Name: Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a medir roturas de doble cadena de ADN, distribución del ciclo celular y apoptosis mediante citometría de flujo. Este método permite evaluar respuestas al daño genotóxico en oncología clínica.

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Agradecemos al equipo de Flow Cytometry Facility en el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ) por su apoyo.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método destacado es fácil de usar y ofrece una medición rápida, precisa y reproducible de la respuesta de daño del ADN, incluyendo la inducción y reparación de rotura de doble cadena (DSB), efectos del ciclo celular y muerte celular apoptótica. La combinación de estos puntos finales proporciona una imagen más completa de sus interrelaciones que los ensayos individuales. El método puede aplicarse ampliamente como un ensayo integral de genotoxicidad en los campos de la biología de la radiación, la terapia y la protecció...

El objetivo de la oncología es matar o desactivar las células cancerosas sin dañar las células normales. Muchas terapias inducen directa o indirectamente estrés genotóxico en las células cancerosas, pero también a cierta extensión en las células normales. La quimioterapia o los medicamentos dirigidos a menudo se combinan con radioterapia para mejorar la radicalidad del tumor irradiado1,2,3,4,5, lo que permite una reducción de la dosis de radiación para minimizar el daño normal del tejido.
La radiación ionizante y otros agentes genotóxicos inducen diferentes tipos de daño en el ADN, incluidas modificaciones en la base, retituladores de hebras y roturas de una o dos hilos. Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) son las lesiones de ADN más graves y su inducción es clave para el efecto mortal celular de la radiación ionizante y varios fármacos citostáticos en la radioterapia. Los DSB no sólo dañan la integridad del genoma, sino que también promueven la formación de mutaciones6,7. Por lo tanto, diferentes vías de reparación dsb, y mecanismos para eliminar las células irreparablemente dañadas como la apoptosis se han desarrollado durante la evolución. Toda la respuesta de daño al ADN (DDR) está regulada por una compleja red de vías de señalización que se extiendendesde el reconocimiento de daños del ADN y la detención del ciclo celular para permitir la reparación del ADN, hasta la muerte celular programada o la inactivación en caso de fallo de reparación 8.
El método citométrico de flujo presentado se ha desarrollado para investigar la DDR después de la tensión genotóxica en un ensayo exhaustivo que cubre la inducción y reparación del DSB, así como las consecuencias de la falla de reparación. Combina la medición del marcador DSB-H2AX ampliamente aplicado con el análisis del ciclo celular y la inducción de la apoptosis, utilizando el análisis subG1 clásico y la evaluación más específica de la activación de la caspasa-3.
La combinación de estos puntos finales en un ensayo no solo reduce los gastos de tiempo, mano de obra y costos, sino que también permite la medición específica del ciclo celular de la inducción y reparación del DSB, así como la activación de la caspasa-3. Estos análisis no serían posibles con ensayos realizados de forma independiente, pero son muy relevantes para una comprensión integral de la respuesta del daño del ADN después del estrés genotóxico. Muchos medicamentos contra el cáncer, como los compuestos citostáticos, se dirigen contra las células divisorias y su eficiencia depende en gran medida de la etapa del ciclo celular. La disponibilidad de diferentes procesos de reparación del Dsb también depende de la etapa del ciclo celular yde la elección de la vía, que es fundamental para la precisión de la reparación, y a su vez determina el destino de la celda 9,10,11, 12. Además, la medición específica del ciclo celular de los niveles de OSD es más precisa que el análisis agrupado, ya que los niveles de OSD no sólo dependen de la dosis de un compuesto genotóxico o radiación, sino también del contenido de ADN de la célula.
El método se ha utilizado para comparar la eficacia de diferentes radioterapias para superar los mecanismos de resistencia en el glioblastoma13 y para diseccionar la interacción entre la radiación ionizante y los fármacos dirigidos en el osteosarcoma14,15 y cánceres de rabdoide teratoide atípico16. Además, el método descrito se ha utilizado ampliamente para analizar los efectos secundarios de la radio y la quimioterapia en las células madre mesenquimales17,18,19,20,21, 22,23,24, que son esenciales para la reparación del daño tisular normal inducido por el tratamiento y tienen una posible aplicación en la medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td>1.000 y micro; L puntas de filtro</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1.000 &micro; Pipeta</td><td>L Eppendorf 3123000063</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Tubos con tapón de filtro de celdas, 35 y micro; m tamaño de poro de malla</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubos BD</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 y micro; L puntas de filtro</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; Pipeta</td><td>L Eppendorf 3123000055</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Disolver en agua a 200 &micro; g/mL y almacene las alícuotas a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Anticuerpo Phospho (Ser139), RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>Diluido 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Conejo Anti-Active Caspasa-3 Anticuerpo, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Diluido 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSCleano</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>Para la rutina de limpieza del citómetro después</td>de la medición</tr><tr><td>BD FACSRonsolución inse</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Para la rutina de limpieza del citómetro después de la medición</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>Disolver en agua a una concentración 1x</td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco con glutamina estable</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Material de cultivo celular de rutina para la línea celular de ejemplo utilizada en el protocolo</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Excel software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (suero fetal bovino)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Material de cultivo celular de rutina para la línea celular de ejemplo utilizada en el protocolo</td></tr><tr><td>FlowJo v10 software</td><td>LLC</td><td>pedido</td><td></td>en línea</tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Medio de inclusión para la preparación opcional de portaobjetos microscópicos a partir de muestras teñidas Filtros de</td></tr><tr><td>celulosa plegados, grado 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII o LSRFotómetro de Ortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>fármaco opcional para el control positivo de la apoptosis</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>Prepare una solución fresca al 4,5%. Diluir en PBS calentando a 80 ° C con agitación lenta debajo de la campana extractora. Cubra el matraz con papel de aluminio para evitar la pérdida de calor. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y ajuste el volumen final. Pase la solución a través de un filtro de celulosa.</td></tr><tr><td>Fosfo-histona H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor&reg; 555 Conjugado) RRID: AB_10694639</td><td>Tecnología de Señalización Celular</td><td>#3475</td><td>Diluido 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (ligando inductor de apoptosis modificado relacionado con TNF)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>fármaco opcional para el control positivo de la apoptosis</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular T25</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Material de cultivo celular de rutina para la línea celular de ejemplo utilizada en el protocolo</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>Material de cultivo celular de rutina para la línea celular de ejemplo utilizada en el protocolo</td></tr><tr><td>U87 MG células de glioblastoma</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Línea celular de ejemplo utilizada en el protocolo</td></tr></tbody></table>

