Name: Microarrays de ADN y ARN de alta densidad - Síntesis fotolitográfica, hibridación y preparación de grandes bibliotecas de ácido nucleico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprende a sintetizar microarrays de ADN y ARN mediante fotolitografía in situ para crear bibliotecas de ácidos nucleicos recuperables. Este protocolo detallado permite la síntesis paralela de miles de secuencias únicas.

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Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Ciencia de Austria (el FWF concede a P23797, P27275 y P30596) y a la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Grant #PBBEP2_146174).

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Los autores certifican que no tienen afiliación con ninguna organización con fines de lucro.

La síntesis de ADN y ARN en fase sólida es el pan y la mantequilla de todos los laboratorios de química de ácido nucleico, y aunque la adición del componente de fotolitografía es ciertamente una operación compleja, la fabricación de microarrays mediada por la luz UV es también un proceso muy confiable . Es, además, el único método disponible para la síntesis de ARN in situ en microarrays. Sin embargo, como en cualquier procedimiento experimental de varias etapas, hay un amplio espacio para el error humano.
Tal vez el paso más crítico es el acoplamiento de una fosforamidia, ya que necesita ser una reacción química de alto rendimiento constantemente con el fin de permitir oligonucleótidos con pocos errores sintéticos. En nuestro protocolo de síntesis de microarrays, el acoplamiento de fosforamidia es aún más fundamental para la calidad de síntesis general, ya que el proceso de fabricación evita el taponamiento y evita la purificación de oligonucleótidos. Ocasionalmente se han calculado eficiencias de acoplamiento escalonadas superiores al 99% para todas las fosfosamiditas fotosensibles de ADN y ARN, incluso para tiempos de acoplamiento muy cortos (15 s)24, pero ocasionalmente pueden producirse rendimientos de acoplamiento más bajos, especialmente en el caso de las dG amiditas. La estabilidad de las fosfosamiditas solubilizadas a temperatura ambiente se ha investigado antes y se demostró que dependía de la naturaleza de la nucleobase, con fosfosamiditas de guanosina propensas a una degradación extensiva en cuestión de días29, 30. Pero cuando se almacena a -25 oC, se encontró que las fosfosamiditas dG se disolvieron en ACN, ya que la solución de 30 mM era estable durante varias semanas. Sin embargo, la relativa inestabilidad de las soluciones de fosforamidia dG a temperatura ambiente significa que no deben mantenerse unidos al sintetizador de ADN durante varios días.
En el caso de las fosfosamiditas de ARN, el rendimiento del acoplamiento depende en gran medida de la calidad de la fosforamidia (que puede evaluarse mediante espectroscopia de RMN de 31P) y del tiempo de acoplamiento. Los tiempos de acoplamiento de 5 minutos para rA, rG, rC y 2 min para rU parecen necesarios. De hecho, descubrimos que acortar el tiempo de condensación a 2 min para todas las fosfosamiditas de ARN condujo a señales de hibridación significativamente más bajas.
El sintetizador de ADN en sí, así como los reactivos y disolventes, sin duda necesita ser lo más limpio posible con el fin de lograr el mayor rendimiento de síntesis de oligonucleótidos. Sin embargo, el material insoluble, sales o partículas, puede acumularse con el tiempo en las líneas y tubos del sistema de suministro, lo que conduce a una disminución gradual en el consumo de reactivos y reactivos. Cuando una limpieza general del sintetizador no resuelve un volumen de salida bajo, un aumento en el número de pulsos puede ser una solución alternativa. Especialmente útil en el caso de bajo consumo de fosforamidia, la línea del protocolo de acoplamiento correspondiente al bombeo de una mezcla de fosforamidia y activador (tercera línea de la subsección de acoplamiento en los cuadros 1 y 2)puede ser modificado, de 6 a 9 pulsos sin ningún efecto negativo apreciable en la calidad de síntesis. Además, el número de pulsos de activador necesarios para llevar la mezcla de amidito/activador al sustrato de síntesis (actualmente 6, cuarta línea en la subsección de acoplamiento, ver Tabla 1 y Tabla 2) depende del propio sintetizador de ADN, así como del propio sintetizador de ADN, así como de longitud del tubo en la célula de síntesis. Este número se puede ajustar después de reemplazar el fosforamidito con una solución de color y contar el número de pulsos necesarios para empujar la mezcla de colores al sustrato de vidrio para el acoplamiento.
El método descrito en este documento permite que la síntesis de ADN y ARN continúe simultáneamente, en el mismo microarray. Los híbridos de ADN y ARN también se pueden preparar sin ningún cambio en los protocolos de fabricación de arreglos de discos, y siempre y cuando se siga el protocolo de desprotección en tres pasos. Sin embargo, cabe señalar que los microarrays sólo de ARN sólo requieren una desprotección en dos pasos: una decyanoetilación primero con Et3N seguida de hidroxilo y desprotección de la base con hidrazina. Se encontró que las nucleobases de ADN estaban incompletamente desprotegidas en esas condiciones, y necesitaban el paso adicional en LA AED para llevar a cabo la eliminación completa de los grupos de fenoxiacetil (Pac). Este tratamiento adicional con EDA es más corto (5 min) que para la desprotección estándar de los microarrays de ADN31,pero es suficiente para llevarlo a término después de los tratamientos de trietilamina e hidrazina. Además, un corto tiempo de reacción con EDA limita la exposición de un oligonucleótido de ARN totalmente desprotegido a condiciones básicas.
