Un modelo basado en la línea celular murina de la inhibición crónica de CDK9 para estudiar defectos de alargamiento transcripcional no genéticos generalizados (TE^{definitivamente)}en cánceres

Dado que los cánceres de TEdeff son un obstáculo significativo contra la inmunoterapia, nuestro modelo farmacológico es una herramienta ventajosa porque imita adecuadamente los defectos transcripcionales y epigenéticos generalizados observados en estos cánceres, y permite estudiar estas anomalías no genéticas para obtener nuevos conocimientos, encontrar nuevos usos para los fármacos existentes, o encontrar nuevas estrategias contra tales cánceres. Este es un modelo fácil de establecer y generalizable para estudiar los defectos de alargamiento transcripcional en cánceres, lo que permite estudiar las interacciones tumoral-inmune tanto in vitro como in vivo. Este método también se puede aplicar a las líneas de carcinoma humano.

Hemos probado esto en T47D y CAL51 a corto plazo, dando lugar a características similares a TEdeff. El protocolo que describimos aquí proporciona un marco básico para minimizar las variables conocidas críticas para la generación de características similares a TEdeff por inhibición crónica de CDK9. Sin embargo, se debe tener cuidado de optimizar la dosis subletal exacta de flavopiridol para otras líneas murinas.

El impacto de la variación en la densidad de revestimiento celular, condiciones de cultivo, condiciones de estimulación de citoquinas pueden variar para diferentes líneas murinas celulares. Comience extrayendo ARN polia-positivo de la mitad de las muestras previamente agotadas por ARN ribosomal utilizando perlas magnéticas oligo dT. Resuspender las perlas en el vial por vórtice durante 30 segundos, y transferir 200 microlitros de las perlas a un tubo.

Agregue un volumen igual de búfer de enlace y mezcle el contenido. Coloque el tubo en un imán durante un minuto y deseche el sobrenadante. A continuación, retire el tubo del imán y resuspúle las perlas lavadas en 100 microlitros de tampón de unión.

Ajuste el volumen de la muestra agotada por ARN ribosomal a 100 microlitros con Tris-HCl de 10 mililitros a pH 7.5. Agregue 100 microlitros de búfer de unión a la muestra. Calienta la mezcla a 65 grados Celsius durante dos minutos para interrumpir las estructuras secundarias de ARN, y luego colocarla inmediatamente sobre hielo.

Agregue los 200 microlitros de ARN total a los 100 microlitros de perlas lavadas, y mezcle bien en un rotor durante cinco minutos. Coloque el tubo en el imán durante uno o dos minutos, retire cuidadosamente todo el sobrenadante, luego retire el tubo del imán y agregue 200 microlitros de tampón de lavado. Mezcle cuidadosamente la muestra en pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces, devuelva el tubo al imán durante un minuto y retire el sobrenadante.

A continuación, utilice un espectrofotómetro para medir la pureza y la concentración del ARNm aislado unido al cordón. Utilice la mitad restante de la muestra agotada por ARN ribosomal como entrada a las columnas de proteína A para inmunoprecipitar ARN con 7-metilguanosina monoclonal. Lavar la proteína Un perla magnética del kit RIP de acuerdo con el protocolo del fabricante para pre-unir el anticuerpo a las perlas, del anticuerpo 7-metilguanosina al cordón suspendido en 100 microlitros de tampón de lavado del kit.

Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras gira a baja velocidad. A continuación, centrifugar los tubos brevemente, y ponerlos en el separador magnético. Retire y deseche el sobrenadante, luego quite los tubos del separador magnético y resuspender las perlas con 500 microlitros de tampón de lavado.

Vórtice los tubos, centrifugarlos brevemente, y colóquelos de nuevo en el separador magnético, y de nuevo deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 120 nanogramos de ARN agotado por ARN ribosomal a las perlas unidas a anticuerpos junto con un microlitro del inhibidor de la ARNa, e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 60 a 90 minutos con agitación leve. Después de la incubación, gire hacia abajo la muestra a 300 veces g durante 10 segundos, y transfiera el sobrenadante con el ARNm sin acople a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Repita el lavado dos veces más con 100 microlitros de tampón de lavado y acarre el sobrenadante recogido. Eluda el ARNm tapado de las cuentas añadiendo 300 microlitros de tampón de liceo de urea preparados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y calentando la mezcla a 65 grados Celsius durante dos a tres minutos. Combine 300 microlitros de la muestra eluida con 300 microlitros de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo, invierta para mezclar y deje durante 10 minutos.

Mezcle suavemente la muestra de nuevo y centrifugar durante dos minutos. Pipetee cuidadosamente la capa superior a un tubo fresco y deseche la capa inferior. Añadir 300 microlitros de 2-propanol y 30 microlitros de acetato de sodio de tres molares a la muestra, invertirlo un par de veces, y ponerlo en menos 20 grados Celsius durante 20 horas.