medición específica del ciclo celular de la éh2ax y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

El método presentado o versiones ligeramente modificadas han sido ideados para estudiar las respuestas específicas del tratamiento y los efectos secundarios de varios tratamientos contra el cáncer como se utiliza en la oncología clínica. Permite un análisis cuantitativo y longitudinal de la respuesta del daño del ADN después del estrés genotóxico, inducido por la radioterapia y una multitud de fármacos contra el cáncer. El método cubre todas las etapas de la respuesta al daño del ADN, proporcionando puntos finales para la inducción y reparación de roturas de doble cadena de ADN (DSB), detención del ciclo celular y muerte celular por apoptosis en caso de falla de reparación. La combinación de estas mediciones proporciona información sobre los efectos del tratamiento dependientedel del ciclo celular y, por lo tanto, permite un estudio en profundidad de la interacción entre la proliferación celular y los mecanismos de afrontamiento contra el daño del ADN. Dado que el efecto de muchas terapias oncológicas, incluidos los agentes quimioterápicos y la radiación ionizante, varía o varía considerablemente según las fases específicas del ciclo celular, los análisis correlativos se basan en un método robusto y factible para evaluar los efectos del tratamiento en el ADN de una manera específica del ciclo celular. Esto no es posible con ensayos de un solo punto y una ventaja importante del método presentado. El método no se limita a ninguna línea celular en particular y se ha probado a fondo en una multitud de líneas celulares tumorales y de tejido normal. Se puede aplicar ampliamente como un ensayo integral de genotoxicidad en muchos campos de la oncología además de la radiooncología, incluida la evaluación de factores de riesgo ambientales, la detección de fármacos y la evaluación de la inestabilidad genética en las células tumorales.