Una ventaja de la síntesis in situ de la matriz de ARN sobre métodos alternativos como la mancha o transcripción de ADN32,33,34 es la capacidad de almacenar el microchip de ARN sintetizado en forma protegida hasta su uso, evitando así el riesgo de degradación potencial del ARN. Los procedimientos postsintéticos para el ARN implican, por otro lado, que los consumibles y reactivos se mantienen estériles y que la manipulación se realiza en condiciones libres de RNase. Cabe destacar que encontramos que la adición de inhibidor de RNase a la mezcla de hibridación no produjo señales de hibridación más fuertes para las características del ARN.
La síntesis de bibliotecas de ADN en un monómero sensible a la base es más compleja que la síntesis de unas pocas secuencias de control en una superficie, y como tal es ciertamente más propensa a errores de diseño. Sin embargo, suponiendo que el diseño de la secuencia (es decir, la naturaleza y el número de secuencias) es correcto, transformar esta lista en una colección de máscaras de exposición y una serie ordenada de ciclos de acoplamiento sigue siendo un proceso sencillo. Sin embargo, existen variaciones importantes de la síntesis de microarrays estándar que son fundamentales para una fabricación exitosa de una matriz de bibliotecas de alta densidad.
En primer lugar, un monómero dT sensible a la base se acopla como el primer fosforamidito después de la síntesis del vinculador. Se encontró que el rendimiento de acoplamiento de este monómero (Figura1) era relativamente bajo, alrededor del 85%28,por lo que se hacen esfuerzos para mejorar su tasa de incorporación, ya sea aumentando su concentración en ACN de 30 mM a 50 mM, o repitiendo la paso de acoplamiento: dos reacciones de acoplamiento consecutivas utilizando monómeros frescos, o dos ciclos de acoplamiento separados pero consecutivos.
El segundo cambio es la adición de una solución de caroteno en la cámara posterior de la célula de síntesis, que absorbe convenientemente la luz de 365 nm. Esta es una modificación importante de la configuración de la fotolitografía, ya que evita que la luz UV se refleje de nuevo en el sustrato de la matriz. De hecho, después de atravesar el medio intersticial entre los sustratos, la luz UV entrante sale a través de la diapositiva perforada y llega al bloque de cuarzo de la célula. Las ecuaciones de Fresnel predicen que el 4 % de la luz UV perpendicularmente incidente se reflejará desde cada una de las tres interfaces de aire-vidrio aguas abajo (lado de salida del 2o sustrato y ambos lados del bloque de cuarzo) y de nuevo al sustrato de síntesis, exposición involuntaria de oligonucleótidos fotoprotegidos. La difracción y la dispersión también contribuyen a la fotodesprotección "fuera del objetivo" y, por lo tanto, a la inserción de nucleótidos, lo que afecta directamente a la tasa de error de síntesis, pero estas contribuciones son mucho más pequeñas que las reflexiones y pueden ser abordadas principalmente por reducción de la densidad de síntesis (dejando huecos entre las entidades). Hemos encontrado que el nivel de solución de caroteno en la cámara inferior de la célula tiende a disminuir ligeramente sólo durante los primeros minutos de síntesis de matriz, y por lo tanto necesita ser monitoreado y reajustado.
Por último, el tercer cambio es la solución de desprotección, reemplazando etOH por tolueno, que mantiene la biblioteca de ADN desculada unida a la superficie, presumiblemente a través de interacciones electrostáticas. La aplicación de una pequeña cantidad de agua en el área de síntesis después del lavado a ACN permite que la biblioteca se recopile convenientemente. Sin embargo, el proceso sólo tiene éxito si el contenido de agua en EDA y tolueno es mínimo, haciendo que el ácido nucleico sea totalmente insoluble en el cóctel de desprotección. Alternativamente, las bibliotecas de ADN pueden ser arrancadas del chip usando amoníaco9,10,14,35, y luego desprotegidas calentando la solución de amoníaco acuoso que contiene ADN a 55 oC durante la noche. Sin embargo, la recuperación de bibliotecas de ADN que utilizan amoníaco no es compatible con el ARN. Los oligonucleótidos de ARN sobre un sustrato escleable en base se pueden eluir de la superficie utilizando el mismo procedimiento EDA/tolueno descrito anteriormente, pero sólo en la penúltima etapa después de la estrategia de desprotección de dos pasos Et3N e hidrazina28.
Las estrategias alternativas para recuperar piscinas de oligonucleótidos de microarrays sin necesidad de un tratamiento básico específico existen, son en principio compatibles con la fotolitografía y se basan en el uso de enzimas. Por ejemplo, un solo nucleótido desoxiuracilo puede ser el objetivo de la glicosilasa de ADN uracilo (UDG) y extirpado del resto de la secuencia de ADN, o una sola unidad de ARN puede ser reconocida por las enzimas RNase H tipo 2 y el enlace de fosfodiester 5' al ARN , liberando la parte23de ADN de 5' .
Ahora tenemos un método potente, confiable y de alta densidad para la síntesis de ADN, ARN y microarrays híbridos de ADN/ARN. Estos no sólo pueden servir como plataformas para la hibridación o ensayos de unión36,sino que también representan una manera rápida y económica de producir bibliotecas complejas de ácido nucleico. Para el almacenamiento de datos digitales basado en EL ADN, la fotolitografía de microarray puede convertirse en una solución potencial para el cuello de botella de "escritura" (es decir, para la codificación de la información por síntesis). El éxito en la codificación digital en el ADN y en el ensamblaje del gen de novo depende de la fidelidad de la secuencia que, a nivel de síntesis, se traduce en la tasa de error. Los errores sintéticos y ópticos en nuestros protocolos actuales de fabricación de matrices serán discutidos e informados en otros lugares. Paralelamente, se están realizando esfuerzos para aumentar aún más la escala y el rendimiento de fabricación.

