Identificación de mutaciones por fusión de alta resolución en una población de arroz
2 de septiembre de 2019
En este artículo, presentamos el protocolo que se describe como análisis de fusión de alta resolución (HRM) basado en lesiones locales inducidas por objetivos en genomas (TILLING). Este método utiliza cambios de fluorescencia durante la fusión del dúplex de ADN y es adecuado para el cribado de alto rendimiento tanto de inserción/eliminación (Indel) como de substición de base única (SBS).
Sería muy útil para la reproducción de rasgos que son técnicamente difíciles o costosos de determinar, como la resistencia a enfermedades, el contenido mineral. Es una técnica bastante simple, rentable y de alto rendimiento. Para comenzar, coloque cuatro discos de hoja en cada pozo de una placa PCR de 96 pozos.
Agregue 50 mililitros de buffer Una solución en cada pozo. Congele la placa en un congelador de menos 80 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, descongele la placa a temperatura ambiente.
Incubar a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Agregue 50 microlitros de tampón B a cada pozo, y mezcle bien por vórtice. Centrifugar la placa durante un minuto a 1.500 veces g.
Recoger el sobrenadante como ADN para PCR. En primer lugar, utilice el sobrenadante de ADN de una plantilla de PCR para optimizar la temperatura de recocido. Agregue reactivos y un microlitro de sobrenadante de ADN en cada pozo de PCR.
Coloque los tubos PCR en un bloque térmico con capacidad de gradiente y ajuste el programa de calentamiento de acuerdo con el manuscrito para determinar la temperatura de recocido óptima para cada fragmento de destino. Realizar electroforesis para el producto PCR en geles de 1% de agarosa para examinar los amplicons. Determine la temperatura de recocido óptima que permite la amplificación específica del fragmento de destino.
Para realizar análisis de HRM, combine reactivos, incluyendo un microlitro de 10 veces tinte de fluorescencia y un microlitro del sobrenadante de ADN en cada pozo de placas compatibles con HRM. En cada placa, incluya una muestra parentesca de tipo salvaje y un control negativo sin ADN. Añadir una gota de aceite mineral a cada pozo para evitar la evaporación.
A continuación, selle la placa con película adhesiva y centrífuga a 1.000 g durante un minuto. Ejecute el PCR utilizando la temperatura de recocido optimizada. Ahora, retire la película adhesiva de la placa e inserte la placa en una máquina HRM.
En el software, seleccione Nueva ejecución en el menú de archivos o pulse el botón Ejecutar en la parte superior de la pantalla. Especifique las temperaturas inicial y final de la fusión de 55 a 95 grados centígrados. Seleccione muestras para el análisis de fusión de alta resolución y excluya muestras similares al control negativo.
Normalice las curvas de fusión para tener la misma fluorescencia inicial y final. Confirme visualmente que los cursores de temperatura máxima mínima y inferior inferior están en una región de las curvas. Mantenga el delta F, diferencia de fluorescencia, nivel en el valor predeterminado de 05.
En la lista Selección de normas, seleccione la variante común frente a la y elija la sensibilidad normal. Seleccione H12 para utilizar el tipo comodín como control. Las muestras con un valor delta F mayor que 05 se consideran que contienen plantas mutantes.
Luego, usando un método CTAB, extrae ADN de cada una de las cuatro plantas de la piscina mutante con la curva de fusión significativamente diferente del tipo salvaje. Después de la cuantificación utilizando un espectrofotómetro, ajuste el ADN con el NanoDrop 2000 a una concentración final de aproximadamente 25 nanogramos por microlitro. Agregue 0,4 microlitros de imprimadores pcR a la muestra de ADN en los tubos de PCR, colóquelos en un ciclor térmico y ajuste el programa para amplificar el fragmento objetivo.
A continuación, envíe los productos de PCR a una empresa para su secuenciación. Después de la secuenciación de Sanger, compare la lesión molecular comparando las secuencias entre la planta M2 y el tipo silvestre. En este estudio, la exploración de HRM y el análisis de plántulas M2 para mutaciones en genes OsLCT1 o SPDT mostraron que la mayoría de las muestras tenían curvas de fusión no significativamente diferentes del tipo salvaje con delta F inferior a 05.
Los mutantes mostraron curvas HRM significativamente diferentes con F delta mayor que 05 a temperaturas de 90 a 92 grados Celsius y 81.5 a 83.5 grados Celsius, respectivamente. El tipo de mutación y la posición en los genes de 4, 560 M2 plántulas fueron confirmadas por los cromatogramas de secuenciación. Se identificó un sitio heterocigoto con una mutación de G a A en 4. 304 pares base de OsLCT1.
Una sola inserción de nucleótido A apareció en los 4. 240 pares base de OsLCT1, y se observó una eliminación de trinucleótidos TTC en la posición de 5, 948 a 5, 950 pares base de SPDT. Optimización del PCR antes del análisis de HRM. El tinte en el gel es un poco dañino.
Recuerde ponerse guantes al ejecutar el gel.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para el análisis de fusión de alta resolución (HRM) basado en la técnica Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). Este método es eficaz para la selección de alto rendimiento de mutaciones por inserción/eliminación (Indel) y sustitución de una sola base (SBS).
