Name: Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprende a realizar xenoinjertos de músculo esquelético humano en ratones inmunodeficientes NRG para modelar enfermedades musculares y evaluar terapias preclínicamente. Este método permite estudiar la biología muscular humana in vivo con regeneración robusta.

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Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Myositis y la Fundación Peter Buck. Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Yuanfan Zhang por compartir su experiencia y formación en la técnica quirúrgica de xenoinjerto.

<ol><li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. 0, 1-14 (2018).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los xenoinjertos derivados del paciente son una forma innovadora de modelar la enfermedad muscular y llevar a cabo estudios preclínicos. El método descrito aquí para crear xenoinjertos musculares esqueléticos es rápido, sencillo y reproducible. Las cirugías unilaterales se pueden realizar en 15 a 25 minutos, o bilateralmente en 30 a 40 minutos. Los xenoinjertos bilaterales pueden proporcionar flexibilidad experimental adicional. Por ejemplo, los investigadores pueden realizar un tratamiento localizado de un xenoinjerto, ...

Se ha informado que sólo 13.8% de todos los programas de desarrollo de fármacos sometidos a ensayos clínicos son exitosos y conducen a terapias aprobadas1. Si bien esta tasa de éxito es superior al 10,4% reportado anteriormente2, todavía hay un margen significativo de mejora. Un enfoque para aumentar la tasa de éxito de los ensayos clínicos es mejorar los modelos de laboratorio utilizados en la investigación preclínica. La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) requiere estudios en animales para mostrar la eficacia del tratamiento y evaluar la toxicidad antes de los ensayos clínicos de fase 1. Sin embargo, a menudo hay una concordancia limitada en los resultados del tratamiento entre los estudios en animales y los ensayos clínicos3. Además, la necesidad de estudios preclínicos en animales puede ser una barrera insuperable para el desarrollo terapéutico en enfermedades que carecen de un modelo animal aceptado, que a menudo es el caso de enfermedades raras o esporádicas.
Una forma de modelar enfermedades humanas es trasplantando tejido humano en ratones inmunodeficientes para generar xenoinjertos. Hay tres ventajas clave para los modelos de xenoinjerto: en primer lugar, pueden recapitular las complejas anomalías genéticas y epigenéticas que existen en la enfermedad humana que pueden nunca ser reproducibles en otros modelos animales. En segundo lugar, los xenoinjertos se pueden utilizar para modelar enfermedades raras o esporádicas si hay muestras de pacientes disponibles. En tercer lugar, los xenoinjertos modelan la enfermedad dentro de un sistema in vivo completo. Por estas razones, hipotetizar que los resultados de eficacia del tratamiento en modelos de xenoinjerto son más propensos a traducirse en ensayos en pacientes. Los xenoinjertos tumorales humanos ya se han utilizado con éxito para desarrollar tratamientos para cánceres comunes, incluyendo mieloma múltiple, así como terapias personalizadas para pacientes individuales4,5,6, 7.
Recientemente, xenoinjertos se han utilizado para desarrollar un modelo de enfermedad muscular humana8. En este modelo, las muestras de biopsia muscular humana se trasplantan en las extremidades posteriores de ratones NRG inmunodeficientes para formar xenoinjertos. Las miofibers humanas trasplantadas mueren, pero las células madre musculares humanas presentes en el xenoinjerto posteriormente se expanden y diferencian en nuevas miofibers humanas que repoblan la lámina basal humana injertada. Por lo tanto, las miofibers regeneradas en estos xenoinjertos son completamente humanas y son espontáneamente revascularizadas e inervadas por el huésped del ratón. Es importante destacar que el tejido muscular del paciente trasplantado en ratones recapitula las características clave de la enfermedad humana, a saber, la expresión del factor de transcripción DUX4 8. La FSHD es causada por la sobreexpresión de DUX4, que se silencia epigenéticamente en el tejido muscular normal9,10. En el modelo de xenoinjerto FSHD, se ha demostrado que el tratamiento con un mortorfino específico de DUX4 reprime con éxito la expresión y la función de DUX4, y puede ser una opción terapéutica potencial para los pacientes con FSHD11. Estos resultados demuestran que los xenoinjertos musculares humanos son un nuevo enfoque para modelar la enfermedad muscular humana y probar posibles terapias en ratones. Aquí, describimos en detalle el método quirúrgico para crear xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Fisher</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcubreobjetos de 20 mm x 30 mm</td><td>VWR</td><td>48393-151</td><td></td></tr><tr><td>Báscula de pesaje animal</td><td>Kent Scientific</td><td>SCL- 1015</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Corning, Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sistema AutoClip</td><td>F.S.T</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Portagujas</td><td>F.S.T</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de embrión de pollo</td><td>Preciso</td><td>CE650TL</td><td></td></tr><tr><td>CM1860 Criostato UV Leica</td><td>Biosystems</td><td>CM1860UV</td><td></td></tr><tr><td>Tarro de tinción Coplin</td><td>Thermo Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Pasadores de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13976</td><td></td></tr><tr><td>Hielo seco - pellet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9584462</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de miosina embrionaria</td><td>DSHB</td><td>F1.652</td><td>concentración recomendada 1:10</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td> GE <td>Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Fibra Lite MI-150</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Mi-150</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>F.S.T</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG1, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td> concentración <td>recomendada 1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG2b, AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21145</td> concentración <td>recomendada 1:500</td></tr><tr><td>Goma tragacanto</td><td>Sigma</td><td>G1128</td><td></td></tr><tr><td>Jamones F-10 Medium</td><td>Corning</td><td>10-070-CV</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl Blue Adhesivo Tópico para la Piel</td><td>Sellado de tejidos</td><td>TS1050044FP</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo A/C lamina específico para humanos</td><td>Abcam</td><td>ab40567</td><td>Concentración recomendada 1:50-1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo específico para humanos Spectrin</td><td>Leica Biosystems NCLSPEC1</td><td></td><td>concentración recomendada 1:20-1:100</td></tr><tr><td>Cámara de inducción</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de iris</td><td>F.S.T</td><td>11066-07</td><td></td></tr><tr><td>Irradiada Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td><td>Envigo</td><td>TD.06596</td><td>Dieta antibiótica para roedores para proteger contra las infecciones respiratorias</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>toallitas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Mapleson E Breathing Circuit</td><td>VetEquip</td><td>921412</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia móvil</td><td>VetEquip</td><td>901805</td><td></td></tr> ratón <tr><td>en ratón Kit básico</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>ratón Reactivo de bloqueo IgG</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NAIR Loción/aceite removedor de vello</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Ratones NOD-Rag1null IL2rg null (NRG)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>007799</td><td>de 2 a 3 meses de edad</td></tr><tr><td>O.C.T. Compuesto Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno</td><td>Airgas</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>4870500</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Yodada solución de preparación</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Mountant Antidecoloración de Oro</td><td>Fisher Scientific</td><td>P10144 (sin DAPI); P36935 (con DAPI)</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento oftálmico Puralube</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (carprofeno) inyectable</td><td>Patterson Veterinary</td><td>10000319</td><td>analgésico quirúrgico, administrado por vía subcutánea a una dosis de 5 mg/kg</td></tr><tr><td>Hojas de bisturí - #11</td><td>F.S.T</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí - #3</td><td>F.S.T</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Estéreo Microscopio</td><td>Accu-scope</td><td>3075</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutura, sintética, no absorbible, 30 pulgadas de largo, aguja CV-11</td><td>Covidien</td><td>VP-706-X</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml (calibre 26, aguja de 3/8 de pulgada)</td><td>BD Biosciences</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas, filo de corte de 8,0 mm</td><td>F.S.T</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de carbón activado VaporGaurd</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas enrolladas, 9 mm</td><td>F.S.T</td><td>12022-09</td><td></td></tr></tbody></table>

