Agarose reticulado activado para el desarrollo rápido de resinas de cromatografía de afinidad - Captura de anticuerpos como caso de estudio
16 de agosto de 2019
En este procedimiento, un ligando de epítopos a base de DsRed se inmoviliza para producir una resina de afinidad altamente selectiva para la captura de anticuerpos monoclonales a partir de extractos de plantas crudas o sobrenatantes de cultivo celular, como alternativa a la proteína A.
Los anticuerpos monoclonales dominan el mercado biofarmacéutico y suelen ser purificados por cromatografía de Proteína A. La resina según es un factor de costo importante durante la producción que afecta el precio de las terapias basadas en anticuerpos. Aquí describimos un nuevo ligando de afinidad basado en la proteína fluorescente que se lee como portador del epítopo lineal del anticuerpo neutralizante del VIH 2F5.
En general, nuestro método permite la rápida generación de resinas de cromatografía de afinidad que se pueden utilizar para la captura de anticuerpos monoclonales. Demostramos esta capacidad mediante la captura de anticuerpos 2F5 a partir de extracto de planta bruta. Optimizamos las condiciones de captura y el búfer de la solución para mejorar la capacidad de unión dinámica y la reutilización de la resina.
Nuestra resina permite condiciones generalmente más flexibles que la proteína A y tiene el potencial de reducir los costos de purificación de los anticuerpos monoclonales. Además, la resina se puede adaptar fácilmente a otros anticuerpos que se unen a los epítopos lineales. Para comenzar este procedimiento, ajuste la concentración de la solución de ligando de afinidad preparada para que esté en el rango de 5 a 15 gramos por litro según lo definido por el diseño de experimentos.
Almacene la solución sobre hielo hasta que la reacción de acoplamiento esté lista. A continuación, llene una jeringa de dos mililitros con la solución DFE. Y prepare un adaptador para montar las jeringas en columnas de agarosa de enlace cruzado activadas por el NHS con un volumen de lecho de un mililitro.
Por cada 10 columnas utilizadas para el acoplamiento, prepare 30 mililitros de solución de desactivación, 30 mililitros de solución de pH bajo y un mililitro de solución de almacenamiento. Luego prepare 20 mililitros de un ácido clorhídrico milimolar en un tubo. Y incubarlo en hielo durante al menos 20 minutos.
Prepare una escala de precisión para monitorear el flujo a través de fracciones para todos los pasos durante la reacción de acoplamiento. Después de esto, abra una columna de agarosa reticulada activada por NHS sellada. Aplique una gota de búfer en la entrada del adaptador, para evitar que el aire entre en la columna.
Monte el adaptador de la jeringa en la entrada de la columna. Lavar la columna con seis mililitros de hielo frío de un ácido clorhídrico milimotor, a un caudal inferior a un mililitro por minuto. Con una jeringa de dos mililitros, inyecte inmediatamente 1,5 mililitros de solución de DFE a un caudal inferior a un mililitro por minuto.
Y recoja el flujo a través de la fracción en una escala de precisión para su posterior análisis. Selle la columna en ambos extremos e incubar durante 15 a 45 minutos, a 22 grados centígrados. A continuación, inyectar seis mililitros de la solución de activación, seguido de seis mililitros de solución de pH bajo, a un caudal inferior a un mililitro por minuto, eliminar los ligandos no unidos covalentemente de la resina.
Inyecte seis mililitros de la solución de activación e incubar la columna durante 15 minutos. Después de esto, inyecte seis mililitros de solución de pH bajo en la columna. Seguido de seis mililitros de la solución de activación.
A continuación, inyecte otros seis mililitros de solución de pH bajo en la columna. Inyecte dos mililitros de solución de almacenamiento en la columna y guárdelo a cuatro grados centígrados. Primero preparar 100 mililitros del extracto vegetal clarificado que contiene 2F5, o el sobrenadante para el sistema de expresión basado en células preferido, que también contiene 2F5.
