Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

Este protocolo es significativo porque se puede utilizar para crear xenoinjertos musculares esqueléticos humanos, que se pueden utilizar para modelar la enfermedad muscular y para llevar a cabo pruebas terapéuticas preclínicas. Este modelo de xenoinjerto permite a los investigadores estudiar el músculo humano in vivo para entender mejor la biología de las células musculares humanas y desarrollar modelos novedosos para enfermedades musculares raras o adquiridas. Después de obtener una biopsia muscular humana, coloque la muestra en una placa Petri de 100 por 15 milímetros que contenga un medio muscular, y use un microscopio estéreo y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier fascia o tejido graso restante.

Disecciona la biopsia muscular en trozos de aproximadamente siete por tres por tres milímetros, teniendo cuidado de que las fibras estén dispuestas longitudinalmente dentro de la muestra. A continuación, transfiera el plato de Petri que contiene el músculo diseccionado sobre hielo, y coloque suturas sintéticas no absorbibles en un plato Petri de 100 por 15 milímetros de 70% etanol. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón NOD-Rag-gamma anestesiado de ocho a 12 semanas de edad, aplique un ung ón en los ojos del animal inmunodeficient, y use una recortadora para eliminar el vello que hace sobreladura del tibialis anterior desde el tobillo hasta la rodilla.

A continuación, aplicar crema depilatoria sobre la piel expuesta durante un minuto antes de desinfectar el sitio quirúrgico con solución de povidona-yodo y 70%etanol. Para injertar el tejido humano, primero cinta adhesiva por la pierna del ratón, y hacer una incisión recta sobre los tibialis anteriores originados en los tendones distales y terminando por debajo de la rodilla. Usa una disección contundente para separar la piel del tejido muscular, y usa tijeras para hacer una incisión de menos de 0,5 milímetros a través del epimysium del músculo anterior tibialis, comenzando en el tendón y terminando en la rodilla.

Después de cortar el tendón distal del tibialis anterior, agarre el tendón con fórceps de iris, y tire del músculo hacia arriba hacia la rodilla. A continuación, corta el tendón distal del extensor digitorum longus, y tira del digitorum extensor largo hacia la rodilla. Una vez que el tendón proximal del músculo peroneus longus es visible, retire el digitorum longus extensor y el tibialis anterior con las tijeras.

Use una toallita quirúrgica húmeda con PBS para aplicar una ligera presión hasta que se logre la hemostasia, y enhebrar una sutura a través del tendón peruso peroneus proximal, dejando un trozo de hilo de aproximadamente 1,5 pulgadas a cada lado del tendón. Haga la primera mitad de un nudo cuadrado quirúrgico de dos manos sin apretar para formar un círculo, y coloque un xenoinjerto en el círculo, apretando el lazo para asegurar el tejido del injerto. Completa la otra mitad del nudo cuadrado para suturar el xenoinjerto al tendón proximal del peroneus longus, y enhebra la sutura a través del tendón del peroneus longus distal para repetir la técnica del nudo cuadrado en el tendón distal.

Cuando ambos extremos del injerto se hayan asegurado, tire de la piel sobre el músculo xenoinjertado, selle la incisión con pegamento quirúrgico y coloque de dos a tres grapas quirúrgicas sobre el pegamento. A continuación, coloque el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla calentada con monitoreo hasta la reclinación completa. De cuatro a seis meses después de la cirugía, coloque un vaso de precipitados cubierto que contenga 200 mililitros de 2-metilbutano en una caja de hielo seco durante al menos 30 minutos antes de la cosecha de xenoinjerto.

Cuando el 2-metilbutano se ha enfriado, confirmar una falta de respuesta a la pellizca del dedo del pie, y eliminar el pelo que sobrevía el tibialis anterior desde el tobillo hasta la rodilla con un recortador y crema depilatoria. Las suturas que sostienen el xenoinjerto en su lugar deben observarse a través de la piel. Asegure la pierna con cinta adhesiva y use tijeras y fórceps de iris para abrir la piel sobre el xenoinjerto hasta que ambas suturas estén descubiertas.

Usa un bisturí para cortar entre el xenoinjerto y la tibia para liberar un lado del xenoinjerto antes de cortar entre el músculo peroneus longus y el músculo gastrocnemius. Cortar por debajo de la sutura distal y a través del tendón distal del peroneus longus, y utilizar los fórceps del iris para agarrar y desviar la sutura hacia la rodilla mientras se utilizan tijeras para cortar el xenoinjerto lejos del tejido muscular subyacente. Luego, usa tijeras para cortar por encima de la sutura proximal para eliminar el xenoinjerto y el peroneus longus, y coloca el espécimen cosechado en un pequeño pedazo de cartón.

Ancle el tejido lo más cerca posible de las suturas mientras estira suavemente el músculo para asegurarse de que la orientación de la fibra se mantendrá durante el proceso de congelación a presión. Cuando los pasadores estén bien en su lugar, deslice el músculo hacia arriba de los pasadores para que el tejido descanse justo por encima del cartón, y congele el xenoinjerto en el 2-metilbutano preenfriado para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius. Un xenoinjerto exitoso demuestra una regeneración robusta de miofibers humanos identificados con anticuerpos específicos para el ser humano.

La tinción positiva de miosina embrionaria dentro de una proporción de miofibers indica que el proceso de regeneración todavía está en curso. Por el contrario, una mala técnica quirúrgica o una muestra inadecuada pueden conducir a una mala regeneración de las fibras musculares. Los xenoinjertos realizados a partir de un paciente diagnosticado con una miopatía inflamatoria idiopática presentan un número moderado de miofibras humanas regeneradas en colecciones de cuatro y seis meses, y la tinción de miosina embrionaria persiste a los seis meses.

Las células inflamatorias también están presentes dentro del xenoinjerto, como se observa en la tinción H y E. Los tamaños individuales de miofiber son similares entre cuatro y seis meses en xenoinjertos de miopatía inflamatoria idiopática. Se observan fibras raras que muestran un área transversal superior a 3.500 micrómetros cuadrados dentro de los xenoinjertos, pero no en las biopsias de miopatía inflamatoria idiopática, lo que indica que algunas de las miofiberas de los xenografos pueden regenerarse a una zona transversal similar en tamaño a miofibers saludables.

Las partes más importantes de este procedimiento son identificar todos los tendones en el tobillo después de que se realiza la incisión inicial y cortar con éxito a través del epimysium. La competencia funcional de los xenoinjertos se puede evaluar aislando enzimáticamente miofibras individuales y probando transitorios de calcio o realizando mediciones forzadas evocadas después de la estimulación eléctrica.