como los límites superior e inferior de la Adquisición de imagen.Después de ajustar la transmisión porcentual de la intensidad de luz y la duración de la exposición para los canales seleccionados individuales en el cuadro de diálogo Resolver 3D, haga clic en Lista de puntos para abrir la lista de puntos. En las pestañas Diseño y Lapso de tiempo, seleccione la casilla de verificación Lapso de tiempo e introduzca los parámetros de lapso de tiempo. Seleccione la opción lista Punto de visita e introduzca los puntos que se van a crear la imagen en el cuadro de texto, separando los puntos por comas o guiones para ver las secuencias completas.A continuación, edite los nombres de archivo y las ubicaciones de los archivos en la pestaña Ejecutar y seleccione Reproducir en el cuadro de diálogo Iniciar experimento para iniciar el experimento. Al final del análisis, abra los archivos de imagen RAW de interés en un programa de desconvolución adecuado y seleccione la pestaña Proceso y Desconvolútil. Realice cualquier resta de ruido de fondo manual y ajuste de contraste de brillo en cualquiera o todos los canales de longitud de onda según sea necesario antes de guardar la imagen como un archivo TIFF.Para la cuantificación de la longitud de celda, abra los archivos de imagen desenrevesados en el software suministrado por el fabricante o en el software de imágenes libres, como ImageJ, y abra la pestaña Herramienta. A continuación, seleccione Medir distancias y haga clic con el botón izquierdo en los puntos inicial y final del archivo de imagen deseado para medir la longitud de la celda. Para la cuantificación de la señal fluorescente, seleccione Inspector de datos.Dibuje un cuadro con la opción Columna/Fila establecida en la dimensión específica de interés y seleccione el área con la señal que se va a cuantificar. La adición de xilosa para inducir una cepa GGS 8 da como resultado un fenotipo de seis células. Mientras que los controles vectoriales vacíos parecen similares a las células de control cultivadas en ausencia de inductor.La sobreproducción de estafilococo aureus gpsB interrumpe la división celular en B.subtilis medida por microscopía de lapso de tiempo y cuantificación de la longitud celular. Además, los patrones de localización de FtsZ o una de las proteínas asociadas con esta proteína se pueden utilizar un reportero para estudiar y/o identificar nuevos compuestos antimicrobianos a través de la imagen de lapso de tiempo y la cuantificación de la longitud celular. Asegúrese de utilizar un aceite con el índice de refracción adecuado, ya que el índice de refracción puede cambiar dependiendo de la temperatura utilizada para la toma de imágenes.La desconvolución se puede realizar si el usuario desea eliminar el ruido fuera de foco, y también se puede realizar un análisis de datos que implique cuantificación de señal fluorescente y mediciones de longitud y anchura de celda.

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Aquí nos demuestran los protocolos para la realización de una sola molécula de microscopía de fluorescencia en células vivas de las bacterias para permitir funcionales complejos moleculares para detectar, seguir y cuantificar.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Este protocolo establece un procedimiento paso a paso para controlar el comportamiento de células individuales de bacterias diferentes en el tiempo el uso automatizado de fluorescencia time-lapse microscopía. Además, proporcionar directrices a analizar las imágenes de microscopía.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Biopelículas microbianas están constituidas generalmente por distintas subpoblaciones de células especializadas. Sola célula de análisis de estas subpoblaciones requiere el uso de reporteros fluorescentes. A continuación se describe un protocolo para visualizar y controlar varias...

Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

Fuente: Brzozowski, R. S. et al. Microscopía de fluorescencia de células vivas para investigar la localización de proteínas subcelulares y los cambios en la morfología celular en bacterias. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra la microscopía de fluorescencia de células vivas para visualizar cambios morfológicos en tiempo real en bacterias. Describe los pasos implicados en la obtención de imágenes, la adquisición en lapso de tiempo y la deconvolución para obtener imágenes de alta resolución...

Cambios morfológicos de imagen en bacterias mediante microscopía de fluorescencia de células vivas

El video describe la técnica de imagen FLIM-FRET para determinar la interacción proteína-proteína en bacterias vivas que expresan proteínas citoplasmáticas marcadas con proteínas fluorescentes, un eGFP donante y mCherry aceptor. La técnica combinada también permite la cuantificación de las proteínas que interactúan.

Imágenes FLIM-FRET para la caracterización de interacciones proteína-proteína en bacterias vivas

Se describe un método basado en proteínas fluorescentes de células vivas para iluminar vacuolas celulares (inclusiones) que contienen Chlamydia. Esta estrategia permite la determinación rápida y automatizada de la infectividad de Chlamydia en muestras y se puede utilizar para investigar cuantitativamente la dinámica de crecimiento de la inclusión.

El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

Las células bacterianas se organizan espacialmente muy. Para seguir esta organización en el tiempo en lento crecimiento células de Myxococcus xanthus , se desarrolló un montaje de imágenes de células vivas de fluorescencia de alta resolución espacio-temporal durante varias generaciones. Usando este método, se pudo determinar dinámica espaciotemporal de proteínas importantes para la segregación cromosómica y la división celular.

Imágenes en vivo de la célula de fluorescencia de ciclo completo de células vegetativas de la lento-crecimiento Social bacteria Myxococcus xanthus

Este protocolo de imágenes celulares de células bacterianas vivas permite visualizar las interacciones entre múltiples especies bacterianas a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten la observación de cada especie bacteriana en monocultivo o cocultura para interrogar las interacciones entre especies en comunidades bacterianas multiespecies, incluida la motilidad celular individual y la viabilidad.

Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula

Aprende microscopía de fluorescencia de alta resolución para estudiar la localización de proteínas y cambios morfológicos en células bacterianas vivas de Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus. Este protocolo permite el análisis a nivel de célula individual.

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias (Video) | JoVE Journal

Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

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