Extracción de cortisol de las matrices de aleta de esturión y mandíbula
10 de septiembre de 2019
En este estudio, presentamos un protocolo para la extracción de cortisol de la aleta y la mandíbula de las especies de esturión. Los niveles de cortisol de aleta y mandíbula se examinaron más adelante comparando dos disolventes de lavado seguidos de ensayos ELISA. Este estudio pilotó la viabilidad del cortisol maxilar como un indicador de estrés novedoso.
Nuestro método introduce un nuevo indicador de estrés alternativo que podría ser una plataforma para numerosos estudios futuros para medir el cortisol en nuevas matrices no gráficas y capilares. Las ventajas de esta técnica son su simplicidad y su capacidad para ser utilizado para evaluar los niveles de estrés incluso en animales sacrificados. Establecer una relación entre los altos niveles de cortisol y animales sanos o humanos que utilizan esta técnica puede ayudar con el diagnóstico de algunas enfermedades.
Este método también se puede utilizar para estudiar muestras biológicas centenarias como estos fósiles antiguos para evaluar los niveles de estrés dentro de la vida útil de la muestra. Para la extracción de cortisol, pesar 300 más o menos 10 miligramos de cada muestra en una escala analítica digital con una precisión de 0.0001 antes de colocar las muestras en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Añadir tres mililitros de isopropanol a cada tubo de muestra y girar los tubos a 80 rotaciones por minuto durante 2,5 minutos para lavar el cortisol y eliminar cualquier posible contaminación externa.
Después del último lavado, seque al aire las muestras a temperatura ambiente durante siete días antes de lavar las muestras tres veces más, como se ha demostrado con agua fresca ultra pura para cada lavado. Pesar 75 más o menos cinco miligramos de aleta seca o muestra de mandíbula y utilizar un batidor de cuentas para finalmente moler la muestra a 50 hercios durante 32 minutos. A continuación, entregue 1,5 mililitros de metanol a cada tubo de aleta en polvo o mandíbula y coloque las muestras en un rotador de tubo a 40 rotaciones por minuto durante 18 horas a temperatura ambiente.
Después de la extracción de cortisol, sedimentar los tejidos de la muestra por centrifugación. Y transfiera el primer mililitro del cortisol orgánico amarillento que contiene la capa de cada muestra a tubos micro-centrifugados individuales de 1,5 mililitros. Seque las muestras de cortisol a 38 grados centígrados en una campana de humo durante la noche para evaporar el metanol.
A la mañana siguiente, añadir 400 microlitros de PBS a cada tubo y vórtice y centrifugar las muestras para recoger el cortisol. Para el análisis ELISA, cargue 25 microlitros de cada muestra de cortisol estándar extraída y controle por duplicado en los pozos apropiados de una placa ELISA de 96 pozos. Cargue 25 microlitros de diluyente de ensayo en dos pozos para servir como cero y en cada pozo de unión no específico.
Mezclar 15 microlitros de conjugado enzimático con 24 mililitros de diluyente de ensayo y añadir 200 microlitros de conjugado a cada pozo. Mezcle la placa en un rotador durante cinco minutos a 500 rotaciones por minuto. Seguido de una incubación de una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave la placa cuatro veces con 300 microlitros de 1x Wash Buffer por pozo. Invertir rápidamente el plato sobre el fregadero después de cada lavado para desechar el tampón e hinchar el plato en una pila de toallas de papel. Después del último lavado, agregue 200 microlitros de solución de sustrato TMB a cada pozo y coloque la placa en el rotador durante cinco minutos a 500 rotaciones por minuto.
Después de mezclar, incubar el plato durante 25 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Al final de la incubación, añadir 50 microlitros de solución de parada a cada pocótulo. Y mezcle el contenido de la placa en el rotador durante tres minutos a 500 rotaciones por minuto o hasta que todos los pozos hayan cambiado de verde a amarillo.
A continuación, lea la densidad óptica de las muestras y utilice el software de microplaca para convertir los niveles de cortisol en cada muestra en picogramas por miligramo. En este análisis representativo, los niveles de cortisol tendían a ser más altos en muestras de aleta lavadas con isopropanol que en las lavadas con agua, pero no se observaron diferencias significativas en los niveles de cortisol de aleta entre las especies de esturión. No hubo una interacción significativa entre los disolventes de lavado y las especies de esturión.
El examen de cortisol de H.Huso jawbones para determinar si los maxilares de esturión podrían utilizarse como una matriz alternativa a las aletas reveló que el disolvente de lavado no tuvo ningún efecto significativo en el nivel de cortisol medido en el esturión de H.Huso. Además, los datos revelaron una alta similitud entre las aletas de tres especies de esturión probadas y en las mandíbulas H.Huso. Es importante utilizar el batidor de cuentas para moler las muestras en polvo fino y utilizar un kit de ensayo ELISA comercial adecuado para una medición exitosa de cortisol.
Este método también se puede utilizar para detectar cortisol en dientes y otras matrices duras, ya que las mediciones de nivel de cortisol proporcionan información importante sobre cómo el medio ambiente afecta a la biología animal. El método podría utilizarse como un nuevo enfoque para evaluar los niveles de cortisol en los dientes de leche infantiles y en la endocrinología pediátrica, la biología psicópata, el comportamiento, el arqueológico y los estudios forenses.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para la extracción de cortisol de la aleta y el hueso maxilar de especies de esturión, examinando la eficacia de dos disolventes de lavado seguidos de ensayos ELISA. La investigación destaca el potencial del cortisol óseo maxilar como un nuevo indicador de estrés.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
Antecedentes
- El cortisol es una hormona clave del estrés.