realización de xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Los efectos del tratamiento observados en estudios con animales a menudo no se recapitulan en ensayos clínicos. Si bien este problema es multifacético, una de las razones de este fallo es el uso de modelos de laboratorio inadecuados. Es difícil modelar enfermedades humanas complejas en organismos de laboratorio tradicionales, pero esta cuestión puede eludirse mediante el estudio de xenoinjertos humanos. El método quirúrgico que describimos aquí permite la creación de xenoinjertos musculares esqueléticos humanos, que se pueden utilizar para modelar la enfermedad muscular y para llevar a cabo pruebas terapéuticas preclínicas. Bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB), las muestras de músculo esquelético se adquieren de los pacientes y luego se trasplantan en ratones huésped NOD-Rag1nullIL2r. Estos ratones son huéspedes ideales para estudios de trasplante debido a su incapacidad para producir linfocitos maduros y, por lo tanto, son incapaces de desarrollar respuestas inmunitarias adaptativas mediadas por células y humorales. Los ratones huésped son anestesiados con isoflurano, y se eliminan los músculos del ratón tibialis anterior y digitorum longus extensor. Luego se coloca un pedazo de músculo humano en el compartimento tibial vacío y se sutura a los tendones proximales y distales del músculo peroneus longus. El músculo xenoinjerado es vascularizado e inervado espontáneamente por el huésped del ratón, lo que resulta en un músculo humano robusto mente regenerado que puede servir como modelo para estudios preclínicos.

