Name: Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprende a fabricar células T CAR con competencia funcional para inmunoterapia adoptiva. Este método preserva la calidad celular y evita la diferenciación terminal, mejorando la eficacia terapéutica en tumores sólidos.

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Este trabajo fue apoyado en parte a través de fondos proporcionados por Novartis Pharmaceuticals a través de una alianza de investigación con la Universidad de Pensilvania (Michael C. Milone) así como el Premio Académico de la Fundación St. Baldrick (Saba Ghassemi).

Todos los estudios en animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
1. Activación, transducción y expansión de células T
<ol><li>Active células T humanas primarias frescas o crioconservadas mezclando con cuentas magnéticas anti CD3/CD28 (por ejemplo, cuentas de dinadas) a una proporción de 3 perlas por célula T en platos de cultivo celular de 6 polos. Células T de cultivo en x-VIVO 15 medio suplementado con 5% de suero AB humano normal, 2 mM de L-glutamina, 20 mM HEPES e IL2 (100 unidades/ml). Mantenga las células T a una concentración de 106 células T/ml durante la expansión. Cultivo de células T a 37oC, 20% O2y 95% de humedad con 5%CO2.</li>
	<li>Después de la estimulación durante la noche, agregue el sobrenadante lentiviral a las células T activadas. Calcular el volumen de sobrenadante necesario para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 3 a 5. NOTA: El plásmido de lentivirus CD19-BB-CAR consta de una bisagra CD8, un dominio coestimulador 4-1BB y un dominio de señalización CD3-21. CD19-BB- Supernadante lentiviral se generó como se describió anteriormente21.</li>
	<li>En el día 3, recoger una alícuota representativa de células para la criopreservación. Antes de la criopreservación, retire las perlas magnéticas mediante un suave pipeteo y separación magnética. Preparar el medio de congelación que contenga solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacenar en 4 oC hasta su uso.<ol>
<li>Centrifugar las células T a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y agregue 5 ml de PBS. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y desechar el PBS.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de criopreservación en frío. Congele las células T en un recipiente de congelación refrigerado y guárdelas a -80 oC durante 48 h. Transfiera las células congeladas a nitrógeno líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave el resto de las células T una vez en 5 ml de PBS para eliminar el vector residual. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Decantar el PBS y resuspender el pellet celular en el medio de cultivo de células T a una concentración de 0,5 x 106 células/ml.</li>
	<li>Divida las células T en dos cultivos, designados para el día 5 y el día 9. Contar las células T por citometría de flujo utilizando cuentas de recuento(Tabla de materiales)y anticuerpos monoclonales para CD4 y CD8 humanos, así como un tinte de viabilidad (Tabla de materiales).<ol>
<li>Para medir la concentración de células T, prepare una mezcla maestra que contenga 500 ml de PBS, 5 l de perlas de conteo, 10 ml de la solución de viabilidad celular D de 7-Amino-actinomicina, 4 ml de CD4-FITC y 4 l de CD8-APC. Agregue 40 sl de células T a la mezcla maestra y mida la concentración de células por citometría de flujo en función del número de celdas T activas/recuentos de cuentas de cuentas. Realimentar para mantener los cultivos a una concentración de 0,5 x 106 células/ml cada dos días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>El día 5, cuente y criopreserve las culturas del día 5 como se describe en los pasos 1.3 y 1.5.</li>
	<li>En el día 7, lave 0,5 x 106 células T en PBS y resuspenda en 100 l de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS). Detectar la expresión de proteína superficial CAR mediante inmunomanchacon un idiotipo anti-CAR19 conjugado fluorescentemente por citometría de flujo.</li>
	<li>El día 9, cuente las culturas del día 9 y criopreserve como se describe en el paso 1.3.</li>
</ol>2. Evaluación fenotípica de la diferenciación de células T
<ol><li>Preparar una mezcla maestra que contenga anticuerpos pretitrados para anti-CD3-BV605 (clon OKT3), anti-CD14–Pacific Blue (PB) (clon HCD14), anti-CD19–PB (clon HIB19), anti-CD4–BV510 (clon OKT4), anti-CD8–H7APC (clon SK1), anti-CCR-7-FITC (clon 15053), anti-CD45RO-PE (clon UCHL1), anti-CD27–PE-Cy7 (clon 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clon DX2) y anti-CAR19-APC.</li>