El uso práctico de microarrays de ADN ha sido tradicionalmente en el estudio de las variaciones en los niveles de expresión génica entre dos poblaciones celulares, utilizando hebras complementarias y fluorescencia como método de detección1. Ocasionalmente, los microarrays de ADN se aventuran en eventos de unión con ligandos ácidos no nucleicos, como proteínas, con una estrategia de permutación sistemática de la secuencia que ofrece una visión global del paisaje de unión2,3, 4,5. Este enfoque transforma eficazmente los microarrays de meras superficies de hibridación en plataformas con una amplia cobertura de secuencias, lo que sería un activo para el estudio del mundo más rico y complejo de la estructura y función del ARN. Apoyados por la reacción de acoplamiento de fosforamidida extremadamente eficiente6, las matrices de ADN sintetizadas in situ ahora también pueden considerarse como una fuente barata de ADN7,que se está volviendo particularmente relevante teniendo en cuenta la creciente demanda de material de ácido nucleico para ensamblaje genético8,9, nanoestructuras basadas en ADN10, almacenamiento de información o secuenciación11,12. Del mismo modo, es probable que las tecnologías de secuenciación se beneficien del desarrollo de métodos que produzcan mezclas muy complejas de oligonucleótidos de ARN13. En este contexto, los protocolos de fabricación de matrices que permiten sintetizar oligonucleótidos in situ y a alta densidad están en una posición ideal para satisfacer las necesidades del campo en rápida expansión de la biotecnología de ácido nucleico. Sin embargo, con un campo tan diverso como la biotecnología, el propósito de cada aplicación puede requerir que el ADN en microarray se produzca ya sea a alto rendimiento o con una cantidad muy baja de errores sintéticos14,15,o ambos, que requieren un más de cerca a los protocolos de síntesis de microarrays de ADN que, históricamente, se han optimizado principalmente para ensayos de hibridación. Mientras tanto, la síntesis in situ de microarrays de ARN se ha encontrado como un esfuerzo desafiante, con la mayor parte de la dificultad asociada con el grupo protector para la función 2'-OH, por lo general una mitad de silyl en la síntesis de fase sólida estándar que se elimina con reactivos a base de flúor, productos químicos incompatibles con superficies de vidrio o silicio. Esos problemas y desafíos en la síntesis de microarrays de ADN y ARN han sido últimamente objeto de un gran número de trabajo, en particular con el enfoque de fotolitografía16.
La fotolitografía utiliza luz UV para desbloquear oligonucleótidos antes del acoplamiento y requiere máscaras para construir un patrón de exposición UV, organizando y controlando espacialmente el crecimiento de oligonucleótidos. Las máscaras físicas han sido sustituidas por microespejos controlados por ordenador cuya inclinación refleja selectivamente la luz UV sobre el sustrato de microarray17,18,19. Como fuente UV, utilizamos 365 nm de luz de una fuente LED de alta potencia20. Las configuraciones fotolitográficas actuales están equipadas con matrices de microespejos que contienen 1024 x 768 espejos, correspondientes amás de 780.000 puntos direccionables individualmente ("características") en un área pequeña de sólo 1,4 cm 2, o 1080p con matrices de 1920 a 1080, o >2 millones de espejos. Por lo tanto, cada uno de los espejos del dispositivo tiene control directo sobre la secuencia cultivada en la función correspondiente. Con la excepción de la luz UV, la fotolitografía funciona como una técnica de síntesis de fase sólida y adopta la química de fosfomidito basada en ciclos. Sólo se requiere una estrategia de protección completamente diferente para que la síntesis de ARN tenga éxito. Desarrollamos una nueva serie de fosamiditas de ARN sensibles a la luz con grupos de protección de hidrazina-lábil21. Estos monómeros permiten desproteger el ARN en condiciones leves que no afectan la integridad de la superficie. Un primer paso de desprotección utiliza trietilamina para eliminar los grupos de protección de fosfodiester cianoetilo, mientras que la hidrazina se utiliza en un segundo paso separado para eliminar los de las funciones de amina 2'-OH y exocíclico. Al hacerlo, los oligonucleótidos de ARN de 30 nt de longitud y de cualquier secuencia ahora se pueden sintetizar in situ en microarrays22,23. Paralelamente, recientemente también comenzamos a abordar las cuestiones de rendimiento, calidad y velocidad en la fotolitografía de ADN y ARN. Medimos las eficiencias de acoplamiento >99% para todos los ADN y ARN amidites (Figura1) e investigamos cada paso individual en el ciclo de elongación de oligonucleótidos, desde el tiempo de oxidación, hasta la elección del activador y hasta la exposición UV óptima24 , 25. Hemos traído nuevos grupos de protección de 5' sensibles a la luz que se pueden eliminar sólo en segundos, transformando la síntesis de cientos de miles de 100 mers en un proceso de unas pocas horas de duración26. También hemos duplicado el rendimiento de la fabricación de matrices al exponer dos sustratos simultáneamente27. Por último, hemos introducido un fosamidito dT que contiene un grupo de saccinil sensible a la base como una forma conveniente de aplacar, recoger y analizar oligonucleótidos de ADN y ARN, que es fundamental para la preparación de la biblioteca28.