Como lo demuestra Yuanfan Zhang et al., este protocolo quirúrgico es un método sencillo para producir xenoinjertos de músculo esquelético humano8. Los xenoinjertos regenerados se inerten espontáneamente y muestran contractilidad funcional. Además, el xenoinjerto muscular de pacientes con FSHD recapitula los cambios en la expresión génica observados en pacientes con FSHD8.
En nuestra experiencia, aproximadamente 7 de los 8 xenoinjertos realizados ...

Las enfermedades humanas complejas pueden ser difíciles de modelar en los sistemas de modelos de laboratorio tradicionales. Aquí, describimos un enfoque quirúrgico para modelar la enfermedad muscular humana a través del trasplante de biopsias musculares esqueléticas humanas en ratones inmunodeficientes.

Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Este protocolo es significativo porque se puede utilizar para crear xenoinjertos musculares esqueléticos humanos, que se pueden utilizar para modelar la enfermedad muscular y para llevar a cabo pruebas terapéuticas preclínicas. Este modelo de xenoinjerto permite a los investigadores estudiar el músculo humano in vivo para entender mejor la biología de las células musculares humanas y desarrollar modelos novedosos para enfermedades musculares raras o adquiridas. Después de obtener una biopsia muscular humana, coloque la muestra en una placa Petri de 100 por 15 milímetros que contenga un medio muscular, y use un microscopio estéreo y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier fascia o tejido graso restante.Disecciona la biopsia muscular en trozos de aproximadamente siete por tres por tres milímetros, teniendo cuidado de que las fibras estén dispuestas longitudinalmente dentro de la muestra. A continuación, transfiera el plato de Petri que contiene el músculo diseccionado sobre hielo, y coloque suturas sintéticas no absorbibles en un plato Petri de 100 por 15 milímetros de 70% etanol. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón NOD-Rag-gamma anestesiado de ocho

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Un método de injerto de forma fiable la luciferasa-etiquetados humanos malignos de los nervios periféricos células del tumor de la vaina en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes se describe. El uso de imágenes de bioluminiscencia para demostrar establecimiento adecuado de los injertos de tumor y los criterios de segregación aleatoria de los animales en grupos de estudio también se discuten.

Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Aquí se describe una metodología para ofrecer la médula humana derivados de la sangre endoteliales que forman colonias de células (ECFCs) y médula ósea procedentes de células madre mesenquimales (MSC), integrado en un gel de colágeno / fibronectina, por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Esta combinación de células / gel genera una red humana vascular que conecta con la vasculatura del ratón.

Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

Este video muestra un método para injertar piel humana en un ratón inmunodeficiente con una respuesta de neutrófilos suprimida. El método consiste en aplicar piel humana de espesor dividido al lecho de injerto del ratón, sellarlo y cubrirlo para su recuperación. Eventualmente, la piel humana se adhiere a la piel del ratón, estableciendo la vascularización y la circulación, lo que resulta en un xenoinjerto de piel exitoso.

Una técnica para el injerto de piel humana en un modelo de ratón

Este video muestra un ensayo para generar un modelo de ratón xenoinjerto humanizado. A un ratón inmunodeprimido se le inyecta ciclofosfamida para provocar el agotamiento de las células inmunitarias. Las células tumorales derivadas del paciente mezcladas con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en un hidrogel se inyectan subcutáneamente en el ratón, formando un tumor con células T infiltrantes.

Una técnica para generar un modelo de ratón de xenoinjerto humanizado humano injertado en PBMC

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-progenitores miógenos derivados son candidatos prometedores para las estrategias de terapia celular para tratar las distrofias musculares. Este protocolo describe el trasplante y las medidas funcionales necesarias para evaluar el injerto y la diferenciación de mesoangioblastos derivados de iPSC (un tipo de progenitores musculares) en modelos de ratón de regeneración muscular aguda y crónica.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

Describimos una nueva técnica experimental que llamamos mínimamente invasiva del músculo incrustación (MIME), que se basa en la evidencia que el tejido muscular esquelético contiene células viables miógenas que pueden facilitar la miogénesis mediada por células de donantes cuando están implantados en un músculo de host.

Mínimamente invasiva músculo incrustación (MIME) - una nueva técnica Experimental para facilitar la miogénesis mediada por células de donantes

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética.  los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

El presente protocolo describe cómo injertar piel humana en ratones diabéticos no obesos (NOD)-scid receptor de cadena gamma (NSG) con interleucina-2. En el informe se incluye una descripción detallada de la preparación de la piel humana para el trasplante, la preparación de ratones para el trasplante, el trasplante de piel humana de espesor dividido y el procedimiento de recuperación posterior al trasplante.

Modelo de piel de xenoinjerto para manipular las respuestas inmunes humanas in vivo

Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.

Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos 

Aprende a realizar xenoinjertos de músculo esquelético humano en ratones inmunodeficientes NRG para modelar enfermedades musculares y evaluar terapias preclínicamente. Este método permite estudiar la biología muscular humana in vivo con regeneración robusta.

Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

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