Uso de un microarreglo antigonagen antigripal para medir la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus

La microarray del antígeno de la gripe permite la medición simultánea de múltiples isotipos de anticuerpos contra más de 300 cepas de gripe a partir de un pequeño volumen de muestra de sangre de un solo microlitro. El microarray facilita una medición de alto rendimiento de la amplitud de los anticuerpos antigripales en todo el paisaje antigénico de las cepas de gripe. Al caracterizar los anticuerpos antigripales con más detalle de lo que había sido posible anteriormente, este microbarrío puede ayudar a determinar por qué ciertas personas desarrollan una infección por la gripe y otras no.

La técnica del microarray del antígeno se ha aplicado a 35 patógenos diferentes en nuestro laboratorio, permitiendo la medición de anticuerpos contra 60.000 dianas de antígeno y de 50.000 muestras de suero recogidas de casos de enfermedades infecciosas y controles saludables en todo el mundo. Después de haber enseñado esta técnica a través de talleres presenciales, hemos descubierto que ser capaz de demostrar visualmente la técnica es crucial para su comprensión y rendimiento. Demostrando el procedimiento serán Al Jasinskas y Rafael De Assis, científicos del proyecto de nuestro laboratorio.

Para imprimir antígenos utilizando una impresora microarray, seleccione una impresora con pasadores de detección de microarray de bajo volumen que pueda aspirar los antígenos de una placa de origen de 384 pozos en el canal de muestra y deposite los antígenos a través de contacto directo y acción capilar en diapositivas de vidrio recubiertos con nitrocelulosa de 16 almohadillas. En el software de impresión, introduzca el número de placas de muestra que se utilizarán en el cuadro de texto Número de placas y seleccione el tipo de placa que se utilizará para el análisis. Seleccione una configuración de pasador y establezca los desfases de origen en las distancias entre el origen de la diapositiva y la ubicación donde los pines de impresión comenzarán a imprimirse en las diapositivas.

En la pestaña diseño de la matriz, defina el tamaño y la forma de las matrices y seleccione los parámetros de cómo recogerán y dispensarán los pines de impresión. Configure los protocolos de limpieza y desentremado de pines y defina la secuencia en la que se imprimen los bloques de muestra en las diapositivas. El software de matriz construirá un archivo de índice de cuadrícula anotado para describir la disposición de los antígenos dentro de cada microarray.

Después de programar el software de impresión con el protocolo deseado, inicie la ejecución de impresión. Cuando haya terminado, coloque los portaobjetos de microarray no mejorados en una caja a prueba de luz en un armario desecador a temperatura ambiente. Para sondear los sueros para anticuerpos en el microarray, utilice clips para fijar la almohadilla de diapositivas de microarray hacia arriba en las cámaras de sondeo y coloque las cámaras en los marcos.

Tenga cuidado al ensamblar los portaobjetos, ya que se rompen fácilmente y compruebe si hay fugas después de la rehidratación. Si es necesario, desmonte y vuelva a montar las diapositivas para corregir las fugas. Rehidrate los portaobjetos con 100 microlitros de tampón de bloqueo filtrado por pozo y diluya los sueros a una proporción de uno a 100 en 100 microlitros de tampón de bloqueo por muestra.

Luego, incubar los portaobjetos de microarray rehidracionados y el suero diluido durante 30 minutos a temperatura ambiente y de 100 a 250 rotaciones por minuto en un agitador orbital. Al final de la incubación, utilice puntas de pipeta conectadas a una línea de vacío con un matraz de recogida secundario para aspirar cuidadosamente el tampón de bloqueo desde la esquina de cada cámara sin tocar las almohadillas e inmediatamente añadir el suero diluido a las almohadillas sin permitir que las almohadillas se sequen. A continuación, coloque los marcos cubiertos en bandejas que contengan toallas de papel húmedas selladas para mantener la humedad e incubar los marcos durante la noche a cuatro grados centígrados en una coctelera mecedora.

Para el etiquetado de anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos, aspira cuidadosamente el suero como acaba de demostrar y enjuague los portaobjetos con tres lavados en 100 microlitros de tampón TTBS fresco por pozo durante cinco minutos cada uno en un agitador orbital. Los portaobjetos se incuban con una mezcla de anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos y luego se lavan tres veces como se describe en el protocolo, utilizando la misma técnica que acaba de demostrar. Después del último lavado, retire cuidadosamente los portaobjetos de las cámaras y enjuague suavemente los portaobjetos con agua destilada doble filtrada y luego coloque cada diapositiva en un tubo de 50 mililitros.

Luego, seque los portaobjetos por centrifugación. Para adquirir imágenes de las diapositivas de microarray, primero encienda el imager portátil y coloque cuidadosamente la diapositiva que se va a colocar boca abajo en el portaobjetos de la cámara de imágenes. Abra el software de imágenes y, en la pestaña configure imager, seleccione la configuración de diapositiva adecuada.

En la pestaña de control de imagen, seleccione el canal fluorescente adecuado y ajuste los tiempos de exposición y adquisición en función de la reactividad del suero. A continuación, haga clic en capturar para iniciar la adquisición de imágenes. Al final de la adquisición, utilice las cuadrículas orientadas en los marcadores fiduciarios para detectar los puntos de la matriz.

Para medir la intensidad del punto, en el panel de información del archivo, cargue el archivo gal y especifique la carpeta donde se guardarán los archivos de salida del análisis en la sección de opciones de análisis. En la pestaña de control de imagen, abra una de las imágenes adquiridas para cuantificar y seleccione auto. En la sección de análisis de matriz, cree una plantilla fiducial según las instrucciones del software.

Haga clic en análisis por lotes para seleccionar la carpeta que contiene las imágenes que se van a cuantificar y seleccionar la plantilla fiducial que se acaba de crear. El software analizará cada imagen y cuantificará la intensidad del punto. A continuación, analice los datos en bruto para comparar la unión de anticuerpos entre antígenos y entre muestras séricas.

En este estudio representativo, los anticuerpos secundarios utilizados fueron El IgG antihumano de cabra conjugado con el punto cuántico que emite a 800 nanómetros y la IgA antihumana de cabra conjugada con el punto cuántico que emite a 585 nanómetros para la detección de multiplex de anticuerpos IgG e IgA respectivamente. En el mapa de calor resultante, solo se etiquetaron los subtipos clínicamente relevantes con alta representación para ahorrar espacio con el signo más que denota todos los subtipos restantes de un número mayor. Las formas moleculares y los subtipos de imagglutinina y neuraminidasa se agruparon por IgA sérica e IgG.

Demostrar la alta especificidad de los anticuerpos del grupo de cabezas de hemagglutinina para los subtipos clínicos y la alta reactividad cruzada de hemaglutinina entera y anticuerpos enteros de hemagglutinina trimerizados con la inclusión de la región de stock. Las respuestas de los anticuerpos antigripales medidas en el microarray pueden confirmarse mediante técnicas tradicionales, como la inhibición de la hemaglutinación y los ensayos de microneutralización. Esta técnica ha producido información sobre la especificidad del subtipo de los anticuerpos para el grupo de la cabeza de la gripe y la importancia relativa de los anticuerpos IgA e IgG para la susceptibilidad a la gripe.

Aunque ninguno de los materiales es extremadamente peligroso, todas las muestras de suero humano deben manipularse de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad.