Un ensayo robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X mental retardado-1

Este método rentable puede encontrar amplias aplicaciones en el diagnóstico molecular y la detección de FXS y trastornos relacionados con la X frágil. Es rápido en tiempo de entrega y menos inversión en equipos. Nuestro ensayo basado en PCR puede facilitar la clasificación del espectro completo del FXS y los trastornos asociados a X frágil, incluyendo la mutación intermedia, premutación y completa con robustez y tiempo de notificación rápido.

El procedimiento será demostrado por Weng Chua de PerkinElmer Singapur. Comience eliminando la mezcla de tampón de PCR, el diluyente de muestra y las muestras de ADN del congelador celsius de 20 grados, y dejándolas a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos para descongelarlas. Antes de usar los reactivos, el vórtice y girarlos brevemente hacia abajo.

Mida la concentración de la muestra de ADN con un espectrofotómetro y, si es necesario, diluya a 25 nanogramos por microlitro con diluyente de muestra. Etiquete los pozos de una placa PCR para identificar muestras de ADN de referencia y probadas y calcular el número de reacciones necesarias para las muestras de prueba, referencia y control negativo. Prepare la mezcla maestra de PCR combinando 15 microlitros de mezcla de tampón PCR a 0,6 microlitros de diluyente de muestra y 0,4 microlitros de polimerasa para cada reacción.

Haz un vórtice la mezcla y gílala hacia abajo. A continuación, dispensar 18 microlitros de la mezcla en cada pozo. A continuación, pipetee dos microlitros de cada ADN en el pozo apropiado.

Mezcle los reactivos pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces, luego selle la placa. Coloque la placa en el termociclador y ejecute la PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Precaliente la coctelera a 65 grados Centígrados y añada 80 microlitros de 1X Tampón TE a cada producto PCR.

Utilice una pipeta multicanal para transferir las muestras a una placa de limpieza de PCR y coloque la placa en la coctelera. Incubarlo a 65 grados centígrados mientras agita a 1200 RPM durante 10 minutos. Después de la incubación, enfríe la coctelera hasta 25 grados Celsius, ajuste el instrumento de vacío a 250 milibares y aspire la solución a través del filtro.

Después de 15 minutos, los pozos no deben tener líquido restante. Apague la aspiradora y añada 50 microlitros de búfer 1X TE a cada pozo. Aspirar la solución durante 10 minutos utilizando los ajustes de vacío anteriores.

Seque la parte inferior de la placa de filtro presionando firmemente en una pila de toallas de papel y luego agregue 20 microlitros de 1X TE tampón al centro inferior de cada pozo. Coloque la placa en la coctelera e incubar a 25 grados Centígrados mientras agita a 1200 RPM durante cinco minutos. Después de la incubación, transfiera al menos 15 microlitros del producto PCR purificado a una placa PCR fresca de 96 pocillos.

Antes de comenzar, lleve el concentrado de tinte de ADN, la matriz de gel de ADN, el marcador de ADN, la escalera de ADN y las muestras de ADN purificado a temperatura ambiente. Configure la estación de cebado reemplazando la jeringa y ajustando la placa base, luego suelte la palanca del clip de la jeringa y deslícela a la posición superior. Inicie el software de dimensionamiento y prepare la mezcla de tinte de gel.

Vórtice el concentrado de tinte durante 10 segundos, luego gírtelo hacia abajo. A continuación, añadir 25 microlitros del tinte a un vial de matriz de gel y vórtice la solución para mezclar. Transfiera la mezcla de tinte de gel a un filtro de centrifugado, colóquela en la centrífuga y gírquela durante 10 minutos a 1500 g.

Cuando esté listo para cargar la mezcla de tinte de gel, inserte un nuevo chip de ADN en la estación de cebado y agregue nueve microlitros de la mezcla de tinte de gel en el pozo que está marcado con G.Cierre la estación de cebado y asegúrese de que el émbolo esté colocado en la marca de un mililitro. Presione el émbolo de la jeringa hacia abajo hasta que quede presionado por el clip. Espere exactamente 30 segundos y, a continuación, suelte el clip.

Espere cinco segundos más y, a continuación, tire lentamente del émbolo de vuelta a la posición de un mililitro. Abra la estación de cebado y agregue nueve microlitros de mezcla de colorante de gel en los pozos marcados con G.Add cinco microlitros de marcador en el bien marcado con un símbolo de escalera y cada uno de los 12 pozos de muestra. Agregue un microlitro de la escalera al pozo con el símbolo de escalera y un microlitro del producto PCR o agua a los pozos de muestra.

Vórtice el chip durante un minuto a 2400 RPM. Insértelo en el bioanalizador y ejecute el chip en cinco minutos. Una vez completada la ejecución, exporte los datos de pico como archivos de tabla csv.

Una muestra femenina de premutación y una muestra femenina de mutación completa se utilizan como muestras de referencia. Un pico de marcador superior e inferior se incluyen en el perfil de tamaño del fragmento, y por lo general hay un pico complejo de imprimación en unos 95 pares base. Estas muestras de referencia se utilizan para construir una curva estándar de regresión.

A continuación, la curva estándar de regresión lineal se utiliza para calcular tamaños de repetición de muestras desconocidas. Las muestras clínicas normales, intermedias, de premutación, de mutación completa y de mutación completa del mosaico se pueden clasificar correctamente con este método. En algunos casos, sólo se muestra un pico en los resultados de la electroforesis microfluídica, que es probable debido a la presencia de alelos homocigotos normales.

Un tipo de resultado subóptimo es el sesgo de línea base, que puede ser ambiguo o poco interpretable, y se sospecha que es causado por un mal funcionamiento del instrumento. Al intentar este procedimiento, es importante asegurar la cantidad adecuada de ADN y calidad antes de iniciar el protocolo. La secuenciación del gen FMR1 se puede realizar para identificar el patrón de interrupción de AGG.

Y la enzima de restricción sensible a la metilación o el ensayo de modificación de bisulfuro se pueden utilizar para monitorear el estado de metilación. Esta es una técnica rápida, robusta y rentable. Ayudará a otros investigadores a realizar un estudio basado en la población sobre el estado portador de FXS y trastornos asociados a X frágiles.