A continuación, prepare el búfer de equilibrio y el búfer de ilusión de alta fuerza X de hierro, como se describe en el protocolo de texto. Enjuague el sistema de cromatografía con los buffers. Monte una columna de afinidad DFE en el sistema de cromatografía.
Y equilibrar con cinco CV de tampón de equilibrio, a un caudal de un mililitro por minuto. Monitoree la absorbancia UV a 280 nanómetros. A continuación, cargue 80 mililitros del extracto de planta clarifico, o el sobrenadante en la columna a un caudal de 5 mililitros por minuto.
Garantizar un tiempo de contacto de dos minutos. Recoja el flujo a través de muestras en fracciones de dos mililitros o reconstrucción de curvas de ruptura. Almacene el flujo a través de muestras a cuatro grados centígrados, si no es posible realizar un análisis inmediato de la muestra.
Después de esto lavar la columna con 6CV de tampón de equilibrio. Recoger una muestra al principio, medio y final del lavado. Diluir el MAB2F5 con cinco volúmenes de tampón de ilusión de alta resistencia iónica.
Recoja la fracción DFE cuando la señal UV a 280 nanómetros haya aumentado a cinco unidades de absorbancia de mililia por encima de la línea de base. Optimice el búfer de ilusión para cada par epitopé-anticuerpo, como se describe en el protocolo de texto. La proteína de fusión DFE se expresa en plantas de tabaco transgénicas, cultivadas en invernadero.
La recuperación general de DFE es de 23,5 miligramos por kilogramo. Con una pureza de más del 90%La cantidad absoluta de DFE inmovilizada en la resina aumenta con la masa de DFE inyectada en la columna, y mesetas en alrededor de 15 gramos por litro, mientras que el rendimiento de acoplamiento disminuye continuamente a medida que se inyecta más DFE. Las moléculas DFE se ven para retener su florescencia roja, incluso después del acoplamiento.
La intensidad del color corresponde a la cantidad total de DFE inmovilizado. Por lo tanto, el color de columna se puede utilizar como un parámetro de control de calidad simple para estimar la eficiencia del acoplamiento y la calidad de la columna. El anticuerpo recombinante 2F5 se produce transitoriamente en plantas nicotiana benthamiana cultivadas en un fitotrón.
La captura de 2F5 del extracto de la planta cruda, se prueba utilizando columnas de afinidad, junto con aproximadamente siete miligramos de DFE purificado. Una concentración de cloruro de magnesio de 1,25 molares es suficiente para eluir 2F5 de la resina de afinidad DFE con una recuperación cercana al 100% y una pureza de aproximadamente 97%que es comparable a las resinas de proteína A. El DBC de la resina de afinidad DFE en 10%2F5 avance, disminuye linealmente en el transcurso de los 25 ciclos, a alrededor del 15% del valor inicial.
Utilizamos un enfoque de diseño de experimentos para optimizar la capacidad de acoplamiento de nuestro ligando de afinidad. Estas condiciones se pueden afinar para otros ligandos en el futuro. Nuestro método utiliza proteína florescente para enhebrar una proteína portadora para el ligando específico del producto.
Al mismo tiempo, sólo tiene que añadir funciones como un indicador de calidad visual del procedimiento de movilización, proporcionando una retroalimentación inmediata e intuitiva al operador.
Descripción general
Este estudio presenta una resina de afinidad novedosa basada en DsRed para la captura selectiva de anticuerpos monoclonales a partir de extractos vegetales crudos o sobrenadantes de cultivo celular. El método tiene como objetivo reducir los costos de purificación en comparación con la cromatografía tradicional con proteína A.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Purificación de proteínas
- Anticuerpos monoclonales
Antecedentes
- Los anticuerpos monoclonales son fundamentales en los productos bioterapéuticos.
- La cromatografía con proteína A es un método común pero costoso de purificación.
- Se necesitan nuevos métodos para reducir los costos de producción.