A pesar del aspecto relativamente mundano de la síntesis de fase sólida de ADN y ARN, especialmente para los químicos de ácido nucleico, la fotolitografía de microarray sigue siendo una actualización no trivial que requiere una configuración compleja, un control cuidadoso y una supervisión del proceso, y instrucciones separadas para el manejo post-sintético dependiendo de la naturaleza del oligonucleótido y el tipo de aplicación. En este artículo, queremos presentar detalladamente todo el procedimiento paso a paso de la síntesis in situ de microarrays de ADN y ARN por fotolitografía, desde el diseño experimental hasta el análisis de datos, con énfasis en la preparación de instrumentos y Consumibles. A continuación, describimos los métodos de desprotección postsintéticos que corresponden al propósito previsto de la fabricación de microarrays (es decir, la hibridación o la recuperación de bibliotecas de ácido nucleico).

<table><tbody><tr><td>Funcionalización de portaobjetos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético >99.8%</td><td>Sigma</td><td>33209</td><td>Para desprotección de ARN</td></tr><tr><td>Enrutador CNC</td><td>Stepcraft</td><td>300 CK</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>1.07017.2511</td><td>Para desprotección y funcionalización</td></tr><tr><td>N-(3-trietoxisililpropil)-4-hidroxibutiriramida</td><td>Gelest</td><td>SIT8189.5</td><td>Reactivo de silanización</td></tr><tr><td>Nexterion Glass D portaobjetos de microscopio</td><td>Schott</td><td>1095568</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Agitador orbital</td></tr><tr><td>Proclean 507 Baño de agua ultrasónico</td><td>Ulsonix</td><td></td><td>Para limpiar los portaobjetos después de perforar</td></tr><tr><td>Tickopur RW 77 Limpiador especial</td><td>Sigma</td><td>Z860086</td><td>Para limpiar los portaobjetos después de perforar</td></tr><tr><td>Síntesis de microarrays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 M dicianoimidazol en ACN</td><td>Biosolve</td><td>0004712402BS</td><td>Activator</td></tr><tr><td>0.7 XGA DMD</td><td>Dispositivo de microespejo digital</td><td>de Texas Instruments</td><td></td></tr><tr><td>20 mM I2 en piridina/H2O/THF</td><td>Oxidante</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma L860020-06250 &mu; m de espesor Chemraz 584 perfluoroelastómero</td><td>FFKM</td><td></td><td>Junta inferior de teflón</td></tr><tr><td>2'-O-ALE Fosforamiditas de ARN</td><td>ChemGenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>365 nm LED UV de alta potencia</td><td>Nichia</td><td>NVSU333A</td><td></td></tr><tr><td>5'BzNPPOC Fosforaminitas de ADN</td><td>Orgentis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'NPPOC Fosforaritas de ADN</td><td>FlexGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Biosolve</td><td>0001205402BS Para la síntesis de</td><td>ADN</td></tr><tr><td>Amidita Diluyente para la síntesis de ADN</td><td>Sigma</td><td>L010010</td><td>Para disolver fosforamiditas</td></tr><tr><td>Escindible dT</td><td>ChemGenes</td><td></td><td>Monómero sensible a la base para la preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>0004474701BS</td><td>Como disolvente de exposición</td></tr><tr><td>desprotección de microarrays de ADN y ARN </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamina >99.5%</td><td>Sigma</td><td>3550</td><td>Para la desprotección</td></tr><tr><td>Expedite 8909</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td></td><td>Sintetizador de ADN</td></tr><tr><td>Hidrato de hidracina 50-60% hidracina</td><td>Sigma</td><td>225819</td><td>para la desprotección de ARN</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de PTFE de baja densidad de resistencia industrial</td><td>Gasoila</td><td></td><td>Junta delgada superior de teflón</td></tr><tr><td>Piridina >99%</td><td>Sigma</td><td>P57506</td><td>Para la desprotección de ARN</td></tr><tr><td>Trietilamina >99%</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td>Para la desprotección</td></tr> <tr><td>de ARN&beta;-caroteno</td><td>Sigma</td><td>C9750</td><td>Para la preparación</td></tr> <tr><td>de bibliotecasHibridación y escaneo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Citrato salino de sodio</td><td>Roth</td><td>1054.1</td><td></td></tr><tr><td>Filamento complementario marcado con 5' Cy3</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Para hibridación dúplex</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga Biopur Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (10 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>R3961</td><td></td></tr><tr><td>EDTA grado de biología molecular</td><td>Promega</td><td>H5031</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4100A</td><td>Molecular Devices Escáner</td><td></td><td>de microarrays</td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Boekel Scientific</td><td>230500</td><td></td></tr><tr><td>MES monohidrato</td><td>Sigma</td><td>69889</td><td></td></tr><tr><td>MES sodio</td><td>Sigma</td><td>M3058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl >99.5%</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hibridación SecureSeal SA200</td><td>Grace BioLabs</td><td>623503</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td>Centrífuga de microarrays</td></tr><tr><td>Tween-20 grado de biología molecular</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Extracción de datos</td>Excel Microsoft Para la extracción de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>datos</td>MatLab MathWorks Diseño de microarrays <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.1</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desalinización y cuantificación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTip C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18s008</td><td>Puntas de pipeta desalinizadoras</td></tr></tbody></table>

microarrays de adn y arn de alta densidad - síntesis fotolitográfica, hibridación y preparación de grandes bibliotecas de ácido nucleico

