Name: Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a medir la secreción de insulina en líneas celulares beta usando luciferasa Gaussia. Este ensayo rápido y económico facilita el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de la diabetes.

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Los autores agradecen a todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio Cobb por su valioso trabajo y debate, y a Dionne Ware por la asistencia administrativa. Michael Kalwat cuenta con el apoyo de una Fundación de Investigación de la Diabetes Juvenil SRA-2019-702-Q-R. Este trabajo fue posible gracias a NIH R37 DK34128 y Welch Foundation Grant I1243 a Melanie Cobb. Las primeras partes de este trabajo también fueron apoyadas por un NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.

1. Preparación de reactivos, medios y buffers (Tabla 1)
<ol><li>Preparar el medio completo de la min6 en 500 ml de medio águila modificado (DMEM) de alta glucosa (4,5 g/L) de Dulbecco con los siguientes aditivos: 15% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 292 g/ml de glutamina y 50 m lglutinamina y 50 ml -mercaptoetanol. NOTA: La línea celular estable en este caso se mantiene en 250 g/ml de antibiótico G418.</li>
	<li>Preparar el tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBH) haciendo una solución que contenga 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2y 1 mg/ml de aalbúmina de suero bovino de grado bovino (BSA). La glucosa se añadirá cuando se especifique a partir de una población de 2 M. NOTA: KRBH se utiliza para incubar las células con y sin estimulación con el fin de evaluar la insulina y / o secreción de gaussia luciferasa.</li>
	<li>Prepare la solución de material de celenterazine (CTZ) de la siguiente manera. Preparar el metanol acidificado añadiendo 106 ml de HCl concentrado a 10 ml de metanol. A continuación, disolver CTZ liofilizado en metanol acidificado a 1 mg/ml y almacenar a -80 oC en tubos de tapa de tornillo. NOTA: Estas existencias conservan suficiente actividad en los ensayos de rutina de luciferasa, incluso después de 1 año de almacenamiento adecuado.</li>
	<li>Preparar el tampones del ensayo Gaussia luciferase (GLuc) basado en la literatura 9, así como la información de patente10 para ayudar en la vida media del ensayo Gaussia luciferase en formato de placa de 96 pozos. Utilice la fórmula: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/ml Na2PO4, 300 mM de ascorbato sódico, 200 mM Na2SO3 en agua. Congele las existencias a -20 oC. Después de descongelar, almacene el tampón a 4oC.</li>
	<li>Para preparar la solución de trabajo Gaussia luciferase, añada 4,2 l/ml de la solución de stock CTZ de 1 mg/ml (2,36 mM) al búfer de ensayo GLuc. Esto da como resultado una solución de trabajo de 2x de 10 M de CTZ que tendrá una concentración final de 5 M en el ensayo.</li>
</ol>2. Cultivo de células InsGLuc MIN6 y sembrado para ensayos de secreción
<ol><li>Para cultivar células MIN6, tiza y sembra las células una vez por semana usando técnicas de cultivo celular estándar. Cambie los medios en las celdas cada dos o tres días. Incluya el antibiótico de selección adecuado, como 250 g/ml de G418 en los medios de comunicación.<ol>
<li>Para proporcionar un número suficiente de células semanalmente para los experimentos, mantenga las células en frascos T75. La sembración de 6 x 106 células por T75 en 10 ml de medios normalmente producirá 30 x 106 a 40 x 106 celdas en total por T75 después de 7 días de cultivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar las células para el enchapado en placas de 96 pocillos, lave un confluente T75 de células InsGLuc MIN6 dos veces con PBS y agregue 2 ml de trippsina. Incubar a 37oC durante 5 min o hasta que las células se disocien del matraz. Determinar la concentración celular por mililitro.<ol>
<li>Diluir las células en un medio completo a 1 x 106 celdas/ml para dar como resultado 1 x 105 celdas en 100 ol por poca en una placa de 96 pocillos. Las células deben ser lo suficientemente confluentes para el ensayo después de 3-4 días. NOTA: Para extender el período de cultivo, se puede chapar la mitad de la concentración celular. No se requieren cambios en los medios antes del día del ensayo, a menos que las células deban someterse a tratamientos experimentales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ensayo de secreción de Gaussia luciferase estimulada por glucosa
<ol><li>El día del ensayo preparar suficiente KRBH para el experimento (paso 1.2). Se requiere un mínimo de 50 ml de KRBH por placa de 96 pocillos, por lo tanto, prepare al menos 75 ml para asegurar un búfer suficiente para el experimento. Prepare un tampón adicional si diferentes combinaciones de condiciones de tratamiento de medicamentos requerirán KRBH para la dilución.</li>
	<li>Prepare un depósito con KRBH libre de glucosa. Decantar el medio de 96 placas de pozo sin invertir rápidamente la placa sobre un fregadero de laboratorio y luego blotar firmemente en una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de medio.</li>
	<li>Usando una pipeta electrónica o manual de 8 canales, pipeta 100 l /bien KRBH desde el depósito a través de la placa de 96 pocillos. Repita el proceso para un total de dos lavados.</li>