Después de la incubación, centrifugar la muestra durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y seque el pellet a temperatura ambiente durante cinco minutos. Resuspender el pellet en agua libre de nucleasas, y medir la pureza y concentración del ARN con un espectrofotómetro.

Aísle las células CD8 positivas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y, a continuación, resuspender las células en el búfer del sistema de separación magnética disponible comercialmente. Agregue 100 microlitros de cóctel de anticuerpos por cada mililitro de células e incubar las células sobre hielo durante 15 minutos. Luego, agregue 100 microlitros de cuentas magnéticas por cada 100 microlitros de cóctel de anticuerpos, y deje las células en hielo durante otros 15 minutos.

Después de la incubación, agregue siete mililitros de búfer de separación magnética a las células, aliculice de tres a cuatro mililitros a un tubo nuevo y coloque el tubo sobre un magnético durante cinco minutos. Decantar el líquido con las células CD8 positivas a un tubo fresco sobre hielo. Luego, agregue los tres a cuatro mililitros restantes de células a las cuentas magnéticas, y coloque el tubo en el imán durante cinco minutos.

Decantar el segundo lote de células CD8 positivas al tubo con el primer lote. Semillas de fibroblasto adherente de ingeniería SAMBOK junto con la molécula co-estimulante en 75.000 células por pozo en placas de 24 pozos, y cultivo en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono. Después de 24 horas, lave la monocapa APC una vez con el medio de Dulbecco modificado de Iscove, y agregue 0,5 veces 10 a las seis células ingenuas en dos mililitros de medio complementados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.

Cultivo de las células durante 20 horas, luego cosecha suavemente las células OT-I no adherentes mediante la recolección de los medios y la peletización de las células a 191 veces g durante dos minutos. Cuente las células y las sembrar en una relación uno a uno en un co-cultivo con B16/F10, B16/F10-OVA no tratada y células B16/F10-OVA pretratadas con flavopiridol. Cultivo de las células durante 20 horas en una incubadora humidificada de dióxido de carbono de 37 grados, 5%dióxido de carbono, luego retire las células CD8 positivas OT-I, y lave las células adherentes B16/F10-OVA en PBS.

Pruebe los tres grupos de células adheridas en 05%EDTA con trippsina durante cinco minutos, y luego pele en tripas a 191 veces g durante cinco minutos. Incubar las células B16/F10-OVA cosechadas en PBS frío con tinte de viabilidad y anticuerpos etiquetados relevantes, luego analizar la viabilidad con citometría de flujo. Este protocolo se ha utilizado para establecer un modelo de células defectuosas de alargamiento de transcripción que muestra una profunda pérdida de fosforilación en la posición de la serina 2 en el dominio de repetición C-terminal de ARN polimerasa II y una disminución significativa en H3K36me3, que está implicado en la definición de límites exones e inhibir transcripciones crípticas descontroladas.

Las células muestran defectos críticos de procesamiento de ARNm con proporciones crecientes de ARNM mal tapados y no poliadenilados. Además, en este modelo celular se observa una represión específica de los genes clave de la vía de respuesta inflamatoria y la muerte celular mediada por FasL. Un ensayo exploratorio para comprobar si el modelo celular confiere resistencia al ataque de células T citotóxicas muestra que los defectos crónicos de alargamiento de transcripción inducidos por flavopiridol pueden otorgar un medio de escape de un ataque inmune antitumo tumoral.

Las células B16/F10 tratadas con Flavopiridol sobreexpresaron de forma estable el gen OVA no eran susceptibles a las células T citotóxicas CD8 positivas, que tienen una toxicidad selectiva hacia las células que expresan OVA. Las células no pretratadas con flavopiridol sufrieron una muerte celular importante, mientras que los padres B16/F10 que no expresan el antígeno OVA sobrevivieron. Es importante recordar que la reducción del nivel de trimilación de fosfoserina 2 y H3K36 en el tratamiento con flavopiridol nanomolar de 25 nanomolares no garantiza una reducción tanto en el nivel de fopsho-STAT1 como en el nivel de fosfo-NF-kappaB.

Cada línea de carcinoma de ratón es única, y JAK1 y CCNT1 pueden rescatar el efecto del flavopiridol. Además, este modelo se puede utilizar in vivo para controlar la resistencia ofrecida por los cánceres TEdeff contra las respuestas innatas y adaptativas antitumorales. Por ejemplo, los tratamientos anti-asialo podrían utilizarse para regular la actividad de las células NK, y la terapia de punto de control inmune podría administrarse a ratones portadores de tumor TEdeff.

La carga de linfocitos infiltrantes de tumores, o TIL, es un indicador de éxito en la inmunoterapia. Nuestro modelo ha allanado el camino para explorar el grado de activación y agotamiento de los TIL en el microambiente de cáncer TEdeff antes y después de la inmunoterapia.