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

La fotolitografía es una potente técnica para la síntesis de oligonucleótidos de ADN en diapositivas de vidrio, ya que combina la eficiencia de las reacciones de acoplamiento de fosforamidia con la precisión y densidad de la luz UV reflejada a partir de espejos del tamaño de un micrometro. La fotolitografía produce microarrays que pueden acomodar desde cientos de miles hasta varios millones de secuencias de ADN diferentes, 100 o más, en sólo unas pocas horas. Con este espacio de secuencia muy grande, los microarrays son plataformas ideales para explorar los mecanismos de las interacciones de ácido nucleico, que son particularmente relevantes en el caso del ARN. Recientemente informamos sobre la preparación de un nuevo conjunto de fosamiditas de ARN compatibles con la fotolitografía in situ y que posteriormente se utilizaron para cultivar oligonucleótidos de ARN, homopolímeros, así como secuencias de base mixta. Aquí, ilustramos en detalle el proceso de fabricación de microarrays de ARN, desde el diseño experimental, hasta la configuración instrumental, la síntesis de matrices, la desprotección y el ensayo de hibridación final utilizando una secuencia de plantilla 25mer que contiene las cuatro bases como ejemplo. En paralelo, vamos más allá de los experimentos basados en la hibridación y explotamos la fotolitografía de microarrays como una puerta de entrada de bajo costo a las complejas bibliotecas de ácido nucleico. Para ello, los microarrays de ADN de alta densidad se fabrican en un monómero sensible a la base que permite que el ADN se corte y recupere convenientemente después de la síntesis y la desprotección. El protocolo de fabricación está optimizado para limitar el número de errores sintéticos y, en ese sentido, se introduce una capa de solución de caroteno para absorber fotones UV que de otro modo podrían reflejarse de nuevo en los sustratos de síntesis. Describimos paso a paso el proceso completo de preparación de la biblioteca, desde el diseño hasta el escote y la cuantificación.

Hibridación de microarrayde ADN y ARN La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de hibridación realizado en un microarray que contiene las versiones de ADN y ARN de una secuencia de 25 mer (5'-GTCATCATCATGAACCACCCTTC-3' en forma de ADN). El escaneo en la Figura 5A aparece en un formato de escala verde correspondiente al espectro de excitación/emisión de fluorescencia Cy3, con intensidad de fluorescencia registrada en unidades arbitrarias entre 0 y 65536. El diseño de la matriz siguió el diseño de la característica 25:36 descrito en la sección del protocolo. El escaneo se muestra después de la orientación adecuada de la matriz, con la esquina superior izquierda poblada con la cadena más larga de entidades fiduciales. Aquí, las características fiduciales contienen la versión de ADN del 25mer y, en principio, siempre deben dar una señal de fluorescencia positiva con el fin de realizar la alineación del escaneo y la extracción de datos. El microarray hibridado debe parecer uniformemente brillante, con los bordes del área de síntesis siendo sin embargo generalmente más brillante que el centro (hasta un 50% más brillante). La gran cantidad de réplicas de secuencia, distribuidas aleatoriamente por toda la zona, reduce el impacto de los artefactos espaciales. Aquí, cada secuencia (ADN y ARN) fue sintetizada en 2.000 ubicaciones aleatorias. Por lo general, hay un bajo ruido de fluorescencia (fondo), &lt;50 a.u., que conduce a una relación señal/ruido en el orden de 200:1 a 800:1 en ensayos de hibridación. Después de la extracción de los datos, las intensidades de fluorescencia se promedian y se trazan sD.
Hay una variabilidad significativa en los valores absolutos de fluorescencia entre experimentos. Aquí, mostramos los resultados de tres síntesis independientes usando los mismos parámetros de fabricación y el mismo manejo post-sintético. El ADN de 25mer, cuando se hibrida a su cadena de ADN con etiqueta Cy3 complementaria, producirá señales de fluorescencia que van desde 20.000 hasta 30.000, muy raramente por encima o por debajo. El ARN de 25 mer, cuando se hibrida al mismo complemento de ADN etiquetado con Cy3, dará intensidades de fluorescencia en las características correspondientes que van de 15.000 a 20.000. Sin embargo, la intensidad de la fluorescencia de los dúplex de ARN/ADN ocasionalmente caerá por debajo de 8.000, cuando los dúplex de ADN/ADN correspondientes seguirán fluorado dentro del rango de 20.000-30.000. En tales casos, los resultados del ARN pueden considerarse subóptimos. Una falla de síntesis o hibridación, ya sea para ADN o ARN, será inmediatamente perceptible durante el escaneo de la evidente falta de fluorescencia. Hay múltiples oportunidades para que la síntesis de ARN fracase o tenga éxito parcialmente y se esbozarán en la parte de discusión.
Desprotección, escote y recuperación de bibliotecas Dependiendo de la complejidad y la densidad de la biblioteca, la forma y el contorno de la matriz sintetizada se pueden ver sin aumento pero bajo la iluminación adecuada (Figura4), con el ADN todavía en forma protegida. Después de la desprotección con EDA/tolueno, y antes de la adición de agua para recoger la biblioteca de sin levadura, el área de síntesis que contiene los oligonucleótidos ahora desprotegidos puede destacar como una zona hidrófila, cuando el resto del tobogán de vidrio aparecerá cubierto con una capa hidrófoba turbia. La observación directa del área de síntesis depende de la superficie total utilizada para sintetizar oligonucleótidos: un mayor uso del área de síntesis corresponderá a una mayor probabilidad de una clara distinción entre las regiones hidrófilas e hidrófobas en la superficie. Por el contrario, las bibliotecas sintetizadas con menos espejos y con características más pequeñas pueden no ser observables inmediatamente.
