Name: Etiquetado metabólico extremadamente rápido y específico de ARN In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: Aprende a purificar ARN recién sintetizado en Saccharomyces cerevisiae mediante marcaje con 4-tiouracilo. Este protocolo rápido permite experimentos pulse-chase con bajo fondo y alta especificidad.

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Este trabajo fue apoyado por la financiación de Wellcome a JB [104648]. El trabajo en el Wellcome Centre for Cell Biology está respaldado por la financiación básica de Wellcome [092076]. Los autores reconocen a los miembros del laboratorio por su ayuda: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna De Lucas-Arias y Shiney George. Los autores también quieren dar las gracias a Patrick Cramer por el plásmido YEpEBI31111.

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este artículo presenta un protocolo para el etiquetado 4tU extremadamente rápido y específico, para la recuperación del ARN naciente y recién sintetizado de S. cerevisiae después de tan solo 15 s de etiquetado, con muy baja contaminación por ARN sin etiquetar.
El usuario siempre debe tener cuidado de mantener la integridad del ARN mediante el uso de temperaturas frías y reactivos tratados con DEPC. La purificación de perlas de streptavidina es generalmente confiable; sin embargo, el búfer de cuentas es difícil de manejar; debe hacerse recién, con sus componentes añadidos en el orden correcto, y no refrigerados o autoclavedos. Las fallas comunes incluyen que el ARN se disuelva incompletamente después de los pasos de precipitación, y por lo tanto no se biotinyla o se pierde de otra manera durante los pasos de procesamiento. Hay una amplia ayuda para la solución de problemas en el material complementario.
Hay algunas limitaciones a tener en cuenta en ers4tU. Uno ya se menciona es que 4tU ralentiza el crecimiento de la levadura (Figura1a). Aparte de los ARN osnicidas endógenasmente9, sólo los ARN que se han transcrito durante el período de etiquetado pueden ser purificados por este método. Las polimerasas que se detienen en genes durante todo el tiempo de tiolación no producirán transcripciones tioladas que puedan purificarse, aunque se pueden recuperar transcripciones que están parcialmente etiquetadas debido a que las polimerasas entran o salen de un estado de pausa durante la tiolación. Las cepas que transcriben mal, ya sea debido a mutaciones o condiciones de crecimiento, producen poco nsRNA, aunque las técnicas utilizadas aquí sin embargo mejorarán la recuperación de nsRNA en comparación con otros métodos. Pueden ser necesarios tiempos más largos y mayores volúmenes de cultivo en estas cepas y condiciones. Tenga en cuenta que el uracilo es una buena fuente de nitrógeno y por lo que este método debe ser probado antes de ser utilizado para estudios que implican inanición de nitrógeno.
El protocolo ers4tU es particularmente útil para el análisis de ARN de corta duración, muchos de los cuales se degradan tan rápidamente que no se pueden identificar sin paralizar la maquinaria de degradación. Algunos ejemplos son las transcripciones inestables crípticas (SUPitas)4y las transcripciones cortas producidas por la terminación prematura o la pausa proximal del promotor18 y la transcripción antisentido "ascendente" de un promotor (PROMPT)19. Los intermedios producidos durante el procesamiento de especies estables de ARN también son transitorios, pero pueden enriquecerse utilizando la transcripción ers4tU4. Por lo tanto, el protocolo ers4tU es excepcional al permitir que las especies de ARN altamente transitorias sean analizadas y capturadas en condiciones casi fisiológicas, lo que es una gran ventaja sobre otros métodos. Esta técnica se ha utilizado para estudiar la transcripción y la cinética de procesamiento de ARN aguas abajo en mutantes de ARN polimerasa que se alargan más rápido o más lento de lo normal20.
La tiolación también es compatible con RNA-seq y SLAM-seq21,permitiendo que todo el ARN producido en un plazo de tiempo muy corto se caracterizó con exquisito detalle.

El ARN tiene una naturaleza dinámica; poco después de que se produce mucho ARN se procesa y degrada rápidamente. Actualmente, la mayoría de los estudios de metabolismo del ARN analizan el ARN celular total, que en su mayoría se procesa completamente y a nivel de estado estacionario. Este nivel depende del equilibrio entre las tasas de transcripción, maduración post-transcripción y degradación. El análisis de los procesos que conducen al equilibrio en estado estacionario requiere técnicas especializadas para capturar especies de ARN de muy corta duración.