- Las proteínas fluorescentes pueden utilizarse en cromatografía de afinidad.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una resina de afinidad alternativa para la purificación de anticuerpos monoclonales.
- Optimizar las condiciones de captura para mejorar la capacidad de unión.
- Demostrar la adaptabilidad de la resina para diversos anticuerpos.
Métodos Utilizados
- Preparación de una solución de ligando de afinidad basada en DsRed.
- Acoplamiento del ligando a columnas de agarosa activada con NHS.
- Prueba de la resina con extractos vegetales clarificados que contienen anticuerpos.
- Monitoreo de la absorbancia UV durante los pasos de purificación.
Resultados principales
- La nueva resina permite la captura eficiente de anticuerpos con alta pureza.
- Se lograron tasas de recuperación cercanas al 100 % para los anticuerpos evaluados.
- La resina mostró una mejor reutilizabilidad en comparación con la Proteína A.
- La eficiencia de acoplamiento puede monitorearse visualmente mediante fluorescencia.
Conclusiones
- La resina basada en DsRed es una alternativa prometedora para la purificación de anticuerpos.
- Potencialmente puede reducir los costos en la producción de biofármacos.
- Son factibles futuras adaptaciones para otros anticuerpos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cromatografía con proteína A sigue siendo un factor importante de costos en la purificación de anticuerpos monoclonales, afectando la accesibilidad de los productos biológicos. Este método presenta una alternativa rentable que utiliza un ligando de afinidad basado en DsRed inmovilizado en agarosa entrecruzada activada, permitiendo la captura selectiva de anticuerpos con epítopos lineales a partir de extractos crudos. El enfoque facilita la validación temprana de dianas y el desarrollo de ensayos al proporcionar un sistema de resina reutilizable y cuantificable visualmente que reduce la dependencia de ligandos costosos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de hipótesis terapéuticas mediante la captura selectiva de anticuerpos específicos de epítopos a partir de mezclas complejas.
- Valor operativo: Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la validación del acoplamiento al blanco utilizando un ligando de epítopo lineal expresado en sistemas vegetales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona una matriz de afinidad estandarizada para la medición cuantitativa de la unión de anticuerpos en extractos crudos.
- Valor operativo: Permite la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante el monitoreo de la eficiencia de acoplamiento basado en fluorescencia.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la alineación translacional de biomarcadores al permitir la purificación de anticuerpos funcionales a partir de sistemas de expresión relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Apoya la confianza predictiva en la identificación de candidatos principales mediante una recuperación y pureza consistentes a lo largo de múltiples ciclos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores, ofreciendo una plataforma para la generación rápida de resinas aplicable a múltiples blancos de anticuerpos con epítopos lineales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir el aislamiento de anticuerpos específicos a partir de muestras biológicas complejas.
- Selección: Ofrece preparación para ensayos y resultados cuantitativos mediante el monitoreo de absorbancia UV y la cuantificación de ligandos acoplados a fluorescencia.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantificables, como la capacidad de unión dinámica y las tasas de recuperación, para comparar condiciones de purificación.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la producción de anticuerpos purificados adecuados para la validación funcional.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para adaptarse rápidamente a nuevos objetivos de anticuerpos mediante el intercambio de ligandos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en las interacciones anticuerpo-ligando.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la producción de resinas mediante la optimización basada en el diseño de experimentos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la viabilidad temprana de la purificación.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en métricas alcanzables de pureza y recuperación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en expresión proteica, purificación y química de conjugación.
- Necesita instrumentación para acoplamiento controlado por flujo, monitoreo de UV y recolección de fracciones.
- Exige estandarización entre equipos en cuanto a concentración de ligandos, condiciones de tampón y cronogramas de acoplamiento.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes pares epítopo-anticuerpo, particularmente en la optimización de tampones de elución.
- Comprende limitaciones prácticas, como el desprendimiento del ligando durante ciclos y la disminución de la capacidad dinámica de unión con el reuso.