Del mismo modo, la cantidad de ADN recuperado después de la desalación es directamente proporcional a la superficie total utilizada para la síntesis. Si todas las características se utilizan para la síntesis de oligonucleótidos, el procedimiento de escisión y recuperación debe producir entre 25 y 30 pmol de ADN. Por lo tanto, un uso del 10% del área de síntesis sólo permitirá alrededor de 3 pmol de ADN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Figura 1 . Estructuras químicas del ADN y ARN fosamiditas utilizadas en la síntesis de oligonucleótidos por fotolitografía de microarray. Los grupos de protección fotosensibles estándar de nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) en el 5'-OH se utilizan en la síntesis regular de ADN y microarray de ARN para fines de hibridación. Para la síntesis de bibliotecas de ADN complejas, más fotolabile-benzyl-NPPOC (BzNPPOC) se prefieren en el 5'-OH, ya que BzNPPOC se elimina dos veces más rápido que NPPOC, lo que reduce significativamente el tiempo total de síntesis de microarray. Los oligonucleótidos de ADN para bibliotecas también requieren el acoplamiento de un monómero dT escleable en el extremo de 3'. Este monómero, que lleva una función de éster de sacapinilo, será cleavedd durante la desprotección, lo que permite que el ADN sea recogido del microchip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Figura 2 . Ejemplo de una máscara como un archivo de imagen enviado al dispositivo microespejo durante la exposición UV. Los píxeles blancos corresponden a los espejos que se inclinarán en la posición "ON", reflejando la luz UV en la celda de síntesis. Los píxelesnegros corresponden a los espejos "OFF", donde la luz UV se reflejará lejos de la celda. Por lo tanto, los píxeles blancos permitirán el acoplamiento del siguiente fosforamidia entrante en los oligonucleótidos que se encuentran en las características correspondientes en los sustratos de vidrio. Oligonucleótidos sintetizados en las características cuyos espejos correspondientes son, en este archivo de máscara, los píxeles negros permanecerán sin embargo inertes durante el próximo evento de acoplamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Figura 3 . Fotografías de la configuración óptica y de síntesis de fotolitografíade microarray. (A) Circuito óptico para la exposición UV. La luz UV del UV-LED se homogeneiza primero a través de un tubo de luz rectangular de sección transversal y luego se refleja en los microespejos. Los microespejos que se han inclinado en una posición "OFF" reflejarán la luz UV lejos de la celda de síntesis, pero los microespejos en la posición "ON" reflejarán la luz en la celda de síntesis, situada en el plano focal, al pasar primero a través de un relé Offner 1:1 sistema de imágenes. (B) La celda de síntesis, una vez montada, consiste en una corredera perforada colocada en primer lugar sobre el bloque de cuarzo de la célula, separada por una junta de PTFE gruesa (no se muestra). A continuación, se coloca una segunda diapositiva no perforada sobre la diapositiva perforada, separada por una junta de PTFE delgada. Un marco metálico (no se muestra) mantiene el ensamblaje unido. (C). Para la preparación de la biblioteca, una vez que la célula de síntesis está unida en el plano focal de la luz UV entrante, la cámara situada entre el bloque de cuarzo y la corredera perforada se llena con una solución del 1% de caroteno en CH2Cl2. Para ello, se une un tubo de entrada y salida adicional al bloque de cuarzo y la solución naranja fluye de la posición más a la derecha a la posición más a la izquierda. El flujo de reactivos y disolventes para la síntesis se muestra en flechas blancas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Figura 4 . El área de síntesis es generalmente visible a simplevista. Aquí, una biblioteca de ADN se puede ver en la superficie de vidrio justo después de la síntesis, con el ADN todavía en forma protegida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Figura 5 . Ensayos de hibridación a las secuencias de ADN y ARN de 25mer sintetizadas in situ en microarrays. (A) Escaneo de fluorescencia de todo el ADN hibridado y microarray de ARN. Los oligonucleótidos de ADN y ARN de 25mer se hibridan en sus hebras complementarias etiquetadas con Cy3. La matriz fue escaneada con un láser a una longitud de onda de excitación de 532 nm, a una resolución de 5 m. (B) Intensidades de fluorescencia (unidades arbitrarias) de los dúplex DNA:DNA y RNA:DNA en tres experimentos separados. Los datos verdes claros de los oligonucleótidos de ARN sintetizados in situ pueden considerarse subóptimos, en comparación con la intensidad de fluorescencia de las secuencias de ADN correspondientes. Las barras de error son SD. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Figura 6 . Representación esquemática del procedimiento de desprotección, escisión y recuperación de las bibliotecas de ADN sintetizadas en microarrays. Las secuencias de ADN se cultivan en un nucleósido dT escinible sensible a la base (que se muestra en el área ampliada). Después de la síntesis, la desprotección de los oligonucleótidos de ADN (los grupos protectores de bases se representan como esferas rojas) en EDA/tolueno deja el material desprotegido unido electrostáticamente a la superficie y luego se puede pipetear aplicando una pequeña agua en el área sintetizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Figura 7 . Espectro de absorbancia representativo (220 - 350 nm) de una biblioteca de ADN desalinada y sin levadura que contiene 4.000 secuencias diferentes, de 100 nt de longitud. Un total de 940 ng de ADN se aisló de una sola síntesis de matriz, correspondiente a 30 pmol de ADN total, o 15 pmol por sustrato de vidrio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tabla 1. Protocolo de ciclo representativo para el acoplamiento/oxidación/fotodesprotección de 5'-BzNPPOC-dA, suponiendo que el fosforamidito correspondiente se cargó en el puerto "A". El tiempo de acoplamiento (en segundos) se muestra en la línea "couple monomer". El tiempo de protección de fotodesprotección UV, aquí correspondiente a una energía radiante de 3 J/cm2 (fotoquímica BzNPPOC), se calcula como el tiempo transcurrido entre las dos señales de comunicación "Evento 2 Out".