	<li>(Paso opcional de los tratamientos compuestos agudos) Si no realiza tratamientos farmacológicos, continúe con los pasos 3.5 y 3.6 sin modificaciones. Para probar los efectos de moléculas pequeñas en la secreción de insulina, se pueden agregar compuestos a las células durante el período de preincubación, período de estimulación, o ambos.<ol>
<li>Una técnica es añadir compuestos por lotes al KRBH en tubos de 1,5 ml y utilizar una pipeta digital ajustable de 8 canales para transferir el fármaco-KRBH de los tubos a las células en placas de 96 pocillos. NOTA: Si no hay una pipeta ajustable disponible, se puede hacer una réplica de 96 pocillos de fármaco-KRBH y se puede utilizar una pipeta estándar de 8 canales para transferir el búfer. Se pueden realizar modificaciones adicionales en el paradigma del tratamiento para tratar las células durante 24 horas en medios anteriores al ensayo, como se describió anteriormente1,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 100 l de KRBH que contenga la concentración deseada de glucosa o compuestos y colocar el plato en la incubadora de 37 oC durante 1 h. NOTA: Dependiendo del diseño experimental, es extremadamente útil tener una pipeta electrónica multicanal que permita la transición de las distancias de canal de una columna de ocho tubos de 1,5 ml a las 8 filas de una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Después de la 1 h de preincubación, decantar el tampón en el fregadero y blot firmemente en la toalla de papel. Añadir 100 l de KRBH libre de glucosa por pozo para lavar el fondo acumulado de Gaussia luciferase. Decantar la placa de nuevo y añadir condiciones de control y estimulantes a la placa a 100 ol por poca. Colocar el plato en la incubadora de 37oC durante 1 h.</li>
	<li>Recoja cuidadosamente 50 ml de sobrenadante utilizando una pipeta multicanal, cambiando las puntas entre las condiciones de tratamiento según sea necesario, y transfiera el sobrenadante a una placa de ensayo blanca opaca limpia de 96 pocillos. NOTA: Las placas de fondo transparente de paredes blancas se pueden utilizar si es necesario, aunque se perderá una cantidad significativa de señal de luciferasa.</li>
	<li>Después de la recolección de 50 l de sobrenadante KRBH, la muestra se puede analizar inmediatamente. Si es necesario, sellar y almacenar las muestras a 4 oC durante unos días (vida media de la actividad de GLuc a 6 días) o -20 oC hasta un mes11,12.</li>
</ol>4. Ensayo secreto de Gaussia luciferase
<ol><li>Para preparar la solución de trabajo del ensayo GLuc, pipetee la cantidad necesaria de solución de stock CTZ (4,2 l/ml) en el búfer de ensayo DeLuc. Para evitar el calentamiento del CTZ, pipetee el CTZ rápidamente en el congelador de -80 oC o mantenga el tubo en hielo seco.</li>
	<li>Usando una pipeta electrónica multicanal, agregue rápidamente 50 sde la solución de trabajo de ensayo GLuc por pozo en el plato de 96 pozos que contiene los sobrenatantes KRBH recogidos. Si hay gotas en los lados de cualquier pozo, gire brevemente la placa en una centrífuga de columpio de mesa.</li>
	<li>Lea la luminiscencia en un lector de placas adecuado en pocos minutos y lea cada pozo con un tiempo de integración de 0,1 s.</li>
</ol>

<ol><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li>
<li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li>
<li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li>
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<li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li>
<li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therarpy%22%5BJournal%5D)">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li>
<li>Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).</li>
<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li>
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<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
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<li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li>
<li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li>
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<li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li>
<li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li>
<li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2%2B+Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li>
<li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+%26%2334%3Bno-wash%26%2334%3B+high-throughput+alternative+to+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">AlphaLISA immunoassay platform- the &#34;no-wash&#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li>
<li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Sociecy+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).</li>
<li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li>
<li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí presentamos un método para evaluar rápidamente las respuestas de secreción de insulina estimuladas por la glucosa de las células MIN6. Para obtener las mejores respuestas en el ensayo es importante sembrar las células MIN6 con la densidad adecuada y permitir que se conviertan en un confluente del 85-95%. Esto mejora las respuestas celulares a la glucosa debido a la mejora de los contactos y la sincronización de células celulares, que se produce tanto en los islotes primarios17,<sup...