- Los métodos tradicionales para medir el cortisol pueden ser invasivos.
- Explorar matrices alternativas para la medición del cortisol es esencial.
- El cortisol en el hueso maxilar no ha sido ampliamente estudiado como indicador de estrés.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la extracción de cortisol de aleta y hueso mandibular de esturión.
- Evaluar la viabilidad del cortisol en el hueso mandibular como indicador de estrés.
- Comparar la eficacia de diferentes solventes de lavado en la extracción de cortisol.
Métodos Utilizados
- Se recogieron muestras de aleta y hueso de la mandíbula de especies de esturión.
- La extracción de cortisol implicó pesar las muestras y utilizar isopropanol como disolvente de lavado.
- Se realizaron ensayos de ELISA para medir los niveles de cortisol.
- Se llevó a cabo un análisis comparativo de los disolventes de lavado.
Resultados principales
- Se extrajeron y midieron con éxito los niveles de cortisol en el hueso maxilar.
- Diferentes solventes de lavado mostraron eficacia variable en la extracción de cortisol.
- El estudio respalda el potencial del cortisol en el hueso maxilar como indicador de estrés.
- Este método podría facilitar investigaciones futuras sobre el estrés en diversas muestras biológicas.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado es un método sencillo y eficaz para la extracción de cortisol.
- El cortisol en el hueso maxilar puede servir como un indicador confiable del estrés en la investigación.
- Esta técnica abre nuevas vías para estudiar el estrés en muestras biológicas contemporáneas y antiguas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este estudio establece un protocolo no invasivo para la extracción de cortisol a partir de matrices de aleta y hueso mandibular de esturión, ofreciendo un nuevo indicador de estrés para investigaciones preclínicas y traslacionales. El método permite la evaluación de biomarcadores de estrés en muestras archivadas y procedentes de sacrificio, apoyando estudios longitudinales y entre especies. Su simplicidad y adaptabilidad a tejidos duros brindan un valor estratégico para reducir riesgos en la validación de dianas dentro de las líneas de descubrimiento neuroendocrino y conductual.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las vías de respuesta al estrés mediante el cortisol como biomarcador funcional en modelos de vertebrados.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo reproducible de extracción para tejidos de aleta y hueso mandibular mediante lavados con disolventes estandarizados y homogenización con perlas.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo en dianas al correlacionar los niveles de cortisol con estados fenotípicos de estrés en modelos preclínicos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera resultados cuantitativos de cortisol mediante ELISA, compatibles con la selección de alto rendimiento de moduladores ambientales o genéticos.
- Valor operativo: Muestra baja variabilidad intra- e interensayos (CV de 14,15 % y 7,70 %), lo que garantiza la fiabilidad del ensayo en campañas de cribado de compuestos.
- Escalabilidad: Utiliza una masa mínima de muestra (300 ± 10 mg) y equipo de laboratorio estándar, lo que permite su adaptación a formatos de múltiples pocillos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: El cortisol en el hueso maxilar muestra potencial como biomarcador cruzado entre matrices, lo que permite la correlación entre las respuestas al estrés en tejidos de aleta y esqueléticos.
- Relevancia del Modelo Preclínico: Aplicable a modelos de pez cebra, roedores y otros vertebrados en los que sean accesibles las matrices de aletas o huesos craneales.
- Utilidad en Muestras de Archivo: Permite el análisis de biomarcadores de estrés en muestras históricas o fosilizadas, apoyando estudios de toxicología evolutiva y del desarrollo.
Integración de la Canalización y del Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al proporcionar una lectura de biomarcadores de estrés que informa sobre la interacción con el blanco y los resultados de cribados fenotípicos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la prueba de hipótesis sobre dianas neuroendocrinas mediante la cuantificación del cortisol como efector descendente de la modulación del eje HPA.
- Tamizaje: Proporciona mediciones de cortisol compatibles con ELISA, permitiendo el análisis de respuesta frente a dosis en bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Genera concentraciones de cortisol (pg/mg) adecuadas para comparaciones estadísticas entre grupos de tratamiento mediante modelos GLM o similares.
- Investigación Traducional: Sostiene la continuidad del biomarcador desde muestras de descubrimiento hasta tejidos preclínicos mediante validación cruzada en matriz de aleta y hueso mandibular.
- Reutilización Empresarial: El protocolo requiere pocos reactivos y equipos, lo que permite su estandarización entre distintos centros para programas multiestudio de biomarcadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas relacionadas con el estrés al proporcionar mediciones directas de hormonas.
- Valor operativo: Utiliza disolventes accesibles (agua, isopropanol, metanol) y equipos de laboratorio estándar (centrífuga, rotador, lector de ELISA).
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más tempranas de avance o interrupción al identificar fenotipos de estrés vinculados a la diana antes de realizar ensayos funcionales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas que demuestran modulación de la respuesta de cortisol in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la homogenización de tejidos, extracción basada en disolventes y realización de ensayos ELISA.
- Depende del acceso a una centrífuga, un rotador de tubos, un homogenizador de bolas y un lector de microplacas con control de temperatura.
- Necesita la estandarización de la elección del disolvente de lavado y de la duración del secado entre laboratorios para permitir la comparabilidad entre estudios.
- La adaptación a otras especies o tejidos puede requerir la optimización de la masa de la muestra y del tiempo de extracción.
- Está limitado por la especificidad del anticuerpo en el ELISA y por posibles efectos de matriz en muestras altamente mineralizadas, como el hueso maxilar.