	<li>Preparar controles individuales de fluorescencia menos uno (FMO) para controles anti-CD45RO–PE, anti-CCR7–FITC, anti-CD27–PE-Cy7 y anti-CD95–PerCP-Cy5.5 para distinguir las células manchadas positivamente del fondo.</li>
	<li>Prepare la solución de tinción de células muertas diluyendo el reactivo vivo/muerto(Tabla de materiales)1:10.000 en PBS.</li>
	<li>Descongelar el día 3, día 5, y día 9 Células T que fueron previamente crioreservados. Centrifugar 1 x 106 células T de cada grupo a 300 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante. Lave las células una vez con PBS. Centrifugar a 300 x g durante 3 min y desechar el PBS.</li>
	<li>Mezclar las células T con la solución de tinción muerta durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT), protegida de la luz.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón FACS para apaciar el tinte de tinción de células muertas. Centrifugar a 300 x g durante 3 min, desechar el sobrenadante y resuspender el gránulos celulares en 100 ml de tampón FACS que contenga el cóctel de anticuerpos descrito en los pasos 2.1 y 2.2. Incubar durante 1 h a 4oC.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón FACS y centrífuga a 300 x g durante 3 min para lavar el anticuerpo no unido. Repita tres veces con el búfer FACS.</li>
	<li>Resuspender las células en 1% de paraformaldehida (PFA) y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>A medida que la expresión CD45RO disminuye después de la fijación, analice las muestras por citometría de flujo después de la inmunomancha. Para evaluar la diferenciación, puerta en el siguiente orden: singlets (FSC-H vs FSC-A), células CD3+ T en vivo (Dump [violeta vivo-muerto, CD14-PB y CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). En CD4+ y CD8+ subconjuntos, puerta en CD45RO-PE vs CCR7-FITC para definir células T ingenuas (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-) y Tte (CD45RO-CCR7-). Para identificar El Tscm, la puerta en las células CD27+ T en la población de células T ingenuas. En este compartimiento, Tscm son CD95+ y Tn son CD95-.</li>
</ol>3. Análisis Funcional In Vitro
<ol><li>Proliferación de células T CAR y secreción de citoquinas
	<ol>
<li>Verifique la expresión CAR así como la viabilidad de la célula como se describe en los pasos 1.5 y 1.7, por la citometría de flujo.</li>
		<li>Lavar 5 x 106 células T de cada grupo (día 3, día 5 y día 9) con PBS y resuspender en una solución de 1 M de solución de diacetato de carboxifluoresceína éster de succinimidil (CFSE) en PBS durante 3,5 min a RT.</li>
		<li>Añadir inmediatamente 10 ml de PBS que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) para saciar la reacción.</li>
		<li>Centrifugar la solución a 300 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y repita este paso de lavado tres veces. Cuente las celdas al final de la tinción CFSE utilizando un contador Coulter (Tabla de Materiales).</li>
		<li>Cosecha células teñidas cfSE (no estimuladas), resuspenden en 1% de PFA y almacenar a 4 oC para su análisis por citometría de flujo.</li>
		<li>Incubar el número deseado de células CAR T teñidas con CFSE con células de tipo K562-CD19 (objetivo) irradiadas, así como de tipo K562-wild (control) en una proporción de 1:1 para 120 h en medio de cultivo libre de citoquinas y condiciones de cultivo como se describe en el paso 1.1.</li>
		<li>Después de 24 h, centrifugar el recipiente de cultivo a 300 x g durante 5 min. Recoger 120 l de sobrenadante celular. Evaluar la producción dependiente de la activación de IL2, IFN, TNF, GM-CSF y otras citoquinas inflamatorias (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 e IL10) por luminex analiza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</li>
		<li>Sustituya el volumen de sobrenadante que se recopiló en el paso 3.1.7 por un volumen equivalente (120 l) de medio fresco.</li>
		<li>En el día 3 (es decir, después de 96 h), cuente y vuelva a alimentar a una concentración de 0,5 x 106 celdas/ml utilizando citometría de flujo basada en perlas como se ha incluido anteriormente en el paso 1.5.</li>
		<li>En el día 5, cuente el CD3vivo + las células y calcule el cambio de plegado de las células T vivas en relación con el recuento de células T vivas en el día 0.</li>
		<li>Realizar un análisis exhaustivo de la dilución CFSE en la división de células T CAR utilizando el software FlowJo para resaltar rondas sucesivas de la división celular. NOTA: Los ensayos de proliferación están bien descritos en el manual de FlowJo.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de citotoxicidad NOTA: La capacidad de las células CART19 para eliminar las células objetivo que expresan CD19 se evalúa mediante un ensayo de liberación de 51Cr.<ol>
<li>Etiquete las células diana mezclando 5 x 105 K562-CD19, células de control de tipo K562-wild, o células de leucemia NALM6 con 50 s de Na251CrO4 y 0,5 ml de RPMI suplementadas con 10% de FBS para 90 min en la incubadora a 37 oC.</li>
		<li>Células centrífugas a 300 x g durante 2,5 min. Deseche el sobrenadante radiactivo en recipientes de eliminación adecuados y lave las células diana en 5 ml de PBS. Repita los pasos de lavado dos veces.</li>
		<li>Resuspenda las células diana en un medio libre de rojo fenol que contenga un 5% de FBS. Utilice este medio para el resto del procedimiento para reducir el fondo.</li>
		<li>Después de evaluar la expresión CAR y la viabilidad celular por citometría de flujo (como se describe en la sección 5.1), mezcle las células T CAR con las celdas de destino etiquetadas en las relaciones effector:target (E:T) de 10:1, 3:1 y 1:1, por triplicado. Transfiera a una placa inferior U de 96 pocillos.</li>
		<li>Paralelamente, incluya las células diana solas y las células diana con 1% de sulfato de dodecilo sódico (SDS), para determinar la liberación espontánea (S) y máxima (M) 51Cr, respectivamente.</li>
		<li>Células centrífugas a 300 x g durante 5 min e incubar durante 4 h o 20 h en una incubadora de 37oC con 5% deCO2.</li>
		<li>Después de la hora designada, centrifugar el recipiente de cultivo a 300 x g durante 5 min. Recoger 35 l de sobrenadante celular y transferirlo a una placa lectora. Evite las burbujas. Deje que el plato se seque durante la noche.</li>
		<li>Sellar la placa con un sello de placa estándar y contar con un contador de centelleo líquido. La abundancia de cromo en el sobrenadante proporciona un proxy de la matanza de células objetivo. Calcule el porcentaje de lisis específica de la siguiente manera: 100 x (cuenta por minuto [cpm] versión experimental – liberación cpm S)/ (liberación cpm M – liberación cpm S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis funcional in Vivo
<ol><li>Obtenga ratones DE10 semanas de edad de NOD-SCIDc–/– (NSG), que carecen de un sistema inmunitario adaptativo, y asígnelos al grupo de tratamiento/control aleatoriamente.</li>
	<li>Inyectar animales por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 1 x 106 células NALM6 en PBS estéril de 0,1 ml.</li>
	<li>Después de 5 a 7 días, confirme el injerto tumoral por imágenes de bioluminiscencia (BLI). Inyectar 150 mg/kg de D-luciferina a ratones que han sido anestesiados con isoflurano (el volumen depende de la masa corporal).</li>
	<li>Mida los valores de bioluminiscencia utilizando un sistema de imágenes. Cuantifique el flujo total utilizando el software correspondiente dibujando rectángulos de área idéntica alrededor de ratones, alcanzando desde la cabeza hasta el 50% de la longitud de la cola. Restar el fondo de cada imagen individualmente.</li>
	<li>Después de establecer la leucemia, inyectar 3 x 106 día 9 células CART19, 0,5 x 10 6 día3 células T CAR, o las correspondientes células T humanas no transducidas (NTD) a través de la vena de cola en un volumen de 100 ml de PBS estéril/Ca2+. NOTA: Como la bioactividad de las células cosechadas a varios intervalos durante el proceso de cultivo es diferente, la concentración elegida de células del día 3 es inferior al día 9.</li>
	<li>Para determinar la progresión de la enfermedad, mida los valores de bioluminiscencia dos veces por semana como se describe anteriormente en el paso 4.3.</li>
	<li>Para determinar el injerto de células T CAR, recoja sangre de 75 ml mediante sangrado retroorbital en un tubo recubierto con EDTA. Transfiera 50 s de sangre a tubos de conteo absolutos.</li>
	<li>Sangre de mancha con anticuerpos contra CD45, CD4, CD8 y CAR durante 30 min a RT. Añadir 400 l de 1x solución de leite FACS a los tubos y vórtice a fondo. Después de la tinción, analice la expresión del marcador de superficie por citometría de flujo. NOTA: Otros marcadores de superficie se pueden utilizar para evaluar la diferenciación y el estado de agotamiento de los glóbulos T en la sangre.</li>
	<li>Para medir los niveles de citoquinas en la sangre, centrifugar la sangre a 1.200 x g durante 30 min a 4 oC para separar el suero de la capa superior de sangre.</li>
	<li>Recoja el suero y mida las citoquinas con una placa de lectura designada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>

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<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos enfoques para medir la función y eficacia de las células T CAR cosechadas a intervalos variables a lo largo del cultivo ex vivo. Nuestros métodos proporcionan una visión completa de los ensayos diseñados para evaluar la capacidad proliferativa, así como la función del efector in vitro. Describimos cómo medir la actividad de los linfocitos T después de la estimulación a través de la CAR y los modelos de xenoinjerto de detalle de la leucemia utilizando células T CAR cosechadas en el día 3 frente al día 9 d...

Los receptores de antígeno quimérico (CAR) proporcionan un enfoque prometedor para redirigir las células T contra antígenos tumorales distintos. Los CAR son receptores sintéticos que unen un objetivo de antígeno. Aunque su composición precisa es variable, los RCA generalmente contienen 3 dominios distintos. El dominio extracelular dirige la unión a un antígeno objetivo y normalmente se compone de un fragmento de anticuerpo de cadena única vinculado a la CAR a través de una bisagra extracelular. El segundo dominio, comúnmente derivado de la cadena CD3 del complejo del receptor de células T (TCR), promueve la activación de la célula T después de la participación de la CAR. Un tercer dominio coestimulante se incluye para mejorar la función de las células T, injerto, metabolismo, y la persistencia. El éxito de la terapia con células T CAR en diversas neoplasias malignas hematopoyéticas incluyendo leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y mieloma múltiple pone de relieve la promesa terapéutica de este enfoque1,2,3,4,5,6. Las recientes aprobaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para dos terapias de células T CAR específicas de CD19, tisagenlecleucel para ADULTOs pediátricos y jóvenes adultos ALL y axicabtagene ciloleucel para linfoma difuso de células B grandes, refuerza el mérito traslacional de la Terapia de células T CAR.
Los enfoques basados en T DE CAR implican el aislamiento de los glóbulos T de la sangre periférica, la activación, la modificación genética y la expansión ex vivo. La diferenciación es un parámetro importante que regula la eficacia de las células T de la CAR. En consecuencia, la restricción de la diferenciación de células T durante el cultivo ex vivo mejora la capacidad del producto infundido para injertar, expandir y persistir, proporcionando inmunovigilancia a largo plazo después de la transferencia adoptiva2,7,8,9. Las células T consisten en varios subconjuntos distintos, incluyendo: células T ingenuas (Tn), memoria central (Tcm), memoria del efector (Tem), efector diferenciado (Tte) y memoria de células madre (Tscm). Los células T diferenciadas por efector tienen una potente capacidad citolítica; sin embargo, son de corta duración y injertan mal10,11,12. Por el contrario, las células T con un fenotipo menos diferenciado, incluidas las células T ingenuas y Tcm, presentan capacidades superiores de injerto y proliferación tras la transferencia celular adoptiva13,14,15,16,17,18. La composición de las células T recogidas en el producto prefabricado puede variar entre los pacientes y se correlaciona con el potencial terapéutico de las células T CAR. La proporción de células T con un inmunofenotipo de forma ingenua en el producto de aféresis inicial está altamente correlacionada con el injerto y la respuesta clínica19.
La duración del cultivo es un parámetro importante que influye en la diferenciación en las células T CAR preparadas para la transferencia adoptiva. Recientemente desarrollamos un enfoque para generar células T CAR de calidad superior utilizando un paradigma de cultivo abreviado20. Utilizando nuestro enfoque, mostramos que el cultivo limitado da lugar a células T CAR con función efectora superior y persistencia después de la transferencia adoptiva en modelos de xenoinjerto de leucemia. Aquí, presentamos los enfoques para generar confiablemente células CART19 (células T autólogas diseñadas para expresar scFv anti-CD19 conectados a CD3 y los dominios de señalización 4-1BB) e incluir una descripción detallada de los ensayos que proporcionan información sobre la bioactividad y eficacia de CAR T antes de la transferencia adoptiva.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads anti CD3/CD28</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Ratón APC Anti-Humano CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 Anticuerpo anti-CD8 Humano</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Solución de lisis 10X Concentrado</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Tubos de conteo absoluto</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-humano Anticuerpo CD4</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-humano Anticuerpo CD3</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Kit de Proliferación Celular Life</td><td>Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen</td><td></td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD197 (CCR7) Anticuerpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Suero AB humano</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 IS humano, grado premium</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Contador de centelleo líquido, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Sondas moleculares violetas fijables</td><td></td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Contador Coulter</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Anticuerpo CD14 antihumano</td><td>azul BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD19 antihumano azul</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE antihumano Anticuerpo CD45RO BD</td><td>Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 antihumano CD95 (Fas) Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-humano Anticuerpo CD27</td><td>Beckman Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Medio sin rojo de fenol</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>Solución SDS ultrapura, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferina - K+ Sal</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de células t del receptor de antígeno quimérico (car) para inmunoterapia adoptiva

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

La inmunoterapia adoptiva es prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas. Describimos un enfoque simple para transducir células T humanas primarias con receptor de antígeno quimérico (CAR) y expandir su progenie ex vivo. Incluimos ensayos para medir la expresión CAR, así como la diferenciación, la capacidad proliferativa y la actividad citolítica. Describimos ensayos para medir la producción de citoquinas efector y la secreción inflamatoria de citoquinas en células CAR T. Nuestro enfoque proporciona un método fiable y completo para el cultivo de células T CAR para modelos preclínicos de inmunoterapia adoptiva.

Usando los métodos descritos anteriormente, estimulamos y expandimos las células T durante 3 o 9 días(Figura 1A,B). También analizamos su perfil de diferenciación, como lo indica la estrategia de medición esbozada en la Figura 1C,midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Mostramos un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector a lo largo del tiempo durante el cultivo ex viv...

Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating un producto CAR T Cell con competencia funcional que ingrafota, prolifera y tiene actividad cit-el-uric después de la perfusión es un componente clave de una inmunoterapia adoptiva eficaz. Por ejemplo, en tumores sólidos, células T CAR pueden penetrar tumores sólidos y reciben una estimulación óptima del antígeno;sin embargo, su injerto general y la proliferación se ve obstaculizada en las personas. El principal beneficio de este enfoque es que puede conservar la calidad de las células T CAR o el estado de diferenciación de las células T DEL CAR sin generar células T diferenciadas o agotadas terminalmente, que habrían disminuido la capacidad proliferativa o una función efectiva deficiente después de la perfusión.Esta técnica puede ser difícil porque las células T son muy sensibles a su concentración celular o a la superficie de los vasos en los que se cultivan. Así como sus necesidades metabólicas. Esencialmente las células T necesitan ser mantenidas felices durante todo el proceso, de lo contrario no crecerán.Para comenzar este procedimiento, establecer platos de cultura de 6 pozos. Activar células T humanas primarias frescas o crio-preservadas mezclándolas con cuentas magnéticas anti-CD3 CD28, a una proporción de tres cuentas por célula T en los pozos de los platos de cultivo. Cultivo de las células T en X-Vivo 15 medio complementado con suero HUMANO normal AB, L-glutamina, he-pees e IL2.Activar las células T a una concentración de un millón de células T por mililitro durante la expansión. Y cultivarlos a 37 grados Celsius con 20%oxígeno, 5% dióxido de carbono y 95% de humedad. Después de la estimulación durante la noche, añadir sobrenadantes lentivirales a las células T activadas.Calcular el volumen de sobrenadantes necesarios para lograr una multiplicidad de infección entre tres y cinco. Continúe cultivando las células usando las mismas condiciones. En el tercer día, recoger una alícuota representativa de las células de la crio-preservación.Antes de la criopreservación, retire las perlas magnéticas pipeteando suavemente y la separación magnética. Prepare el medio de congelación, que contiene PBS con 0,5%DMSO. Y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar.A continuación, centrifugar las células T a 300 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de PBS. Centrifugar las células de nuevo a 300 veces G durante cinco minutos y desechar el PBS.Suspendimos el pellant en un mililitro de medio crio-preservación en frío. Congele las células T en un recipiente de congelación refrigerado. Y almacenar a menos 80 grados Celsius durante 48 horas.Después de esto, transfiera las células congeladas al nitrógeno líquido. Lavar el resto de las células T una vez en cinco mililitros de PBS para eliminar cualquier vector residual. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos.Luego, decantar el PBS y volver a suspender el pellant celular en el medio de cultivo de células T a una concentración de 500.000 células por mililitro. Divida las células T en dos cultivos diseñados 45 y nueve. Cuente las células T por citometría de flujo utilizando cuentas y anticuerpos monoclonales para CD4 y CD8 humanos.Así como un tinte de viabilidad. Realimentar los cultivos cada dos días para mantenerlos a una concentración de 500.000 células por mililitro. En el quinto día, cuente y crio-preservar el día cinco culturas como se describió anteriormente.El día siete, lave 500.000 células en PBS. Y re-suspenderlos en 100 microlitros de fluorescencia activado buffer de clasificación de células. A continuación, detecte la expresión de la proteína superficial CAR mediante inmunomanteración con un anti-CAR 19 conjugado fluorescente por citometría de flujo.En el día nueve cuenta y crio-preservar el día nueve culturas como se describió anteriormente. En este estudio se mide la función y eficacia de las células T CAR que se cosechan a intervalos variables a lo largo del cultivo de X-Vivo. Usando los métodos descritos en este video, las células T se estimulan y expanden durante tres o nueve días.El perfil de diferenciación de células como se indica en la estrategia de gating que se muestra aquí, se analiza midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector se observa con el tiempo durante la cultura X-Vivo. A continuación, se evalúa la función del efector y la capacidad proliferativa de las células T CAR en respuesta al antígeno.Las celdas que se expanden menos son funcionalmente superiores a las que se cultivan ampliamente durante una duración más larga. En un modelo de ratón de xenoinjerto humano de TODO se compara la potencia de las células T CAR cosechadas en diferentes períodos de tiempo. Las células de nueve días muestran una respuesta antihím de dosis dependiente con una respuesta completa que vale una dosis alta de tres millones;y una pérdida de eficacia para la dosis baja de 500.000.Sin embargo, las tres células del día mostraron un control persistente del tumor en dosis altas y bajas. Esta respuesta se asocia con el recuento absoluto de CAR-T 19 en la sangre periférica de ratones. En general, estos resultados proporcionan evidencia de que las células T del CAR cosechadas antes, superan a las cosechadas más tarde.Después de este procedimiento, se pueden realizar ensayos de función adicionales como el ensayo de caballitos de mar para medir sus propiedades metabólicas, como el consumo de oxígeno o la capacidad de spir-it-ed. También se pueden realizar varias rondas de reestimulación para proporcionar información sobre su diferenciación y persistencia de las células T del CAR. Usando este trabajo como fundación, nosotros y otros investigadores estamos involucrados en estudios para abreviar aún más el proceso de cultivo.También se puede extender en el diseño de enfoques básicos para otros antígenos cancerosos. Siempre hay que tener cuidado cuando trabaje con lentivirus. Pero incluso cuando el lentivirus está diseñado para ser incompetente para la replicación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video muestra una técnica para fabricar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. Las células T humanas se incuban con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, junto con un medio suplementado con interleucina-2 (IL-2), lo que conduce a la activación y proliferación de las células T. Se introducen vectores lentivirales transgénicos, lo que permite que el ARN transgénico se integre en el genoma del huésped y exprese el transgén. Esto da como...

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Este video muestra una técnica para la generación ex vivo de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno tumoral. Los vectores retrovirales portadores de ARN transgénico se mezclan con células de bazo en un medio suplementado con interleucina-2 para promover la supervivencia y proliferación de las células T. A continuación, la mezcla se transfiere a una placa recubierta con fragmentos de fibronectina humana recombinante y se centrifuga para facilitar la fusión del...

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Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.

Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR

En este artículo se detalla el proceso de fabricación de linfocitos T receptores de antígenos quiméricos para uso clínico, concretamente utilizando un procesador celular automatizado capaz de realizar la transducción viral y el cultivo de linfocitos T. Proporcionamos recomendaciones y describimos los escollos que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo del proceso y la implementación de un ensayo clínico de fase inicial.

Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo describe un procedimiento detallado para generar células T con receptor de antígeno quimérico transitorio (CAR) utilizando ARNm no integrador para la inmunoterapia contra el cáncer y proporciona métodos confiables para evaluar las células CAR-T y su función citotóxica.

Un enfoque no viral para generar células T receptoras de antígenos quiméricos transitorios mediante ARNm para la inmunoterapia contra el cáncer

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Este protocolo describe los pasos esenciales para el cultivo de células T primarias, incluyendo su aislamiento, activación, expansión y transfección transitoria mediante electroporación de ARNm. Además, se propone un flujo de trabajo y un panel de anticuerpos para el análisis citométrico de flujo del fenotipo, marcadores de activación, viabilidad y expresión del receptor quimérico de antígenos (CAR).

Aislamiento, cultivo y transfección transitoria de células T humanas primarias para generar células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)

Aprende a fabricar células T CAR con competencia funcional para inmunoterapia adoptiva. Este método preserva la calidad celular y evita la diferenciación terminal, mejorando la eficacia terapéutica en tumores sólidos.

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

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