El método presentado aquí permite que la secreción de insulina de una línea de células beta modificadagenéticamente se ensaye rápida y asequiblemente en formato de 96 placas de pozo. La clave de este protocolo es una versión modificada de la insulina con la Gaussia luciferase naturalmente secretada (GLuc, 18 kDa) insertada (ver Figura 1) en el péptido C para generar insulina-Gaussia (InsGLuc)1,2. Otras proteínas más grandes, como la GFP (25 kDa), se han insertado con éxito en el péptido C de la insulina y han exhibido el procesamiento post-traduccional esperado de la proinsulina-GFP a la insulina y el péptido GFP-C3,4. Para el ensayo de este protocolo, GLuc ha sido optimizado para la expresión de mamíferos y sehan introducido dos mutaciones para mejorar la cinética brillante 5,6. Múltiples combinaciones y réplicas de las condiciones de tratamiento se pueden probar fácilmente en formato 96-bien-placa y los resultados de la secreción se pueden obtener inmediatamente después del experimento.
Una ventaja importante, como se señaló anteriormente2, es el bajo costo de esta medición de secreción basada en luciferasa (< $0.01/well) que la diferencia de los costos relativamente más altos y los aspectos técnicos de los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) ( > Ensayos de "2$/bien) y fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) u otros ensayos de anticuerpos basados en la transferencia de energía por resonancia de la familia (FRET) (> $1/bueno). En comparación con estos ensayos basados en anticuerpos, que miden la concentración de insulina haciendo referencia a una curva estándar, el ensayo InsGLuc mide la actividad secretora como una comparación relativa con los pozos de control en la placa. Por esa razón, cada experimento requiere la inclusión de controles adecuados. Esta distinción es una compensación para permitir mediciones rápidas y baratas. Sin embargo, se ha demostrado que la secreción de InsGLuc está altamente correlacionada con la secreción de insulina medida por ELISA1,2. Esta tecnología se ha ampliado para el cribado de alto rendimiento1,2,7 y ha llevado a la identificación de nuevos moduladores de la secreción de insulina, incluyendo un inhibidor del canal de potasio cerrado por voltaje7 así como un producto natural inhibidor de la función celular, cromomicina A28. El uso de InsGLuc es más adecuado para los investigadores que planean probar continuamente muchas condiciones de tratamiento diferentes para su impacto en la secreción de insulina. En los experimentos de seguimiento es necesario repetir los hallazgos clave en una línea celular de los padres, y de manera óptima en islotes murinos o humanos, y medir la secreción de insulina mediante un ensayo basado en anticuerpos.