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genómica
- Mejoramiento Vegetal
- Biología Molecular
Antecedentes
- El análisis de fusión de alta resolución es una técnica utilizada para detectar variaciones genéticas.
- TILLING permite la identificación de mutaciones de manera rentable.
- Este método es particularmente útil para rasgos que son difíciles de evaluar.
- Puede aplicarse en diversos campos, incluyendo la agricultura y la genética.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo para el uso de HRM en TILLING.
- Facilitar la selección de alto rendimiento de variaciones genéticas.
- Mejorar la eficiencia en la identificación de mutaciones relacionadas con rasgos importantes.
Métodos Utilizados
- Preparación de discos foliares en una placa PCR de 96 pocillos.
- Aplicación de la solución tampón A a cada pocillo.
- Congelación y descongelación de la placa PCR para preparar las muestras.
- Monitoreo de los cambios de fluorescencia durante la fusión del ADN.
Resultados principales
- El protocolo permite la detección eficaz de Indels y SBS.
- La capacidad de alto rendimiento mejora la eficiencia del cribado.
- Método rentable adecuado para diversas aplicaciones de investigación.
- Facilita la mejora genética para rasgos como la resistencia a enfermedades.
Conclusiones
- El TILLING basado en HRM es una herramienta valiosa en la investigación genética.
- El método simplifica el proceso de identificación de mutaciones.
- Puede contribuir significativamente al desarrollo de variedades vegetales mejoradas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El TILLING basado en la fusión de alta resolución (HRM) permite la detección de alto rendimiento y rentable de sustituciones de una sola base e inserciones/eliminaciones de mutaciones en genomas vegetales. Este enfoque apoya la validación temprana de objetivos al proporcionar datos cuantitativos de cribado de mutaciones que informan las decisiones de mejoramiento para caracteres complejos como la resistencia a enfermedades y el contenido de nutrientes. Su integración con la extracción simple de ADN mejora la eficiencia del flujo de trabajo en las líneas de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de mutaciones inducidas en genes diana como OsLCT1 y SPDT.
- Valor operativo: Utiliza el análisis HRM tras la PCR sin procesamiento adicional, lo que reduce el tiempo de manipulación y aumenta el rendimiento.
- Valor predictivo: Valores de Delta F superiores a 0,5 identifican muestras mutantes, lo que facilita la selección confiable de aciertos para la validación posterior.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para el ensayo: Las placas compatibles con HRM con recubrimiento de aceite mineral previenen la evaporación y aseguran la adquisición reproducible de curvas de fusión.
- Resultado cuantitativo: Las curvas de fusión normalizadas y las mediciones de delta F permiten la comparación objetiva entre muestras de tipo silvestre y variantes.
- Escalabilidad: El formato de placa de 96 pocillos permite el cribado de miles de plántulas M2, como se ha demostrado con 4.560 muestras.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Las mutaciones confirmadas mediante secuenciación Sanger proporcionan datos sobre lesiones moleculares que vinculan el genotipo con el fenotipo en programas de mejoramiento.
- Alineación de Biomarcadores: Los SNPs y las inserciones/deleciones identificados sirven como marcadores detectables para la asociación de rasgos en la mejora de cultivos.
- Reducción de Riesgos: La detección temprana de mutaciones reduce la incertidumbre sobre la herencia de rasgos antes de los ensayos de campo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
HRM-TILLING se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir la detección de mutaciones tras la mutagénesis y antes de la validación fenotípica, apoyando la identificación de candidatos prometedores en la biotecnología agrícola.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la identificación de variantes alélicas en genes diana a través de un análisis sensible de curvas de desnaturalización.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos de HRM reproducibles que estandarizan la detección de mutaciones en grandes poblaciones.
- Análisis: El umbral de Delta F (>0,5) ofrece una base estadística para distinguir muestras mutantes de las de tipo silvestre.
- Investigación Traducional: Las mutaciones confirmadas mediante secuenciación permiten la correlación genotipo-fenotipo para tomar decisiones de cría vinculadas a caracteres específicos.
- Reutilización Empresarial: El protocolo es adaptable a diferentes genes diana y especies de cultivos más allá del arroz, lo que promueve la reutilización de la plataforma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Detecta tanto SNPs como indels con alta sensibilidad, reduciendo los falsos negativos en el cribado de mutaciones.
- Valor operativo: La extracción de ADN simple, segura y rápida (SSF) combinada con HRM minimiza el uso de reactivos y la necesidad de equipos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más rápidas de avance o descarte en programas de mejora genética mediante la identificación rápida de variantes alélicas útiles.
- Impacto en la cartera: Mejora la confianza al avanzar líneas con mutaciones validadas, reduciendo el riesgo de fracaso en etapas tardías.
Consideraciones de Implementación
- Requiere familiaridad con la configuración del instrumento de HRM y la normalización de la curva de desnaturalización.
- Necesita acceso a termocicladores con gradiente para la optimización de la temperatura de hibridación.
- Depende de placas compatibles con HRM y colorantes fluorescentes para un análisis de fusión preciso.
- Requiere capacidad de secuenciación para confirmar las mutaciones identificadas mediante HRM.
- El rendimiento puede variar según la longitud del amplicón y su contenido de GC, lo que requiere una optimización específica para cada diana.
