Name: Métodos de investigación sobre cloroplastos: Investigando la localización, localización e interacciones de las proteínas cloroplastas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: Aprenda métodos de importación y localización de proteínas en cloroplastos de Arabidopsis thaliana mediante ensayos in vitro e in vivo. Estas técnicas permiten estudiar biogénesis y complejos multiproteicos para avanzar en biotecnología vegetal.

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<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
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métodos de investigación sobre cloroplastos: investigando la localización, localización e interacciones de las proteínas cloroplastas

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Métodos de investigación sobre cloroplastos: Investigando la localización, localización e interacciones de las proteínas cloroplastas

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

Bienvenidos a las Colecciones de Métodos JoVE sobre Métodos de Investigación con Cloroplastos, comisariadas por nuestro editor invitado, Paul Jarvis. Esta colección abarca una amplia gama de técnicas in vitro e in vivo que caracterizan las interacciones proteicas dentro de los cloroplastos. Investigadores de la Universidad de Oxford describen un método in vitro que utiliza cloroplastos aislados, que se incuban con proteínas marcadas radiactivamente para monitorizar su absorción.Este método es un desarrollo de enfoques previos utilizados para estudiar la importación de proteínas de cloroplasto in vitro. A continuación, de forma complementaria, se examina in vivo la importación de proteínas de cloroplastos. Este método utiliza la expresión transitoria de proteínas quiméricas y protoplastos para examinar los cambios en el tamaño y la localización de proteínas mediante inmunoblot y microscopía de fluorescencia.En este vídeo de método, los autores examinaron el sistema de membranas tilacoides presente en los cloroplastos. Al aislar las membranas, las vías de translocación proteica se elucidan en cloroplastos mediante SDS-PAGE e imagen con fósforo. Investigadores en Francia aplican diferentes métodos de centrifugación para aislar los subcompartimentos encontrados en los cloroplastos.Estas fracciones celulares aisladas se analizan luego mediante inmunoabsorción y proteómica para proporcionar información sobre la localización suborgánela de las proteínas cloroplastas. A continuación, investigadores suizos utilizaron la purificación por afinidad de complejos multiproteicos de cloroplastos para examinar la maquinaria molecular implicada en la importación de proteínas. Concretamente, los complejos multiproteicos de charla y garrapata incrustados en las membranas envolventes.En un enfoque complementario, los científicos caracterizan el complejo proteico tilacoide vegetal en Arabidopsis utilizando Blue Native PAGE, o BN-PAGE, que permite la separación de complejos proteicos en su forma nativa y funcional. Los complejos se analizan más a fondo mediante una página SDS 2D. Acabas de echar un vistazo a los distintos métodos utilizados para estudiar proteínas de cloroplastos en nuestra Colección de Métodos JoVE.Puedes consultar los artículos en profundidad en la página web de la Colección de Métodos de Investigación de Cloroplastos que se muestra en el enlace en pantalla.

chloroplast-research-methods-probing-targeting-localization

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Aquí se describe un nuevo método para estudiar la importación de proteínas en cloroplastos aislados bajo estrés. El método es rápido y sencillo, y se puede aplicar para estudiar las consecuencias de diferentes condiciones de estrés para la importación de proteínas de cloroplastos, y los mecanismos de regulación correspondientes.

Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Presentamos aquí protocolos de aislamiento de alto rendimiento de tilacoides fisiológicamente activos y análisis de transporte de proteínas para el cloroplasto doble arginina desplazamiento (cpTat), secretoras (cpSec1) y vías de partícula (cpSRP) de reconocimiento de señal.

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Aquí se describe un protocolo para expresar proteínas en protoplastos mediante método de transformación mediada por PEG. El método proporciona fácil expresión de proteínas de interés y eficiente investigación de localización de la proteína y el proceso de importación para las varias condiciones experimentales en vivo.

Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos

Aquí presentamos un protocolo probado y comprobado para la purificación del cloroplasto importación complejos (complejo TIC TOC) usando la etiqueta de grifo. El protocolo de aislamiento de afinidad de un paso potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína y se utiliza para identificar a nuevos socios de interacción por espectrometría de masas.

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Aquí, describimos un método para purificar cloroplastos intactos de hojas de Arabidopsis y de sus tres principales compartimentos sub (envoltura, estroma y tilacoides), usando una combinación de diferencial centrifugados, gradientes de Percoll continuados, y gradientes de sacarosa discontinuas. El método es útil para subplastidial y localización subcelular de las proteínas por immunoblotting y proteómica.

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

Muchas especies de plantas cambian el posicionamiento de los cloroplastos para optimizar la absorción de la luz. Este protocolo describe cómo usar un instrumento sencillo y casero para investigar el movimiento del cloroplasto en las hojas de Arabidopsis thaliana utilizando cambios en la transmisión de luz a través de una hoja como proxy.

Uso de cambios en la transmisión de hojas para investigar el movimiento de cloroplastos en Arabidopsis thaliana

La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.

Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

Aprenda métodos de importación y localización de proteínas en cloroplastos de Arabidopsis thaliana mediante ensayos in vitro e in vivo. Estas técnicas permiten estudiar biogénesis y complejos multiproteicos para avanzar en biotecnología vegetal.

Métodos de investigación sobre cloroplastos: Investigando la localización, localización e interacciones de las proteínas cloroplastas (Video) | JoVE Journal

Métodos de investigación sobre cloroplastos: Investigando la localización, localización e interacciones de las proteínas cloroplastas

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