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Cuadro 2. Protocolo de ciclo representativo para el acoplamiento/oxidación/fotodesprotección de 5'-NPPOC-rA, suponiendo que el fosamidito de ARN correspondiente se cargó en el puerto "A". El tiempo de acoplamiento (en segundos) se muestra en la línea "couple monomer". El tiempo de protección de fotodesprotección UV, aquí correspondiente a una energía radiante de 6 J/cm2 (fotoquímica NPPOC), se calcula como el tiempo transcurrido entre las dos señales de comunicación "Evento 2 Out".

En este artículo, presentamos y discutimos nuevos desarrollos en la síntesis y aplicaciones de microarrays de ácido nucleico fabricados in situ. Específicamente, mostramos cómo los protocolos para la síntesis de ADN se pueden extender al ARN y cómo se pueden utilizar los microarrays para crear bibliotecas de ácido nucleico recuperables.

Microarrays de ADN y ARN de alta densidad - Síntesis fotolitográfica, hibridación y preparación de grandes bibliotecas de ácido nucleico

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Los microarrays de ADN y ARN son muy útiles para estudiar las interacciones entre ácidos nucleicos y proteínas, pero también son un método conveniente para la preparación de bibliotecas de secuencias. La fotolitografía permite sintetizar cientos de miles de secuencias únicas en paralelo y actualmente es el único método directo para la síntesis de ARN en microarrays. La síntesis fotolitográfica in situ de microarrays también puede extenderse a oligonucleótidos modificados químicamente, por ejemplo con dos fluoros primos de ácidos nucleicos peptídicos.Ver el proceso de fabricación y manipulación de microarrays puede ayudar a entender cómo esta compleja maquinaria fue desarrollada a partir de la conocida síntesis de ADN de fase sólida estándar. Comience este procedimiento con el diseño de microarray y la funcionalización de diapositivas como se describe en el protocolo de texto. Encienda el sintetizador de ADN UV LED y su ventilador de refrigeración.Coloque un medidor de intensidad UV en el punto focal de la luz UV entrante y enciéndalo. En el ordenador, inicie el software WiCell Controller. Encienda e inicialice el dispositivo de micromere.Cargue un archivo de máscara blanca haciendo clic con el botón derecho en DMD y, a continuación, seleccionando cargar la imagen. Haga clic con el botón derecho en el icono UVS y seleccione UV shutter open. Lea el valor de potencia en el medidor de intensidad y cuente 60 segundos.Después de 60 segundos, vuelva a leer el valor de potencia y anote los valores inicial y final. Cierre el obturador seleccionando cierre del obturador UV y apague el medidor de intensidad. Calcular el valor medio de intensidad UV en milivatios por centímetro cuadrado.En el software WiCell, cargue los archivos de trabajo, secuencia y protocolo en sus respectivas subventas y, a continuación, haga clic en Enviar para enviar los archivos de secuencia y protocolo al sintetizador DNA. Para ensamblar la célula de síntesis coloque una junta de perfluoroelastómero grueso en el bloque de cuarzo de la célula. A continuación, coloque una corredera de microscopio funcionalizada y perforada en la parte superior de la primera junta y verifique que los orificios de las diapositivas se conecten con el tubo de entrada y salida de la célula de síntesis.Coloque una segunda junta fina de politetrafluoroetileno sobre el portaobjetos perforado, rodeando los dos orificios. Por último, coloque una segunda diapositiva funcionalizada pero sin perforar sobre la segunda junta. Ahora coloque un marco de metal de 4 tornillos en la parte superior de la celda de doble sustrato montada Apriete el tornillo a la misma fuerza de sujeción utilizando un destornillador de par.Conecte el tubo de entrada y salida al sintetizador de ADN. Preparar la línea de lavado de acetonitrilo y verificar el flujo adecuado de acetonitrilo a través de los sustratos. Mida el volumen de acetonitrilo en la línea de desecho después de pasar por siete ciclos de cebado de acetonitrilo.Este volumen debe ser de dos mililitros. Fije la célula de síntesis en el plano focal de la luz UV entrante. En el caso de la preparación de la biblioteca, coloque una línea de entrada y salida adicional en la parte posterior de la celda y llene la cámara posterior con los dos mililitros de la solución de betacaroteno.Inicie la síntesis haciendo clic primero en Ejecutar en el software WiCell. En el primer comando de espera en el archivo de trabajo, presione start en el sintetizador DNA. Después de la síntesis de microarrays regulares, desconecte la célula del sintetizador y desmonte la célula.Utilice una pluma de diamante para grabar el número de síntesis en los portaobjetos de vidrio. Etch el número en la cara no sintetizada de cada diapositiva. Transfiera los portaobjetos a tubos centrífugos de 50 mililitros y guárdelos en un área desecada hasta su uso posterior.Después de la síntesis de microarrays de biblioteca, primero drenar la solución de betacaroteno fuera de la cámara y luego lavar la cámara dos veces mediante el flujo de cinco mililitros de cloruro de metileno antes de drenar. Para la desprotección de microarry de ADN, llene un frasco de vidrio de tinción con 20 mililitros de etanol y 20 mililitros de EDA. Coloque las microarrays sólo de ADN verticalmente en el frasco, cierre la tapa y deje que las diapositivas se desprotegen durante dos horas a temperatura ambiente.Después de dos horas, recupere los portaobjetos con pinzas y enjuáguelos bien con agua de doble destilación. Seque los portaobjetos en una centrífuga de