Las células humanas del glioblastoma U87 o LN229 fueron irradiadas con 4 Gy de radiación de fotón o iones de carbono. Los niveles específicos del ciclo celular de H2AX y la apoptosis se midieron en diferentes puntos de tiempo hasta 48 h después de la irradiación utilizando el método citométrico de flujo presentado aquí (Figura3). En ambas líneas celulares, los iones de carbono indujeron niveles máximos más altos de H2AX que disminuyeron más lentamente y se mantuvieron significativamente elev...

El método presentado combina el análisis cuantitativo de las roturas de doble cadena de ADN (DSB), la distribución del ciclo celular y la apoptosis para permitir la evaluación específica del ciclo celular del Dsb de inducción y la reparación, así como las consecuencias de la falla de reparación.

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

El método proporciona información sobre los efectos del tratamiento dependiente del ciclo celular y permite y en un estudio en profundidad de la interacción entre la proliferación celular y los mecanismos de afrontamiento contra el daño del ADN. Este método combina puntos finales importantes de la respuesta al daño del ADN, incluyendo el reconocimiento y reparación de fragmentos de doble cadena, los efectos del ciclo celular y la muerte celular eventual por apoptosis en un ensayo completo. Hemos utilizado esta técnica principalmente para investigar las respuestas específicas del tratamiento y los efectos secundarios de los tratamientos radioquiterapéuticos en oncología clínica.El ensayo es muy útil para estudios correlativos en los campos de la radiobiología y la radioterapia, pero también se puede aplicar a varias otras áreas de la oncología. Después de recoger las células del cultivo de acuerdo con los procedimientos estándar de recolección celular, resuspendir el pellet en un mililitro de PBS. Y transfiera las células a dos mililitros de solución de fijación en una campana.Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, recoger las células por centrifugación y decantar el sobrenadante. Es importante fijar las celdas como una suspensión de una sola célula, y mantener el tiempo de fijación constante para todas las muestras. Dé a las células adherentes suficiente tiempo para separarse para obtener células bien redondeadas para su análisis.A continuación, afloje el pellet tocando y resuspender las células en tres mililitros de 70%etanol. Para lavar las células antes de la tinción, sedimentar las células por centrifugación, y aflojar el pellet tocando. A continuación, resuspender las células con dos lavados consecutivos con tres mililitros de solución de lavado y un lavado con un mililitro de solución de lavado.Descartar el sobrenadante entre cada lavado. Después del último lavado, aspira cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet y resuspender el pellet lucento en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de interés. Después de una hora a temperatura ambiente, recoger las células por centrifugación y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet.Luego, resuspender el pellet aflojado en 100 a 250 microlitros de solución de tinción de ADN y dispensar las células a través de la tapa del colador celular de un tubo de muestra con un tamaño de poro de malla de 35 micrómetros. Para analizar las celdas por citometría de flujo, abra la pestaña de parámetros en la ventana del citometro y seleccione los parámetros como se indica en la tabla. A continuación, abra la ventana de la hoja de cálculo y cree trazados como se indica.Cargue una muestra de control en el citometro y pulse el botón ejecutar. Seleccione el primer tubo en la ventana del navegador y haga clic en el nombre del tubo. Ajuste los voltajes del detector para la dispersión hacia delante y hacia el lado y DAPI en la pestaña de parámetros de la ventana del inspector.Presione el botón de espera para continuar con la configuración de la hoja de trabajo en el software. Utilice la herramienta de puerta poligonal para definir la población de celdas en el área de dispersión hacia delante frente a la gráfica de área de dispersión lateral y utilice la herramienta de puerta rectangular para definir la población de celdas individuales en el gráfico de área DAPI frente a DAPI. Presione el control G para mostrar la jerarquía de población y haga clic en los nombres de puerta predeterminados para cambiarles el nombre.Posteriormente, haga clic con el botón derecho en todos los histogramas para seleccionar mostrar poblaciones y celdas individuales en el menú contextual. Adquiera muestras de control y tratadas para optimizar los voltajes del detector de los fluoróforos acoplados a anticuerpos para cubrir todo el rango dinámico de la señal. Para medir las muestras, pulse el botón Ejecutar en el citómetro y utilice el panel de adquisición del software para medir las muestras.A continuación, seleccione archivo, exportación y experimentos para seleccionar la exportación de directorios en el cuadro de diálogo para guardar los datos como archivos FCS de punto. Para evaluar los datos, arrastre y suelte los archivos FCS de punto en el navegador de muestras del software de análisis citométrico de flujo. Y utilice la herramienta de polígono para definir la población de celdas en el trazado de área de dispersión hacia delante frente a lado y para excluir los desechos del análisis.En el trazado de área DAPI frente a DAPI, utilice la herramienta rectángulo para definir la población de celdas individuales y excluir cualquier doblete o grupo de celdas del análisis. En el histograma de área DAPI, utilice la herramienta bisector para distinguir células individuales con un contenido normal de ADN de las células apoptóticas con ADN degradado. Seleccione la biología de la herramienta y el ciclo celular para abrir la herramienta de modelado del ciclo celular y seleccione Dean-Jett Fox para estimar la frecuencia de las células en las fases G uno S y G dos M.Cree puertas de fase G one S y G two y M en el DAPI con la gráfica de área DAPI frente a daPI de la población del ciclo celular para permitir una medición específica de gamma H dos A X de un ciclo celular. Utilice la herramienta bisector para distinguir las células fosfohistone H tres células positivas y negativas en el histograma de área De Alexa 555 de la población del ciclo celular y para distinguir la base CAS de tres celdas positivas y negativas en el histograma de área Alexa 647 de la población de células individuales. Presione el control T para abrir el editor de tablas y configurar la tabla como se indica.A continuación, seleccione Para archivo para establecer el formato y el destino en la sección de salida de la cinta de opciones de menú y exportar los datos a una hoja de pliegos. Los iones de carbono inducen niveles máximos de gamma H dos AX más altos en las células del glioblastoma que disminuyen más lentamente y permanecen significativamente elevados en 24 a 48 horas en comparación con la radiación fotónica a la misma dosis física. Tanto para los iones de carbono como para la radiación fotónica, los niveles de gamma H dos AX fueron más altos en las células de una fase G probablemente porque la reparación de la rotura de doble hebra de ADN se limita a la vía de unión final nohomojosa en esta etapa del ciclo celular.En línea con la mayor tasa de inducción de doble hebra y cinética de reparación más lenta, los iones de carbono inducen una detención del ciclo celular más fuerte y más duradera en G dos fases y una tasa más alta de apoptosis que los fotones. Dependiendo de la fuerza del efecto de tratamiento, la resolución de las diferentes fases del ciclo celular puede ser difícil. En algunas líneas celulares, la concentración de DAPI tiene un gran impacto en la calidad del perfil del ciclo celular y necesita ser ajustada.Las diapositivas se pueden preparar a partir de las muestras restantes después de la citometría de flujo para evaluar el número, el tamaño y la forma de gamma H dos focos de AX y para distinguir entre la tinción focal y la gamma F de dos ejes. Usando nuestro método, podríamos mostrar que las células madre mesenquimales son relativamente resistentes contra las radiaciones ionizantes y la inhibición de la topoisomerasa pero sensibles a la gliomiacina. Como los humos de PFA son tóxicos, utilice siempre una campana de humos al preparar la solución de fijación y durante el paso de fijación.También recuerde usar guantes al manipular DAPI.

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La cuantificación de ADN de doble filamento con la formación de estrías γH2AX como un marcador molecular se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos después de la exposición de las células a la radiación.

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La cuantificación de ADN de doble filamento se rompe sobre la base de γH2AX focos se ha convertido en una herramienta de valor incalculable, sobre todo en biología de la radiación, para la evaluación de la radiosensibilidad del tejido y los efectos de los compuestos de la radiación modificar. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido.

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Microscopía de inmunofluorescencia para el análisis de roturas de doble cadena de ADN

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

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Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Este protocolo presenta la preparación de diapositivas y la puntuación automatizada del ensayo de focos γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica. Para ilustrar el método y la sensibilidad del ensayo, se irradiaron linfocitos aislados in vitro. Este método automatizado de detección de ADN DSB es útil para aplicaciones de dosimetría biológica rápidas y de alto rendimiento.

Un método automatizado de puntuación microscópica para el ensayo de focos γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica humana

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.

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Aquí, presentamos un protocolo simple y rápido para la detección de la interacción de proteínas en sitios de daño en el ADN.

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

Aprende a medir roturas de doble cadena de ADN, distribución del ciclo celular y apoptosis mediante citometría de flujo. Este método permite evaluar respuestas al daño genotóxico en oncología clínica.

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

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