Rata automatizada de un solo pellet alcanzando la reconstrucción tridimensional de trayectorias de patas y dígitos
10 de julio de 2019
El alcance con habilidades de roedores se utiliza comúnmente para estudiar habilidades hábiles, pero requiere mucho tiempo y esfuerzo para implementar la tarea y analizar el comportamiento. Describimos una versión automatizada del alcance cualificado con seguimiento de movimiento y reconstrucción tridimensional de trayectorias de alcance.
Este método se basa en los protocolos de alcance calificados de ratas establecidos para automatizar el entrenamiento y las pruebas, proporcionando un medio eficiente para adquirir grandes conjuntos de datos relativamente rápidamente. Minimiza el esfuerzo del experimentador al tiempo que permite la reconstrucción tridimensional de la cinemática de la extremidad delantera. La cinemática se puede utilizar para evaluar los efectos de intervenciones cronopesadas con precisión o correlacionadas con grabaciones fisiológicas.
Con algunos ajustes, esta técnica también se puede aplicar en ratones. Comience encendiendo las luces y coloque la rata en una cámara de alcance hábil. Use fórceps para sostener un pellet a través de la ranura de alcance en la parte delantera de la caja.
Deje que la rata coma tres perdigones de los fórceps. Tire del pellet hacia atrás la próxima vez que la rata intente comer el pellet de los fórceps y repita hasta que la rata alcance el pellet con una pata como máximo de 11 alcances que indiquen la preferencia de la pata. A continuación, alinee la varilla de entrega de pellets con el lado de la ranura de alcance contralateral a la pata preferida de la rata.
Coloque un pellet en la barra de entrega. A continuación, utilice fórceps para cebar a la rata con el pellet, pero dirigir la rata hacia la barra de entrega para que su pata golpea el pellet en la varilla. Después de que la rata ha intentado 10 llegar a la barra de entrega sin ser cebado, avanzar la rata a la siguiente fase.
A continuación, coloque la varilla de entrega de pellets en función de la preferencia de la pata de la rata y establézcala en la posición dos. Ajuste la posición de altura de la varilla de entrega de pellets utilizando el mando a distancia del actuador. Una vez que la barra de entrega esté a la altura correcta, mantenga pulsado el número deseado hasta que la luz parpadee en rojo para ajustar.
A continuación, coloque la rata en la cámara y cebo la rata en la parte posterior con un pellet. Cuando la rata se mueve lo suficientemente lejos a la parte posterior de la cámara que rompería el haz infrarrojo si la versión automatizada estaba funcionando, mueva la barra de entrega de pellets a la posición tres. Finalmente, espere a que la rata alcance el pellet y luego mueva la varilla de entrega de pellets de nuevo a la posición dos.
Coloque un pellet nuevo en la barra de entrega si se derriba. Repita estos pasos gradualmente cebando a la rata cada vez menos hasta que la rata comience a uno, muévase a la parte posterior para solicitar un pellet sin ser cebado, y dos, inmediatamente se mueven al frente después de solicitar un pellet en la parte posterior. Después de que la rata haya hecho esto 10 veces, comience a entrenar en la tarea automatizada.
Para configurar el sistema automatizado, encienda las luces de la cámara y rellene el depósito de pellets. Coloque la varilla de entrega de pellets de acuerdo con la preferencia de la pata de la rata. Compruebe que las posiciones del actuador estén configuradas correctamente.
A continuación, encienda el ordenador y abra el programa de alcance experto. Introduzca el número de identificación de la rata en el asunto y seleccione la preferencia de la pata en el menú desplegable de la mano. Especifique la ruta de guardado de los vídeos.
A continuación, establezca la hora de la sesión y el número de vídeos máximos. Establezca la duración de la elevación de pellets también y habilite la penalización de alcance temprano. A continuación, para tomar imágenes de calibración, coloque la mano de ayuda dentro de la cámara de alcance y atorle el clip del caimán a través de la ranura de alcance.
Sostenga el cubo delante de la ranura de alcance con el clip de cocodrilo. A continuación, coloque el cubo de modo que el lado rojo aparezca en el espejo superior, el lado verde en el espejo izquierdo y el lado azul en el espejo derecho. En el programa de comportamiento, asegúrese de que el umbral de ROI se establece en un valor muy grande.
Haga clic en el botón de ejecución y una vez que el botón inicializado de la cámara se vuelva verde, pulse Start para comenzar la adquisición de vídeo. Haga clic en Modo Cal y, a continuación, haga clic en Tomar imagen de Cal. Mueva el cubo ligeramente y tome otra imagen.
Repita de nuevo para un total de tres imágenes. Por último, detenga el programa haciendo clic en Detener y, a continuación, haga clic en el botón detener signo. Retire la mano de ayuda y el cubo de la caja.
Tenga cuidado de no golpear nada en la cámara de comportamiento después de que se hayan tomado las imágenes de calibración ese día. Primero, coloca a la rata en la cámara de alcance hábil. Haga clic en la flecha blanca para ejecutar el programa.
A continuación, establezca la posición del ROI para la detección de patas ajustando x offset, y offset, ROI width y ROI height. Coloque el ROI en el espejo lateral que muestra el dorso de la pata directamente delante de la ranura de alcance y haga clic en comenzar para comenzar el programa. Mientras la rata no está alcanzando, ajuste el valor de umbral de ROI bajo hasta que el valor de activación de ROI vivo esté oscilando entre cero y uno.
A continuación, establezca el umbral de ROI para que sea significativamente mayor que el valor de activación de ROI en vivo durante los golpes de nariz y inferior al valor de activación de ROI en vivo cuando la rata alcanza. Ajuste hasta que los videos se activen constantemente cuando la rata llegue, pero no cuando se mete la nariz a través de la ranura. Supervise las primeras pruebas para asegurarse de que todo funciona correctamente.
Cuando una rata llega antes de solicitar un pellet, observe el aumento del número de los primeros alcances. Cuando una rata llega después de solicitar un pellet, observe el número de videos aumentar mientras una copia del video se guarda como un archivo bin. Finalmente, después de alcanzar el tiempo de sesión o el número máximo de videos, pulse el botón de detener la señal.
Los resultados indican que después de 20 días, las ratas adquieren la tarea de alcance experto. Aquí, se muestran las trayectorias de alcance de una sola sesión. Esto representa sólo el avance inicial de la pata para facilitar la presentación.
Además, si el gatillo de detección de patas no se establece con precisión, hay una variabilidad significativa en el marco en el que la pata rompe la ranura de alcance que puede conducir a la variabilidad en cuando las intervenciones se activan durante los movimientos de alcance. Aparte de un manejo cuidadoso de los animales, no se tomarán precauciones en este protocolo. Es más importante establecer el umbral de ROI correctamente para que los vídeos u otras intervenciones se activen en los momentos adecuados.
Este método se puede combinar con varias otras técnicas como la optogenética, la imagen de calcio y los modelos genéticos que pueden abordar preguntas que van desde el control motor básico hasta la fisiopatología del trastorno del movimiento. Esta técnica permite la correlación de la cinemática detallada de alcance y agarre con grabaciones fisiológicas o intervenciones que permiten a los investigadores responder no sólo si, sino cómo cambian los movimientos con los circuitos neuronales.
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Descripción general
Este artículo presenta un método automatizado para el alcance hábil en roedores, que mejora la eficiencia del entrenamiento y las pruebas al minimizar el esfuerzo del experimentador. La técnica permite la reconstrucción tridimensional de la cinemática del miembro anterior, facilitando el análisis de habilidades hábiles.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis del comportamiento
- Seguimiento automático del movimiento
Antecedentes
- El alcance hábil en roedores es un modelo común para estudiar habilidades de destreza.
- Los métodos tradicionales requieren un tiempo y esfuerzo considerables para su implementación y análisis.
- La automatización puede agilizar los procesos de recolección y análisis de datos.
- El método puede adaptarse para su uso con ratones.
Objetivo del estudio
- Automatizar la tarea de alcance hábil en roedores.
- Facilitar la adquisición eficiente de grandes conjuntos de datos.
- Permitir el análisis tridimensional de los movimientos de las extremidades anteriores.
Métodos Utilizados
- Automatización de protocolos de entrenamiento y pruebas para el alcance hábil.
- Seguimiento de movimiento para una recolección precisa de datos.
- Reconstrucción tridimensional de las trayectorias de alcance.
- Evaluación de la cinemática en relación con grabaciones fisiológicas.
Resultados principales
- Adquisición eficiente de datos con menor intervención del experimentador.
- Reconstrucción tridimensional exitosa de la cinemática del miembro anterior.
- Capacidad para correlacionar datos cinemáticos con intervenciones fisiológicas.
- Adaptabilidad del método para su uso en ratones.
Conclusiones
- El método automatizado mejora el estudio de las habilidades hábiles en roedores.
- Proporciona un marco robusto para analizar los movimientos de las extremidades anteriores.
- Este enfoque puede conducir a diseños experimentales más eficientes en la investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El alcance automatizado con reconstrucción cinemática 3D permite la evaluación cuantitativa de alto rendimiento de la función motora en modelos de roedores, apoyando la validación de objetivos en el descubrimiento de fármacos en neurociencia. Al reducir el esfuerzo manual y aumentar la reproducibilidad de los datos, este método mejora la confianza predictiva en estudios mecanicistas de etapa temprana de los trastornos del movimiento. Facilita la correlación entre fenotipos conductuales y manipulaciones de circuitos neuronales, ayudando en la identificación de compuestos prometedores y en la reducción de riesgos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis sobre circuitos motores mediante la medición precisa y automatizada de la cinemática del alcance y el agarre.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad y el sesgo del experimentador, aumentando la reproducibilidad entre laboratorios y puntos temporales.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en el objetivo al vincular manipulaciones genéticas o farmacológicas con resultados cuantificables de destreza.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera datos de video estandarizados y de alta velocidad de fotogramas adecuados para tuberías automatizadas de estimación de postura como DeepLabCut.
- Salida cuantitativa: Proporciona datos de trayectoria 3D que permiten variables objetivas y continuas para la modelización del efecto de compuestos.
- <Escalabilidad: La entrega y activación automatizadas de pellets permiten el cribado de grandes cohortes con mínima intervención manual.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la función alterada de las extremidades anteriores en el Parkinson, la enfermedad de Huntington y el accidente cerebrovascular, lo que permite alinear biomarcadores de forma traslacional.
- Reducción del riesgo mecanicista: Permite correlacionar déficits cinemáticos con intervenciones optogenéticas, quimicogenéticas o electrofisiológicas para establecer mecanismos neuronales causales.
- Continuidad preclínica: Facilita el seguimiento longitudinal de la recuperación motora o la degeneración en modelos de progresión de enfermedades.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la verificación de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes y la eficacia preclínica, especialmente para programas del SNC centrados en la función motora.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación del modo en que las perturbaciones del circuito neuronal afectan la dinámica del movimiento hábil.
- Selección: Permite obtener lecturas conductuales reproducibles y listas para ensayos, para la evaluación de bibliotecas de compuestos en modelos de deterioro motor.
- Análisis: Proporciona trayectorias cinemáticas 3D y videos sincronizados con disparadores para la correlación multimodal con grabaciones neuronales.
- Investigación Traducional: Se alinea con evaluaciones clínicas del movimiento (por ejemplo, golpeteo con los dedos, pruebas de destreza) para mejorar la validez predictiva.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma escalable y estandarizada para la fenotipificación motora en múltiples proyectos a través de diferentes áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la comprensión mecanicista al permitir una alineación temporal precisa del comportamiento con intervenciones neuronales.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de entrenamiento y prueba, reduciendo la variabilidad entre usuarios y aumentando el rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar puntos finales motores objetivos y cuantificables en las primeras etapas del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en la mejora motora funcional, reduciendo los fracasos en fases avanzadas de los programas para trastornos del movimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de roedores, entrenamiento conductual y herramientas de estimación de postura basadas en aprendizaje automático.
- Necesita cámaras de alta velocidad, iluminación sincronizada, entrega de pellets controlada por actuadores y software de seguimiento de video en tiempo real.
- Exige estandarización entre equipos de los ajustes de la región de interés (ROI), calibración de umbrales y lógica de activación para lograr una temporización de intervención reproducible.
- La adaptación entre especies (por ejemplo, de ratones a ratas) requiere una nueva validación de los parámetros cinemáticos del movimiento de alcance y de la posición del pellet.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de un ajuste adecuado del umbral de la ROI para evitar activaciones falsas durante los toques nasales o alcances no detectados.
