Transformando, Edición del Genoma y Fenotipando el árbol tropical de cannabaceae de fijación de nitrógeno Parasponia andersonii
18 de agosto de 2019
Parasponia andersonii es un árbol tropical de rápido crecimiento que pertenece a la familia Cannabis (Cannabaceae) y puede formar nódulos radiculares fijados al nitrógeno en asociación con el rizobio. Aquí, describimos un protocolo detallado para análisis genéticos inversos en P. andersonii basado en Agrobacterium tumefaciens-mediada transformación estable y edición del genoma basada en CRISPR/Cas9.
Parasponia es un árbol tropical de la familia Cannabis que es capaz de establecer una simbiosis fijadora de nitrógeno con rizobio. Los estudios comparativos entre Parasponia y las legumbres podrían proporcionar información sobre las redes genéticas básicas subyacentes a la simbiosis del rizobio. Con este protocolo, parasponia andersonii líneas mutantes transgénicas estables se pueden generar en un período de dos a tres meses.
Estas líneas se pueden propagar eficientemente a través de la propagación in vitro. Este protocolo proporciona una plataforma experimental para estudiar la simbiosis rizobiana, así como otros aspectos de la biología de este árbol tropical. Las habilidades básicas en el cultivo de tejidos y la clonación molecular son suficientes para implementar este protocolo.
Esto permite a cualquier laboratorio adaptar Parasponia como modelo de investigación. Demostrando el procedimiento serán los estudiantes de doctorado Titis Wardhani y Yuda Roswanjaya junto con Marijke Hartog, un técnico en nuestro laboratorio. Para cultivar árboles de Parasponia andersonii, comience germinando las semillas.
Retire las semillas de las bayas de Parasponia frotando contra el interior de un tamiz de té o aplastándolas en un pedazo de papel tisú. Desinfecte las semillas con 4%hipoclorito durante 15 a 20 minutos, y luego lave las semillas seis veces con agua esterilizada. Transfiera las semillas a tubos estériles de PCR de 200 microlitros y llene los tubos con agua esterilizada para sumergir las semillas.
Incubar los tubos durante 10 días en un termociclo, según las instrucciones del manuscrito. Después de la incubación de 10 días, transfiera las semillas a placas SH-0 y ciérrelas con dos capas de lámina de sellado elástica para evitar el secado. Incubar a 28 grados centígrados con un ciclo de 16 horas al día, ocho horas de noche durante tres a cuatro semanas.
Una vez que las plántulas desarrollen su primer conjunto de hojas verdaderas, transcúyenlas a macetas llenas de tierra de maceta comercial, y cúbralas con una taza de plástico translúcido para evitar la desicación. Coloque las ollas en una sala de clima de humedad relativa de 28 grados, 85% o invernadero bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche. Después de una semana, retire la taza de plástico.
Regar regularmente las macetas, y complementar con fertilizante para sostener el crecimiento del árbol. Prepárese para la transformación cosechando ramas jóvenes de cinco a ocho centímetros de los árboles cultivados en invernadero, asegurándose de utilizar sólo ramas sanas y no infectadas. Cortar las hojas, dejando un centímetro cuadrado de tejido de la hoja al final de cada pecíolo.
Desinfectar el tejido durante 15 minutos con 2%hipoclorito que contiene unas gotas de polisorbato 20, y luego enjuagar ocho veces con agua autoclave. Re-suspende las células de Agrobacterium en 25 mililitros de media de infiltración a una densidad óptica de unos cinco. Corte el tallo y el tejido pecíolo en trozos de un centímetro dentro de la suspensión celular.
Retire los tejidos de las hojas e incubar las piezas del tallo y el pecíolo en la suspensión celular durante 10 a 30 minutos. Seque las piezas de los tejidos en un pedazo estéril de papel de filtro y colóquelos en un medio de enraizamiento preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Incubar las placas en la oscuridad a 21 grados centígrados durante dos días.
Después de los dos días, inspeccione las placas en busca de contaminación por hongos o bacterias y deseche las placas contaminadas. Transfiera las piezas de tejido a 10 mililitros de medio SH-10 preparados según las instrucciones del manuscrito. Deje el tejido en el medio durante al menos 10 minutos y agite suavemente cada dos o tres minutos para lavarlo.
Preparar medio de enraizamiento con cefotaxime y kanamicina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y verter las placas. Seque los tejidos en trozos estériles de papel de filtro y transfieralos a las placas. Incubar placas durante siete días a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche.
Revise las placas en busca de contaminación por hongos o bacterias cada dos días. Si se produce contaminación, transfiera las piezas de tejido no infectadas a un plato nuevo. Después de siete días, transfiera las piezas de tejido al medio de propagación preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e incubar a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche.