El etiquetado metabólico del ARN con análogos de nucleótidos como 4-tiouracilo (4tU) o 4-tiouridina (4sU) (ver Duffy et al.1 para una excelente revisión), ofrece la capacidad de aislar ARN nacientes con tio-etiquetados y sus intermedios de procesamiento. Sin embargo, los protocolos publicadosimplican tiempos de etiquetado de varios minutos 2,3, lo que es lento en relación con la tasa de producción de muchas transcripciones. Tarda en transcribir el gen de la levadura promedio, por lo que etiquetar el ARN de levadura durante menos de un minuto puede considerarse extremadamente corto. El protocolo de 4 tiouracilos extremadamente rápido y específico (ers4tU) maximiza la relación señal-ruido maximizando la incorporación de 4tUy minimizando la recuperación del ARN preexistente sin etiquetar, haciendo que los tiempos de etiquetado muy cortos sean posibles 4.
La base modificada por tio debe importarse a las células rápidamente y en cantidad suficiente para etiquetar eficientemente el ARN recién sintetizado (nsRNA). Para promover esto, las células se cultivan en medio libre de uracilo, y la expresión de una permeasa adecuada ayuda a aumentar la ingesta de 4tU o 4sU (ver Tabla 1 para obtener una lista de plásmidos que llevan genes permeasasa adecuados y Figura Suplementaria 1). La solubilidad de 4tU en hidróxido sódico evita la necesidad de disolventes orgánicos tóxicos requeridos por otros análogos de nucleótidos. Desafortunadamente, se ha observado que el cultivo en cultivos en crecimiento durante largos períodos con nucleósidos modificados por tio a concentraciones superiores a 50 m interrumpe los ribosomas5. Sin embargo, la concentración (10 m) utilizada aquí, y los tiempos de etiquetado extremadamente cortos, minimizan los efectos nocivos5 (Figura1a),mientras que todavía producen suficiente ARN para el análisis.
Esta técnica se puede combinar con un agotamiento rápido y específico mediado por auxina de una proteína diana6,7 (Figura2), denominada el protocolo "a partir de LA AID 4U", en el que el estradiol regulaba la expresión de la auxina sistema de degron inducible (AID) se combina con el etiquetado 4tU. Con el enfoque de AID 4U, se puede agotar una proteína diana y controlar estrechamente el efecto sobre el metabolismo del ARN (Figura2). El momento es crítico; es aconsejable ver el vídeo adjunto y prestar mucha atención a la Figura 2 y su forma animada (consulte la Figura complementaria 2).
El procesamiento y la degradación del ARN deben detenerse extremadamente rápidamente para una resolución de tiempo precisa. Esto se logra utilizando metanol a baja temperatura, que fija el contenido celular muy rápidamente y degrada la membrana celular preservando el contenido de ácido nucleico8. La extracción del ARN debe ser eficiente y no dañar el ARN. La lisis mecánica es eficaz en ausencia de agentes chaotrópicos (a menudo estos contienen grupos tio, por lo que debe evitarse). Se prefiere la precipitación de cloruro de litio del ARN, ya que los ARNA se precipitan de manera menos eficiente. los tRNA se transcriben rápidamente yse tiolan naturalmente 9, por lo que la eliminación de los tRNA reduce la competencia por el reactivo de biotinylación. Si los ARN pequeños y altamente estructurados son de interés, se recomiendan métodos de precipitación de ARN a base de alcohol.
Para recuperar el ARN tiolado, la biotina se une covalentemente a través de los grupos tio incorporados en el ARN con 4tU. Se recomienda el uso de biotina modificada, que se une a través de un enlace de disulfuro escleable (p. ej., HPDP-biotina (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3'-(2o-pyridyldithio)propionamida, ) o MTS-biotina (metane thiosulfonate)) ya que permite la liberación del ARN mediante la adición de un agente reductor. El ARN biotinylated es la afinidad purificada en estreptavidina acoplada a cuentas magnéticas. Este protocolo es similar a otros enumerados anteriormente10, pero se ha optimizado intensivamente para reducir el fondo.
Existen dos tipos de experimentos de etiquetado tiol que se pueden realizar, el etiquetado continuo y discontinuo. Cada uno tiene sus propias ventajas. En el etiquetado continuo, el 4tU se añade al cultivo y las muestras tomadas a intervalos regulares. Este tipo de experimento muestra cómo se procesa el ARN y cómo cambian los niveles con el tiempo. Algunos ejemplos son la comparación de mutantes con experimentos de tipo salvaje y un experimento de persecución de pulsos. Los experimentos que se muestran en la Figura 3b,c son de este tipo. Para el etiquetado discontinuo se induce un cambio en el sistema y se supervisa el ARN. Una vez que el cambio ha sido inducido, la cultura debe dividirse en varias subculturas, y en momentos específicos, cada una es etiquetada por tio durante un breve período. Un ejemplo es el AID 4U que se muestra en la Figura 27. Este tipo de experimento es particularmente útil para monitorear el efecto de un cambio metabólico en el procesamiento de ARN (ver Figura 3d).
En la Figura 4 y la Figura 5se presenta una representación gráfica de un experimento de etiquetado tio, y está disponible una hoja de cálculo que simplifica en gran medida el rendimiento del protocolo (consulte 4tU experiment template.xlsx). Además de esto, la información complementaria contiene una extensa guía de solución de problemas. Para el protocolo AID 4U que integra el etiquetado 4tU con el protocolo de agotamiento de la auxina, véase la Figura 2 y la Figura Suplementaria2. Para obtener el protocolo detallado de agotamiento de AID, consulte Barrass etal.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (&beta; ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>PRECAUCIÓN tóxico. Las soluciones madre son aproximadamente 14 M, se fabrican a 1/20 dilución para su uso</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td><td>PRECAUCIÓN tóxico</td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>añadir 1/1000 volumen a una solución, dejar a temperatura ambiente durante 24 h, luego autoclave</td></tr><tr><td>DMF (N,N-dimetilformamida)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>tóxico EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>Hacer 0,5 M y pH a 8,0 con hidróxido de sodio</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP Biotina</td><td>Thermo scientific</td><td>21341</td><td>Almacenar protegido de la luz. Disuelva todo el contenido del vial en 22,7 mL de DMF (para hacer una solución madre de 4 mM). Almacene lejos del agua, en la oscuridad & a -20 &deg;C. Verifique la solución antes de usar, ya que algunos lotes de HPDP precipitan en el almacenamiento; calentar a 42 ° C para volver a suspender.</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno [20 mg/mL]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10901393001</td><td>almacenar a -20 &°; C</td></tr><tr><td>Gel reductor de disulfuro TCEP inmovilizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>Solución opcional</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>10 M. ATENCIÓN: esto se calienta mucho a medida que se disuelve e incluso puede hervir a más de 100 oC, agregue los cristales de LiCl al agua lentamente.</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 M. ATENCIÓN: esto se calienta mucho a medida que se disuelve e incluso puede hervir a más de 100 oC, agregue los cristales de MgCl2 al agua lentamente.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>PRECAUCIÓN Tóxico e inflamable</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>Haga soluciones de 1 M de cada uno y mezcle en igual cantidad para obtener una solución del pH apropiado</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>5 M</td></tr><tr><td>solución de fenol, pH bajo. &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Almacenar en la oscuridad a 4 &deg;C. PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>tóxico Fenol Cloroformo 5:1 (125:24:1) pH bajo.&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>Almacene en la oscuridad a las 4 &deg;C. PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>tóxico Columnas de giro Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>69702</td><td></td></tr><tr><td>SCSM opcional puntera simple &ndash; ura</td><td>Formedium&nbsp;</td><td></td><td></td>DSCS101</tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>Hacer una solución de 3 M y pH a 5.3 con ácido acético</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>PRECAUCIÓN corrosivo</td></tr><tr><td>SDS (Dodecil sulfato de sodio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>PRECAUCIÓN irritante, no inhale</td></tr><tr><td>Estreptavidina Perlas magnéticas</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>Almacenar en 4&deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERase-In, inhibidor de la RNasa</td><td>Tecnologías de vida&nbsp;</td><td>Tienda AM2696</td><td>a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Tiolado Schizosaccharomyces pombe para la espiga</td><td></td><td></td><td>Véase la sección 1.7 del protocolo</td></tr><tr><td>4-tiouracilo (4tU)&nbsp;</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>359930010</td><td>Almacenar en la oscuridad. Genere 100 mM de stock en 1M de NaOH, almacene soluciones a -20&nb;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362 1</td><td>M soluciones a varios pH</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5 mg / ml, almacenar a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Prepare 1 M de solución en H2O. Divida en alícuotas de 2 mL y almacene a -20 C.</td></tr><tr><td>Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos&nbsp; con sulfato de amonio</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Columns 0.5ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>Almacenar a 4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuentas de circonio</td><td>Thistle Scientific</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td> Se <td>pueden utilizar otros homogeneizadores; se deben establecer las condiciones correctas para cada homogeneizador y cepa.</td></tr><tr><td>Bioanalizador (Agilent) o similar para evaluar la calidad del ARN. Si esto no es importante, un espectrofotómetro es útil para cuantificar el ARN.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: capaz de hacer girar cultivos a 4 & grados; C y al menos 3000 g. Enfríe previamente si es posible.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: capaz de hacer girar tubos de hasta 2 mL a velocidades variables de hasta 13.000 g y hasta 1000 g&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack magnético para separar las perlas de la muestra. El que se utiliza en el papel está impreso en 3D, disponible en Thingiverse (thing:3562952). Existen bastidores disponibles en el mercado&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR con tapa calefactada que permitirá la incubación en la oscuridad.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rueda giratoria para rotar tubos de 1,5 mL de extremo a extremo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Se recomienda agitar el bloque calefactor (como el termomezclador Eppendorf)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos, centrífuga, baja retención, sin RNasa 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, centrífuga, baja retención, sin RNasa 1,5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12350</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, centrífuga, 50 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>Otros tubos de centrífuga no son a prueba de gases, lo que permite que el CO2 se disuelva en el metanol, que sale de la solución vigorosamente al agregar cultivo caliente, lo que lleva a la pérdida de la muestra</td></tr><tr><td>Tubos, centrífuga, 15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, 2 mL, tapón de rosca</td><td>Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>Tubos 0,2 mL tira de 8 con tapas integradas</td><td>Marca 781332</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado metabólico extremadamente rápido y específico de arn in vivo con 4-thiouracil (ers4tu)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

El análogo de nucleótidos, 4-tiouracilo (4tU), es fácilmente tomado por las células e incorporado en el ARN a medida que se transcribe in vivo, permitiendo el aislamiento del ARN producido durante un breve período de etiquetado. Esto se hace mediante la unión de una mitad de biotina al grupo tio incorporado y purificación de afinidad, utilizando cuentas recubiertas de estreptavidina. Lograr un buen rendimiento de ARN puro y recién sintetizado que está libre de ARN preexistente hace posible tiempos de etiquetado más cortos y permite una mayor resolución temporal en estudios cinéticos. Este es un protocolo para la purificación muy específica y de alto rendimiento del ARN recién sintetizado. El protocolo presentado aquí describe cómo se extrae el ARN de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, el protocolo para la purificación del ARN tiolado del ARN total debe ser eficaz utilizando ARN de cualquier organismo una vez que se ha extraído de las células. El ARN purificado es adecuado para el análisis por muchas técnicas ampliamente utilizadas, tales como transcriptasa inversa-qPCR, RNA-seq y SLAM-seq. La especificidad, sensibilidad y flexibilidad de esta técnica permiten una visión sin precedentes sobre el metabolismo del ARN.

Los rendimientos típicos para nsRNA recuperados usando este protocolo ers4tU se muestran en la Figura 1b, esto ha sido producido por un bioanalizador y el seguimiento muestra el rendimiento del ARN frente al tamaño (nucleótidos [nt]). Tenga en cuenta, tanto en la traza del bioanalizador como en el gráfico de inserción, que la recuperación de ARN desde el punto de tiempo 0 es una porción muy pequeña recuperada de puntos de tiempo más largos - aproximadamente 0,3 g de ARN recuperado de aproximadamente 109 células en comparación con más del doble de después de sólo 30 s de etiquetado (0,8 g de nsRNA) del mismo número de células. La recuperación del ARN a 15 s es más variable, ya que las pequeñas diferencias en la realización del muestreo tienen un efecto proporcionalmente mayor en la recuperación del ARN. En la traza del bioanalizador, los precursores de rRNA se pueden ver como un pico cercano a 1000 nt y un doblete de picos a 1700-1800 nt. La abundancia de estos intermedios aumenta a medida que continúa la tiolación.
El etiquetado tio se utilizó para cuantificar el empalme de la transcripción ACT1 (Figura 3). Se realizó tiolación y se monitorizaron muestras tomadas a intervalos de 15 s desde el inicio del tioetiquetado y el procesamiento del ARN ACT1 (Figura 3a,b). Como se puede ver, se genera pre-mRNA (por transcripción), y lariats (por el primer paso de empalme de pre-mRNA), incluso después de sólo 15 s de etiquetado. Después de unos 45 s a 1 min, las cantidades de lariats y pre-mRNA alcanzan el equilibrio con la mayor cantidad de estas especies de ARN que se crean por transcripción como se procesan por empalme.
Para producir los datos mostrados en la Figura 3c, la cepa se pulsaba con 4tU durante 25 s y luego se perseguía con uridina. La generación de pre-mRNA y lariats alcanza un máximo de 1 minuto. Esto se compara bien con la Figura 3b; el máximo que se alcanza después de 45 s para alcanzar el equilibrio más los 25 s del etiquetado. Después del pico, los niveles disminuyen a medida que los ARN etiquetados por tio se persiguen a través del proceso de empalme.
La Figura 3d muestra el agotamiento de un factor de empalme proteico y su efecto sobre el metabolismo del ARN, utilizando el sistema AID 4U6,7. Aquí, Prp16p se reduce de niveles fisiológicos cercanos al 5% de este nivel después de 25 minutos de agotamiento. Prp16p es un factor de empalme esencial para el segundo paso de empalme15. Los lariats se eliminan durante el segundo paso de empalme (Figura3a),pero aquí aumentan por encima del nivel de pre-mRNA como Prp16 se convierte en limitante. En momentos de agotamiento posteriores, otros factores se vuelven limitadores debido a los efectos secundarios, por lo que los niveles de lariat disminuyen, y los niveles de pre-arNM aumentan. El nivel de ARNm empalmado disminuye.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figura 1: Crecimiento en 4tU y recuperación de ARN. (a ) 4-tiouracilo afecta el crecimiento. El aumento de la concentración de 4tU en el medio de crecimiento de abandono de YMM sin uracilo aumenta el tiempo de duplicación de S. cerevisiae (BY4741) que lleva el plásmido p4Fui-PEST. El crecimiento de cuatro cultivos de réplica sin resultado fue monitoreado a 30oC en un Tecan Infinite Pro 200. Todos los cultivos estaban en fase log a lo largo, con OD600 entre 0.1 y 0.6. Mock es una cultura de control con una cantidad equivalente de NaOH agregada, que por sí misma no cambia la tasa de crecimiento. Este gráfico demuestra que el etiquetado tio es un compromiso entre el etiquetado rápido y el daño a la célula. Las barras de error son un error estándar de 4 réplicas. (b) el rendimiento del nsRNA aumenta linealmente a partir de aproximadamente 15 s de etiquetado. La figura principal muestra los rastros bioanalizadores de purificado, nsRNA de 0 (no tiolado) a 2 min después de la adición de 4tU a intervalos de 15 s. Tenga en cuenta que la muestra de 15 s no se muestra, ya que era indistinguible de la muestra sin etiquetar. Los dos grandes picos corresponden a ARN ribosomales (RNN). Los precursores de rRNA e intermedios son visibles como varios picos con mayor peso molecular que los ARNm maduros. La recuperación de estos precursores e intermedios aumenta con el tiempo. Se muestran los resultados de un experimento representativo. El gráfico de inserción muestra la recuperación de nsRNA con incubación creciente con 4tU. El rendimiento de nsRNA aumenta con el aumento del tiempo de crecimiento con 4tU. La recuperación es notablemente lineal (R2 a 0,934) a lo largo de la escala temporal de este experimento y muestra un ligero aumento sobre el fondo, incluso a 15 s de etiquetado con 4tU, aunque no se distingue de la muestra sin etiquetar por ojo del bioanalizador Rastro. Las barras de error muestran un error estándar para tres réplicas biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figura 2: protocolo gráfico AID 4U-est AID 4U. Un resumen gráfico del protocolo del protocolo AID 4U. El sistema de descontento inducible de auxina (AID) que, a su vez, agota una proteína diana etiquetada CON AID*, consulte Barrass et al.7 para obtener un protocolo detallado. En este caso, la expresión del sistema de degron se inicia 25 minutos antes de que comience la degradación de la proteína y la tiolación en cada punto de tiempo es de 1 min. Aparece una versión animada en la figura complementaria 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figura 3: Precursores e intermedios del empalme de ARN ACT1. El empalme de las transcripciones pre-mRNA ACT1 fue monitoreado por transcripción inversa cuantitativa PCR16. Los niveles de precursor ACT1 (pre-mRNA), lariat-exon2 intermedio (Lariat) y producto empalmado (mRNA) se muestran normalizados frente al nivel de ACT1 Exon2 y los niveles de estado estacionario de estos ARN. (a) Ubicación de los productos qPCR en la transcripción act1. Esquema de las ubicaciones de los productos qPCR utilizados para analizar los niveles de precursores, intermedios y productos de la reacción de empalme de las transcripciones ACT1 16. Los exons están representados por cajas, intron como una línea y los productos qPCR como líneas con diamantes en ambos extremos, el color coincide con los utilizados en los gráficos. El PCR pre-mRNA es específico para pre-mRNA y no cualquier intermedio de empalme ya que este producto cruza el punto de bifurcación que se interrumpe después del primer paso de empalme. Lariat PCR detectará el producto del primer paso de empalme y el lariat extirpado producido después del segundo. El MRNA PCR es específico para el producto de empalme, ARNm. Los resultados del PCR exón (presente en todos los precursores, intermedios y productos, excepto el lariat extirpado) no se muestran en los gráficos, ya que se utilizó para normalizar los datos y, por lo tanto, siempre es igual a 1. (b) Tiolar continuo. La cantidad de pre-mRNA aumenta con el tiempo a medida que 4tU se incorpora por transcripción y, después de un breve retraso, el empalme lo convierte en productos intermedios y empalmados lariat-exon2. Los niveles de estas especies pre-mRNA y lariat son detectables sobre el fondo después de tan solo 15 s de crecimiento con 4tU y alcanzan un máximo después de aproximadamente 45 s de etiquetado continuo con 4tU, momento en el que su producción se equilibra por conversión a empalmada ARNm y/o degradación. Los valores se normalizan a su estado estacionario (punto más a la izquierda del gráfico) y los niveles de exón 2 para mostrar su apariencia y procesamiento en comparación con la transcripción del exón 2. Como el empalme de ARN de ACT1 es en gran parte co-transcripcional4,17 mRNA empalmado rápidamente se convierte en la especie más abundante, su nivel es similar al del exón 2. Error estándar de tres réplicas biológicas, cada una ensayada por triplicado. (c) Pulso/persecución. Pulso de tiolación de 25 segundos seguido de persecución con uridina. En comparación con los niveles de estado constante de estos ARN (punto izquierdo), inicialmente son muy abundantes en la piscina recién sintetizada. Los niveles disminuyen gradualmente a medida que se procesan en ARNm (o degradado), acercándose a niveles muy similares a los niveles de estado estacionario en 5 min. Error estándar de tres réplicas biológicas, cada una ensayada por triplicado. (d) nsRNA y agotamiento de proteínas. Empalme de transcripciones pre-mRNA ACT1 supervisadas por PCR de transcripción inversa cuantitativa como en el panel(a ) tras el agotamiento de la proteína Prp16 utilizando el sistema de degron auxin como se describe en la Figura 2. Los niveles de proteína Prp16 también se muestran en el gráfico trazado contra el segundo eje Y como porcentaje de los niveles antes del agotamiento de la auxina. Prp16 es un componente vital del espliceosoma, particularmente importante para el segundo paso de empalme que se muestra en el panel(a ), después de lo cual los lariats se degradan. Cuando este paso se convierte en lariats limitantes se acumulan inicialmente. En momentos posteriores, el empalme falla por completo, los lariats ya no se producen y los niveles de pre-mRNA aumentan. Las barras de error son un error estándar de tres réplicas biológicas, cada una de las que se ensayo en triplicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figura 4: Resumen gráfico de las secciones de protocolo 1 a 3. Las células son tioladas con 4tU y se les permite crecer para incorporar el nucleótido modificado en el ARN. Se puede añadir un pico de s. pombe tilado para permitir la normalización a través de puntos de tiempo y experimentos. El pulso de 4tU se puede perseguir usando uridina no tiolada. El etiquetado puede realizarse continuamente a partir de la adición de 4tU o de un cambio en las condiciones de crecimiento, la división de cultivos y 4tU añadido a los cultivos en momentos cada vez mayores a partir del cambio de condición de crecimiento, pero cada etiquetado sólo por un breve tiempo. Las células se recogen, y el ARN se prepara de las células, preferiblemente utilizando un homogeneizador y métodos basados en fenol. El ARN se biotintila y luego el ARN biotinilado purificado a partir de biotina no incorporada utilizando una columna de exclusión de tamaño. El nsRNA ya está listo para su purificación con perlas de estreptavidina (sección 4, Figura5). Los números en rojo corresponden a los números de paso del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figura 5: Resumen gráfico de la sección 4 del protocolo. Siguiendo con las secciones 1 a 3 (Figura4),las perlas de estreptavidina se bloquean y la muestra de ARN biotintilado se añade a las perlas preparadas. El ARN biotintida se une a las perlas de estreptavidina y el ARN no biotinilado eliminado y lavado. El ARN biotinylated se eluye de las cuentas usando éME y se precipita listo para más investigación. Los números en rojo corresponden a los números de paso del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1: Mejora de la recuperación del ARNN de las células de levadura con y sin copias adicionales del importador a los 1 y 3 minutos de etiquetado tio. Tenga en cuenta que Fui1 es el propio promotor de la levadura expresado a partir de un plásmido de 2 m. La copia genómica de este gen está presente en ambas cepas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 2: Versión animada del protocolo gráfico AID 4U-est AID 4U. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 1: 4tU_experiment_template.xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nombre del plásmido</td>
			<td>Importador/permease</td>
			<td>Marcador</td>
			<td>Comentario</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importa Uracil y Uridina, por lo que es ideal para experimentos de pulso/persecución.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui--PEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>El motivo PEST de Fui1 ha sido desactivado, por lo que el permeasano no se degrada cuando hay suficiente uracilo intracelular para las necesidades de la célula. Funciona bien en experimentos de etiquetado y mejora el rendimiento de pulso/persecución.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Uracil permeasa</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. Sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller et al.11. También contiene un gen de la timidas quinasa de timidina HSV.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(transportador de nucleósidos equilibrativos)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Todos los plásmidos se basan en 2 m. Todos los plásmidos p4 y pAT se basan en la serie pRS16 de plásmidos. FUI1 y FUR4 se expresan a partir de sus propios promotores endógenos.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Plásmidos utilizados con este protocolo.

El uso de uracilo tiolado para purificar sensible y específicamente el ARN recién transcrito de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Etiquetado metabólico extremadamente rápido y específico de ARN In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Este método es significativo porque ningún otro protocolo permite que el ARN recién sintetizado sea analizado en una escala de tiempo tan corta, y permite experimentos de persecución de pulsos con un pulso tan corto. Este protocolo funciona bien con el agotamiento de proteínas, como el protocolo Best AID 4U. La principal ventaja es que el fondo es bajo.Esto permite los tiempos de etiquetado cortos, mediante la eliminación de casi todo el ARN no antilado. El protocolo escrito también detalla muchos tipos diferentes de experimentos que se podrían realizar y cómo integrarlos en esta técnica. Para comenzar este procedimiento, haga crecer la levadura en el medio YMM a un OD 600 entre 0,6 y 0,8.En una campana de humo, agregue un metanol equivalente a 30 a 50% del volumen de muestra previsto a un tubo de 50 mililitros. Cierre bien los tubos, etiquete y colóquelos sobre hielo seco para enfriar. A continuación, etiquete dos tubos de mililitro para el almacenamiento a largo plazo de las muestras y colóquelos en hielo para enfriar.Agregue perlas de circonio a los dos tubos de mililitro. Enfríe al menos un mililitro de agua por muestra sobre hielo. Si se va a añadir un pico S.pombe al cultivo, coloque una alícuota de células de S.pombe tioladas en hielo para descongelar.Vórtices la alícuota descongelada y agréguela a la cultura. A continuación, añadir 4tU al cultivo a una concentración de 10 micromolares y mezclar vigorosamente. Thio-etiqueta durante un período de tiempo entre 15 segundos y cinco minutos.Tome muestras de la cultura a intervalos regulares hasta el final del curso de tiempo. Agregue cada muestra a uno de los tubos de centrífuga preparados que contienen metanol. Selle cada tubo, agite para mezclar bien y colóquelo sobre hielo seco.Una vez tomadas todas las muestras, colólas todas sobre hielo. Asegúrese de que ninguna de las muestras se haya congelado. Si alguno se ha congelado, escúbralos suavemente en la mano mientras invierte constantemente.Centrifugar las células a 3.000 veces g y a cuatro grados Celsius durante dos minutos para peletizar las células. Vierta el líquido y resuspendir el pellet en al menos un mililitro de agua helada en pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión al tubo de la tapa del tornillo preparado y coloque el tubo sobre hielo.Centrifugar las muestras brevemente a una velocidad superior a 13.000 veces g para re-pellet las células. Luego colóquelos de nuevo sobre hielo y retire el líquido. En primer lugar, agregue 400 microlitros de tampón AE, 40 microlitros de SDS y 800 microlitros de fenol a un pH bajo.Resuspend por vórtice durante 10 segundos. Luego lice las células en un homogeneizador durante tres ráfagas de dos minutos en el ajuste de potencia más bajo. Deje las muestras sobre hielo durante dos minutos entre pulsos de homogeneización.Coloque las células de lesed sobre hielo seco durante cinco minutos hasta que se solidifique. A continuación, utilice una microcentrífuga para girar las células a una velocidad superior a 13.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de esto, realizar la extracción de cloroformo fenol y la extracción de cloroformo como se describe en el protocolo de texto.Añadir entre 1/3 y 1/2 del volumen de 10 cloruro de litio molar y mezclar para precipitar el ARN. Centrifugar a una velocidad superior a 13.000 g durante cinco minutos. Retire el líquido y vuelva a girar brevemente la muestra para eliminar las escorias.A continuación, lave el pellet con 300 a 500 microlitros de 70% etanol. Centrifugar el pellet lavado brevemente, y retire cualquier etanol restante. Resolebuya el pellet de ARN en 90 microlitros de TE a un pH 7.0 calentando a 65 grados celsius mientras agita.Después de comprobar la solubilización completa del ARN, transfiera la suspensión a un tubo de 0,2 mililitros. Para empezar, biotinilo mediante la adición de 10 microlitros de la solución HPDP-biotina al ARN y mezclar a fondo. Incubar en la oscuridad a 65 grados centígrados durante 15 a 30 minutos.A continuación, prepare una pequeña columna de exclusión de tamaño y volumen de resina para excluir la biotina no incorporada. Retire la etiqueta inferior de la columna, afloje la tapa y coloque la columna en un tubo centrífugo de dos mililitros. Centrifugar a 1.500 veces g durante un minuto para vaciar el búfer y descartar el flujo a través.A continuación, agregue suavemente 0,3 mililitros de TE a la parte superior de la columna y vuelva a girar utilizando las mismas condiciones. Transfiera la columna lavada a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Una vez completada la incubación de la muestra, agregue la muestra a la parte superior de la columna.Centrifugar a 1.500 veces g durante dos minutos, dejando la muestra de ARN biotinilado en la parte inferior del tubo. Deseche la columna. Y agregue 1/3 a 1/2 volumen de cloruro de litio molar 10 al tubo que contiene la muestra.Mezclar para volver a precipitar el ARN. En primer lugar, vuelva a disolver el ARN en 200 microlitros de agua tratada con DEPC. Mida la concentración de ARN y calcule los volúmenes para cada muestra que darán cantidades iguales de ARN para todas las muestras.Agregue esta cantidad de ARN a un tubo fresco y agregue agua tratada con DEPC hasta un volumen total de 200 microlitros. Cuando una muestra esté a temperatura ambiente, agregue 25 microlitros de 10 x tampón NaTM, 25 microlitros de un fosfato sódico molar y 2,5 microlitros de 10%SDS. Mezcle bien y centrifugar suavemente a aproximadamente 100 g durante menos de 30 segundos.Prepare dos mililitros de tampón de perlas para cada muestra con un tampón NaTM x, fosfato sódico molar de 0,1 y 0,1%SDS. Añadir 50 microlitros de perlas de estreptavidina a un tubo de retención baja de 1,5 mililitros. Coloque el tubo en el bastidor magnético y espere a que las perlas se asienten.Luego, retire el líquido por aspiración. Para lavar las perlas, agregue 200 mililitros de tampón de cuentas y vórtice hasta que el pellet de cordón se resusppend. Centrifugar el tubo aproximadamente 100 veces g durante un máximo de cinco segundos.Coloque el tubo en el bastidor magnético para permitir que las perlas sean capturadas por el imán. Retire el líquido por aspiración si hay un pequeño número de muestras. Vierta el líquido y luego aspire si hay muchas muestras.Bloque con 200 microlitros de tampón de perlas, 10 microlitros de glucógeno y 2,5 microlitros de ARN. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos mientras giras de extremo sobre extremo a velocidad moderada. Después de esto, retire el líquido y lave de nuevo, como se describe en el protocolo de texto.Resuspender las perlas en la muestra, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras gira. Durante esta incubación, prepare un tubo fresco de 1,5 mililitros para cada muestra. Añadir 1/10 volumen de tres molares de acetato de sodio a pH 5,3 y 20 microgramos de glucógeno.Centrifugar aproximadamente 100 veces g durante tres segundos. Retire el ARN sin enlazar de las cuentas y lávelos como se describe en el protocolo de texto. Para eluir el ARN, añadir 50 microlitros de 0.7 molar beta mercaptoethanol a las cuentas.Después del vórtice y la centrifugación, coloque la suspensión en el bastidor magnético. Pipetear el ARN que contiene la solución en los tubos de centrífuga de 1,5 mililitros preparados. Elute una vez más como se describió anteriormente.A continuación, vuelva a colocar la muestra en el bastidor magnético para eliminar las perlas residuales del ARN eluido y transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 0,5 mililitros de unión baja y fresco. Mezcle la muestra. Y luego añadir 2.5 volúmenes de etanol para precipitar nsRNA.Después de mezclar e incubar, centrifugar a una velocidad de al menos 13.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Los rendimientos típicos de snRNA recuperados mediante este protocolo se muestran aquí. Tenga en cuenta que la recuperación de ARN en el punto de tiempo cero es una porción muy pequeña de la que se recuperó de puntos de tiempo más largos con sólo 0,3 microgramos de ARN que se recuperan de aproximadamente 30 mil millones de células.Después de sólo 30 segundos de etiquetado, sin embargo, más del doble de ARN se recoge del mismo número de células. En el rastro del bioanalyzer, nuestros precursores de ARN pueden ser vistos como un pico cercano a 1.000 nucleótidos y un doblete de picos en 1.700 a 1.800 nucleótidos. La abundancia de estos intermedios aumenta a medida que continúa la tiolación.A continuación, la tiolación se realiza con muestras que se toman a intervalos de 15 segundos desde el inicio del tio-etiquetado y se supervisa el procesamiento de la transcripción de ARN ACT1. Como se puede ver pre-mRNA y lariats se generan incluso después de sólo 15 segundos de etiquetado. Después de unos 45 segundos a un minuto, la cantidad de lariats y pre-mRNA alcanzan el equilibrio con la mayor parte de estas especies de ARN que se crean por transcripción como se procesan lejos por empalme.Los pasos más difíciles son aquellos que involucran las cuentas, lavado y bloqueo. Tenga cuidado de no perder las cuentas, o dejar que se sequen. Una vez que haya purificado el ARN recién sintetizado, puede utilizar cualquier procedimiento de análisis de ARN tradicional.Se recomienda que ejecute el ARN en un bioanalizador o similar. Después de eso, normalmente usamos QPCR y RNA-Seq para analizar el ARN. Este método resultó ideal para analizar la cinética del procesamiento de ARN.Los pasos más peligrosos son los que utilizan fenol y cloroformo en la extracción de ARN. Cada vez que use estos productos químicos en un recipiente sin sellar, hágalo en una campana de humos y use ropa protectora apropiada, un abrigo de laboratorio y guantes. Tenga especial cuidado de que no haya perlas de circonio en el hilo del tubo de la tapa del tornillo, ya que eso conducirá a una fuga.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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