microarray durante unos segundos antes de almacenarlas en un desecador. Para la desprotección de la microarray de ARN, prepare una solución seca de 20 mililitros de trietilamina y 30 mililitros de acetonitrilo en un tubo centrífugo de 50 mililitros.Transfiera un portaarrays de ARN al tubo centrífugo, cierre la tapa y envuelva con película de sellado de plástico. Agitar suavemente el tubo centrífugo en un agitador orbital durante una hora y 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el portaobjetos y lave dos veces con 20 mililitros de acetonitrilo seco antes de secar en una centrífuga de microarray durante unos segundos.Después del primer paso de desprotección, transfiera el arn arnés a la solución de hidrazina, cierre la tapa y envuelva con película de sellado de plástico. Después de dos horas de agitar suavemente en un agitador orbital, retire el portaobjetos y lávelo dos veces con 20 mililitros de acetonitrilo seco. A continuación, seque en una centrífuga de microarray durante unos segundos.Si la microarray de ARN también contiene nucleótidos de ADN, proceda con un tercer paso de desprotección. Añadir la microarray DE ADN/ARN a un tubo de 50 mililitros que contenga una solución de EDA-etanol Después de 5 minutos a temperatura ambiente, retire el portaobjetos y lave el microarray dos veces con 20 mililitros de agua estéril. Seque el portaobjetos en una centrífuga de microarray y guárdelo en un desecador.En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros, prepare el tampón de hibridación que contiene ADN con etiqueta Cy3, como se describe en el protocolo de texto. Mezclar y vórtice la solución. Coloque cuidadosamente una cámara de hibridación autoadhesiva de 300 microlitrotros sobre el área de síntesis en cada diapositiva y pipeta en la solución de hibridación.Cubra los orificios de la cámara con puntos adhesivos y envuelva toda la diapositiva en papel de aluminio. Coloque el portaobjetos de microarray en el horno de hibridación, cubra y déjelo girar suavemente a la temperatura de hibridación seleccionada durante dos horas. Después de dos horas, desenganche la corredera, retire la lámina de aluminio, pipetee la solución de hibridación y desgarre cuidadosamente la cámara de hibridación.Transfiera los portaobjetos a un tubo centrífugo que contenga 30 mililitros de tampón de lavado no estricto. Agitar vigorosamente durante dos minutos a temperatura ambiente. Transfiera el portaobjetos a un tubo centrífugo que contenga 30 mililitros de tampón de lavado estricto y agite vigorosamente durante un minuto.Por último, transfiera la diapositiva a un tubo centrífugo que contenga 30 mililitros de tampón de lavado final. Agitar durante unos segundos. Seque el portaobjetos en una centrífuga de microarray.Ahora, coloque la microarray seca, área de síntesis mirando hacia abajo, en el soporte deslizante del escáner de microarray. Para desproteger y cortar las bibliotecas de ADN, sumerja la diapositiva en la solución de escisión, en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Cierre el tubo y envuelva con película de sellado de plástico, antes de girar suavemente en un agitador orbital durante dos horas a temperatura ambiente.Después de dos horas, retire el portaobjetos y lave dos veces con 20 mililitros de acetonitrilo escrupulosamente seco antes de dejar que se seque al aire. Con una pipeta, aplique 100 microlitros de agua estéril sobre el área de síntesis ahora discernible. Encoge la solución hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces antes de transferirla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Repita el proceso y combine el eluido de microarray en el mismo tubo. Evaporar el chip eluente a sequedad y luego redissolcar en 10 microlitros de H2O libre de nucleasas. Aquí se muestran los resultados de un ensayo de hibridación realizado en una microarray que contiene las versiones de ADN y ARN de una secuencia de 25mer.El escaneo aparece en un formato de escala verde correspondiente a la excitación, espectro de emisión de fluorescencia Cy3, con intensidad de fluorescencia registrada en unidades arbitrarias. Hay una variabilidad significativa en los valores absolutos de fluorescencia entre los experimentos. Se muestran los resultados de tres síntesis independientes que utilizan los mismos parámetros de fabricación y el mismo manejo post-sintético.El ADN de 25mer, cuando se hibrida a su cadena de ADN complementaria con etiqueta Cy3, producirá señales de fluorescencia que oscilan entre 20.000 y 30.000, muy raramente por encima o por debajo. El ARN de 25mers, cuando se hibrida al mismo complemento de ADN con la etiqueta Cy3, dará intensidades de fluorescencia en las características correspondientes que van desde 15.000 hasta 20.000. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de los dúplex de ARN/ADN ocasionalmente caerá por debajo de 8.000, cuando los dúplex de ADN/ADN correspondientes seguirán fluoresce dentro del rango de 20.000 a 30.000.En tales casos, los resultados del ARN pueden considerarse subóptimos. Al igual que con cualquier otro experimento basado en ARN, es importante recordar que los microarrays de ARN son sensibles a la degradación y deben tratarse en condiciones estériles. Las bibliotecas de ácido nucleico recogidas de microarrays se pueden utilizar en la secuenciación de ADN o ARN, así como en la codificación de información digital sobre el ADN.El NED produce una luz UV intensa que no debe ser vista directamente. Debido a esto, se recomienda usar gafas protectoras mientras el instrumento está en uso.

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