Refresque las placas una vez a la semana hasta que se desarrollen brotes transgénicos, asegurándose de transferir únicamente las piezas de tejido no infectadas a placas nuevas. Una vez que los brotes transgénicos putativos miten al menos un centímetro de largo, corte los brotes y escúlelos de forma independiente en el medio de propagación con antibióticos. Para asegurarse de que los brotes representan transformadores independientes, tome un solo disparo de cada lado de un explant.
Propagar el tejido colocando alrededor de 10 brotes en una placa fresca de medio de propagación y cerrando la placa con dos capas de lámina de sellado elástica. Incubar las placas a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche, y repetir este paso cada cuatro semanas. Cuando los brotes alcancen un centímetro de longitud, córtalos en su base y colóquelos en el medio de enraizamiento.
Coloque los disparos en posición vertical insertando la punta basal del brote en el medio. Se pueden colocar alrededor de 10 tomas en una sola placa. Comience preparando el rizobio inóculo.
Inocular 10 mililitros de medio líquido YEM de una sola colonia de Mesorhizobium plurifarium BOR2, e incubar a 28 grados centígrados durante dos días. Utilice este cultivo para inocular un mayor volumen de medio YEM líquido. Una vez cultivado, centrifugar el cultivo bacteriano durante 10 minutos a 3.500 veces g para cosechar las células.
Vuelva a suspender el pellet bacteriano en un medio líquido EKM y determine la densidad óptica. Preparar tres litros de medio EKM, que es suficiente para unos 20 macetas, e inocular con la suspensión rizobiana. Mezclar el medio con 1,25 kilogramos de perlita, y añadir 210 gramos de esta mezcla a las ollas de polipropileno translúcido estéril.
Planta de una a tres plantaciones de Parasponia andersonii en cada maceta, y prepara varias macetas con plantlets transformados con la construcción de control. Pesar varias de las ollas, y cubrir la parte inferior de cada olla para proteger las raíces de la exposición a la luz. Incubar las macetas en una sala de crecimiento climatizado a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche durante cuatro a seis semanas.
Una vez a la semana, pesar varias ollas para determinar la pérdida de agua. Si la pérdida de agua supera los 10 mililitros, suplementar con agua ultrapura para compensar la pérdida. Después de la incubación, limpie las raíces de la perlita y determine los números de nódulos usando un binocular.
Esta técnica se ha utilizado para transformar con éxito pecíolos y segmentos de tallos de Parasponia andersonii con la cepa Agrobacterium AGL1. En primer lugar, los tejidos explants se co-cultivan con Agrobacterium durante dos días. El cultivo prolongado da como resultado una sobrecolonización bacteriana y debe prevenirse.
Unas semanas más tarde, se observan pequeñas microllamadas verdes a lo largo de la superficie original de la herida. Estos calli continúan creciendo y desarrollando uno o más brotes transformados putativamente a las seis a ocho semanas después del inicio de la transformación. Las eficiencias de transformación varían de 10 a 30% para los explantes de tejidos de ramas maduras a 65 a 75% para los explantes de tejidos de ramas jóvenes y de rápido crecimiento.
Los brotes transgénicos se pueden multiplicar a través de la propagación in vitro, lo que da lugar a decenas de brotes en un mes. Estos brotes se pueden colocar en el medio de enraizamiento que inducirá la formación de raíces en aproximadamente dos semanas y las plantas de rendimiento que se pueden utilizar para la experimentación. Al iniciar un experimento de transformación estable, es importante seleccionar ramas sanas como material de origen.
Las líneas transgénicas de Parasponia T0 se propagan in vitro. Por lo tanto, es esencial genotipo completamente Parasponia líneas transgénicas. El establecimiento de Parasponia como modelo experimental permite el análisis comparativo entre dos linajes nodulantes distantemente relacionados, Parasponia y legumbres.
Esto podría identificar redes genéticas conservantes subyacentes a la simbiosis del rizobio. Parasponia también puede ser un modelo valioso para estudiar otros temas de investigación como la formación de madera, el desarrollo de flores bisexuales, o la biosíntesis de metabolitos secundarios específicos de Cannabaceae.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para análisis de genética inversa en el árbol tropical Parasponia andersonii, que puede formar nódulos radiculares fijadores de nitrógeno con rizobios. El protocolo utiliza transformación estable mediada por Agrobacterium tumefaciens y edición del genoma basada en CRISPR/Cas9.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Ingeniería genética
- Relaciones simbióticas
Antecedentes
- Parasponia andersonii pertenece a la familia del cáñamo (Cannabaceae).
- Establece una simbiosis fijadora de nitrógeno con rizobios.
- Estudios comparativos con leguminosas pueden revelar conocimientos sobre las redes genéticas de la simbiosis.