<table><tbody><tr><td>Materiales de cultivo celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rIns-GLuc células MIN6 estables</td><td></td><td></td><td>Línea celular parental MIN6 que expresa de manera estable pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc y se mantiene en 250 ug/ml G418</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>4.5 g/L</td></tr> medio <tr><td>de glucosa suero bovino fetal,</td> Penicilina <td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td>inactivada por calor</tr><tr><td>/ Estreptomicina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP 176-100</td><td></td></tr><tr><td>glutamina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-500</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G418-10</td><td>Solución madre 250 mg/mL en agua. Congele las alícuotas a -20 °C.</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-000</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Celltreat</td><td>229196</td><td></td></tr><tr><td>Reservorios de reactivos (50 mL)</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td><reactivos > ensayo de secreción fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (grado RIA)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-146-952</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hepes, pH 7,4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-213-365</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>15568414</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Medicamentos opcionales para experimentos de estimulación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diazoxide</td><td>Sigma</td><td>D9035</td><td>Solución madre: 50 mM en NaOH 0.1N. Agregue la misma cantidad de 0.1N HCl a cualquier tampón donde se agregue diazóxido.</td></tr><tr><td>epinefrina (sal de bitartrato)</td><td>Sigma</td><td>E4375</td><td>Solución madre: 5 mM en agua</td></tr><tr><td>PMA (forbol 12-miristato)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td>Solución madre: 100 y micro; M en DMSO</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Guassia materiales de ensayo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato disódico (Na2HPO4)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>G334</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de sodio</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44680-1000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44608-5000</td><td>Solución madre: 0,5 M pH 8</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-1000.0</td><td>Solución madre: 1 M pH 8</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1775922</td><td>La US7718389 de patentes de EE. UU. sugirió que el ascorbato puede aumentar la estabilidad de la celenterazina.</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Sigma</td><td>S0505-250G</td><td>Patente de EE. UU. US8367357 sugerido sulfito puede disminuir el fondo debido a BSA</td></tr><tr><td>Coelenterazina (nativa)</td><td>Nanolight / Prolume</td><td>3035MG</td><td>Solución madre: 1 mg/ml en MeOH acidificado (2,36 mM)</td></tr><tr><td>OptiPlate-96, Microplaca blanca opaca de 96 pocillos</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005290</td><td>Cualquier placa blanca opaca de 96 pocillos debería ser suficiente. Las placas inferiores transparentes también funcionarán, sin embargo, se perderá parte de la señal.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Lector de placas híbrido o equivalente</td><td>BioTek</td><td>8041000</td><td>Se requiere un lector de placas con detección de luminiscencia y capacidades de placas de 96 pocillos.</td></tr><tr><td>Pipeta VOYAGER de 8 canales (50-1250 y micro; L)</td> <td>Integra</td><td>4724</td><td>Una pipeta multicanal automatizada es extremadamente útil para la adición rápida de reactivos de luciferasa y celdas de recubrimiento en formato de 96 pocillos</td></tr><tr><td>, 8 canales, 200 y micro; Pipeta L</td><td>Transferpette S 20-200 &micro; L</td><td>2703710</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la luciferase co-secretada

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

La realización de ensayos basados en anticuerpos para la recolección secreta de insulina después de la muestra suele requerir unas horas a un día de tiempo de ensayo y puede ser costoso, dependiendo del ensayo específico. Los ensayos de luciferasa secretas aceleran los resultados y reducen sustancialmente el costo del ensayo por muestra. Aquí presentamos un enfoque relativamente infrautilizado para medir la actividad secretora de insulina de las células pancreáticas mediante el uso de Gaussia luciferasa insertada genéticamente dentro del péptido C. Durante el procesamiento proteolítico de la proinsulina, el péptido C se extirparte liberando la luciferasa dentro de la vesícula secretora de insulina donde se co-secreta con insulina. Los resultados se pueden obtener en cuestión de minutos después de la recolección de muestras debido a la velocidad de los ensayos de luciferasa. Una limitación del ensayo es que es una medida relativa de la secreción de insulina y no una cuantificación absoluta. Sin embargo, este protocolo es económico, escalable y se puede realizar utilizando la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia estándar. Las pipetas multicanal analógicas y digitales facilitan múltiples pasos del ensayo. Muchas variaciones experimentales diferentes se pueden probar simultáneamente. Una vez que se decide un conjunto focalizado de condiciones, las concentraciones de insulina deben medirse directamente utilizando ensayos basados en anticuerpos con curvas estándar para confirmar los resultados del ensayo de luciferas.

Para medir el rendimiento del ensayo en condiciones de control, se puede completar una simple curva de dosis-respuesta de glucosa o una estimulación utilizando el paradigma de diazoxida. En el caso de la primera, la preincubación de las células durante 1 h en condiciones libres de glucosa seguida de tratamiento durante 1 h con concentraciones de glucosa crecientes debe dar lugar a muy poca actividad secretora en y por debajo de 5 mM, mientras que el aumento de la secreción se observa por ...

Este protocolo describe cómo realizar ensayos rápidos de luciferasa de bajo costo a rendimiento medio utilizando una Gaussia luciferase ligada a la insulina como un proxy para la secreción de insulina de células beta. El ensayo se puede realizar con la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia y pipetas multicanal.

Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Este protocolo describe un enfoque rápido alternativo para el ensayo de la secreción de insulina a partir de líneas celulares beta para acelerar el descubrimiento y caracterización de fármacos. Este enfoque es útil porque se pueden probar varios tratamientos simultáneamente, los resultados están disponibles inmediatamente después del experimento y este ensayo es más asequible que otros. La aplicación de este método hacia la detección de nuevos moduladores de moléculas pequeñas de secreción de insulina puede identificar compuestos principales para futuras terapias de diabetes.Mayor conocimiento de la función de la célula beta puede contribuir a una mayor comprensión de la secreción de proteínas o neurotransmisores en general. Este reportero de secreción de insulina se ha establecido para trabajar en un sistema lentiviral en otras líneas de células beta y en islotes humanos. Este ensayo debe ser muy sencillo para las personas familiarizadas con el cultivo celular y el funcionamiento de pipetas multicanal.Antes de planificar cualquier experimento, verifique que sus líneas celulares beta parentales o estables estén respondiendo correctamente a la glucosa utilizando una insulina ELISA. Comience preparando Krebs-Ringer Bicarbonato Buffer o KRBH y gaussia luciferase solución de trabajo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cultivar células MIN6 en matraces T75 utilizando técnicas estándar de cultivo celular.Prepare las células InsGLuc MIN6 para el enchapado lavando un matraz de células confluentes dos veces con PBS y añadiendo dos mililitros de trippsina. Incubar las células a 37 grados centígrados durante unos cinco minutos, o hasta que las células se disocúquen del matraz. Determinar la concentración celular y diluir las células en medios completos a un millón de células por mililitro, lo que equivale a 100.000 células por cada 100 microlitros en cada pozo de una placa de 96 pozos.Las células deben ser suficientemente confluentes para el ensayo después de tres a cuatro días. El día del ensayo, prepare suficiente KRBH libre de glucosa para el experimento y prepare un depósito. Decantar el medio de la placa de 96 pozos invirlizándolo rápidamente sobre un fregadero de laboratorio y luego hinchando firmemente en una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de medio.Lave la placa dos veces con 100 microlitros de KRBH sin glucosa por pozo, y si realiza tratamientos farmacológicos, agregue medicamentos al KRBH de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego, agregue 100 microlitros de KRBH libre de glucosa a cada pozo e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, decantar el tampón y manchar la placa sobre una toalla de papel.Añadir 100 microlitros de KRBH libre de glucosa por pozo para lavar cualquier fondo acumulado y luego decantar la placa. Añadir condiciones de control y estimulación con o sin tratamientos farmacológicos a 100 microlitros por pozo e incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora. Es importante incluir controles basales y estimulados en cada placa para determinar la capacidad de respuesta de las células en un experimento dado.Si las células han perdido su respuesta con el tiempo, reculquelándolas de un stock de nitrógeno líquido fresco. Recoja cuidadosamente 50 microlitros de sobrenadante usando una pipeta multicanal, transfiéralo a una placa de ensayo blanca opaca de 96 bien, y mantenga la muestra a temperatura ambiente en el banco hasta que esté lista para el ensayo de luciferasa. Preparar la solución de trabajo del ensayo de gaussia luciferasa pipeteando la cantidad necesaria de solución de CTZ en el tampón de ensayo GLuc, teniendo cuidado de evitar que el CTZ se caliente.Utilice una pipeta multicanal para añadir rápidamente la solución de trabajo del ensayo GLuc a la placa con los sobrenadantes KRBH. Si hay gotas en los lados de los pozos, gire brevemente la placa en una mesa, centrifugar cubo oscilante. A continuación, coloque la placa en el lector de placas y lea la luminiscencia con un tiempo de integración de 0,1 segundos.Este ensayo se ha probado en condiciones de control midiendo la secreción de insulina como respuesta al aumento de las concentraciones de glucosa. Se observa muy poca actividad secretora por debajo de cinco mililitroras, y se observa un aumento de la secreción por encima de ocho mililitros. Las células exhiben la respuesta secretora esperada cuando se enfrentan al paradigma del diazoxida.El tratamiento con diazoxida bloquea la secreción de insulina si no hay cloruro de potasio extracelular. Cuando el cloruro de potasio está presente, la secreción se puede amplificar con una adición adicional de glucosa. También se ha demostrado que las células InsGLuc MIN6 responden según lo esperado a la secreción modulando compuestos como cloruro de potasio, diazoxide, PMA, y epinefrina.Después de este procedimiento, los resultados críticos deben confirmarse mediante el análisis de los sobrenadantes KRBH en ensayos ELISA o HTRF basados en anticuerpos que permitan la determinación de las concentraciones de insulina. Un grupo del Broad Institute, que me allanó el camino para utilizar cada vez más este ensayo en mi investigación, ha realizado mucho trabajo pionero. Múltiples grupos de investigación, incluyendo nosotros y el grupo en el Broad, están utilizando este enfoque en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos en el campo de la diabetes.

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Investigación

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Biology

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Aprende a medir la secreción de insulina en líneas celulares beta usando luciferasa Gaussia. Este ensayo rápido y económico facilita el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de la diabetes.

Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada

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