- Este modelo de investigación puede ser adaptado por diversos laboratorios.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo para generar líneas transgénicas estables de P. andersonii.
- Facilitar estudios sobre la simbiosis con rizobios y otros aspectos biológicos del árbol.
- Permitir que investigadores con habilidades básicas de cultivo de tejidos implementen el protocolo.
Métodos Utilizados
- Técnicas de germinación de semillas y propagación in vitro.
- Transformación mediada por Agrobacterium de tejidos vegetales.
- Uso de medios específicos para enraizamiento y propagación.
- Inoculación con Mesorhizobium plurifarium para estudios simbióticos.
Resultados principales
- Generación exitosa de líneas transgénicas estables en dos o tres meses.
- Propagación eficiente de líneas transgénicas mediante métodos in vitro.
- Establecimiento de un protocolo confiable para estudiar las interacciones rizobiales.
- Realización del procedimiento por personal capacitado.
Conclusiones
- El protocolo permite adaptar P. andersonii como modelo de investigación.
- Proporciona una base para estudios posteriores sobre la simbiosis planta-ricio bacteriano.
- Conocimientos básicos en cultivo de tejidos son suficientes para su implementación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de Parasponia andersonii como un modelo genéticamente manipulable permite el análisis comparativo de los mecanismos de simbiosis fijadora de nitrógeno distintos a los de las leguminosas, ofreciendo un sistema único para reducir los riesgos en la validación de dianas en la ingeniería de vías simbióticas. El protocolo permite la generación rápida de líneas transgénicas estables en 2-3 meses, facilitando pruebas iterativas de hipótesis y cribado fenotípico en un sistema de árbol tropical perenne. Esto posiciona al enfoque como una herramienta valiosa para la desaceleración mecanicista de riesgos en programas iniciales de descubrimiento centrados en rasgos relacionados con la simbiosis o en la eficiencia del uso del nitrógeno.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de redes genéticas conservadas que subyacen a la simbiosis con rizobios mediante estudios comparativos con leguminosas.
- Valor operativo: Proporciona un sistema manejable para la validación funcional de genes candidatos mediante edición mediada por CRISPR/Cas9 en una línea no leguminosa que forma nódulos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera sistemas biológicos validados para la evaluación cuantitativa de la formación de nódulos y la eficiencia simbiótica.
- Valor operativo: Apoya flujos de trabajo estandarizados de fenotipado mediante la propagación in vitro de líneas T0, lo que permite ensayos simbióticos reproducibles.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Ofrece un sistema relevante para la enfermedad para estudiar el establecimiento y mantenimiento de la simbiosis, aportando información para el descubrimiento traslacional de biomarcadores en las interacciones planta-microbio.
- Valor operativo: Asegura la continuidad desde el descubrimiento de genes hasta la validación fenotípica, apoyando el avance ajustado al riesgo de dianas que modulan la simbiosis.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la validación de objetivos mediante edición del genoma y fenotipificación simbiótica, cuyos resultados alimentan la identificación de compuestos o características moduladoras de la simbiosis.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la simbiosis rizobial mediante transformación estable y generación de líneas mutantes.
- Tamizaje: Proporciona líneas vegetales genéticamente uniformes y listas para ensayos, para la cuantificación reproducible de fenotipos de nodulación.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes, como el número de nódulos y la biomasa, para comparar la eficiencia simbiótica entre diferentes fondos genéticos.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos genéticos con resultados fenotípicos en un modelo de árbol perenne, apoyando la continuidad preclínica de rasgos relacionados con la simbiosis.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de transformación y propagación aplicable a múltiples objetivos genéticos y condiciones experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al permitir la genómica funcional en un sistema nodulador filogenéticamente distinto.
- Valor operativo: Proporciona estandarización y escalabilidad mediante la propagación in vitro, reduciendo la variabilidad en la fenotipificación simbiótica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al ofrecer conocimientos mecanicistas sobre los genes de simbiosis, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas de los programas de biotecnología agrícola.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos basándose en la validación de redes simbióticas conservadas a través de linajes evolutivamente distantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de tejidos vegetales, transformación mediada por Agrobacterium y clonación molecular.
- Depende de infraestructura estéril para la germinación de semillas, co-cultivo y propagación in vitro bajo regímenes controlados de luz y temperatura.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de ensayo simbiótico, incluyendo métodos de inoculación con rizobios y cuantificación de nódulos.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la eficiencia de transformación específica del genotipo, con tasas más altas observadas en brotes jóvenes y de crecimiento rápido.
- Las limitaciones prácticas incluyen un periodo de 4 meses desde la transformación hasta la fenotipificación debido a los requisitos de propagación vegetativa.
