Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN
14 de noviembre de 2019
Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.
Este protocolo es el resultado de evaluar aspectos clave de la preparación de la biblioteca circRNA, como el tipo de kit, el tratamiento RNase R, las cantidades de entrada y su impacto en la detección de circRNA. Permite una detección óptima de circRNA y proporciona datos sobre parámetros ajustables en función de las necesidades del usuario. Identificar los circRNAs en diferentes tipos de muestras nos ayudará a comprender mejor la distribución de su expresión y establece el escenario para delinear el papel funcional de estas moléculas.
Este método se puede aplicar a cualquier muestra total de ARN. Es importante mantener las muestras de ARN en hielo antes de comenzar el protocolo. Evalúe los valores RIN y DV200 en el Bioanalyzer Agilent o TapeStation antes de la preparación, y siga los procedimientos adecuados al trabajar con ARN.
Comience diluyendo el ARN total a cuatro microgramos en 39 microlitros de agua libre de RNase y pipeteándolo arriba y abajo para mezclar. En un tubo separado, utilice 1 tampón RNase R para diluir la RNase R a una concentración de trabajo de dos unidades por microlitro. Pipeta 39 microlitros de ARN total y cinco microlitros de 10x RNase R Reaction Buffer en un tubo de reacción de 1,5 microlitros, y mezclar.
Añadir seis microlitros de la RNase R.Then ajuste la pipeta al volumen de reacción completo, y mezcle la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Coloque el tubo en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 10 minutos, asegurándose de que todo el volumen de reacción esté sumergido en el baño de agua. A continuación, coloque el tubo sobre hielo e inmediatamente proceda con la limpieza y concentración de ARN.
Antes de empezar, prepare el tampón de lavado de ARN mezclando el concentrado con 48 mililitros de 100% etanol, y coloque las columnas de purificación en los tubos de recolección. Cuando esté listo, agregue dos volúmenes de búfer de enlace de ARN a la muestra tratada con RNase R y mezcle bien. Agregue 150 microlitros de 100% etanol a la mezcla para un total de 300 microlitros, transfiera todo el volumen a la columna y centrifugar durante 30 segundos.
Elimine el flujo a través y agregue 400 microlitros de RNA Prep Buffer directamente a la columna. Centrifugar durante 30 segundos y deseche el flujo a través. A continuación, agregue 700 microlitros de RNA Wash Buffer a la columna, centrifugar durante 30 segundos y deseche el flujo a través.
Agregue otras 400 microlitros del wash Buffer, centrifugar durante dos minutos, y transfiera la columna a un tubo fresco de 1,5 mililitros sin RNase. Agregue cuidadosamente 11 microlitros de agua libre de RNase directamente a la columna sosteniendo la punta de la pipeta justo encima del filtro de columna. Deje reposar la muestra durante un minuto a temperatura ambiente y luego centrifugarlo durante un minuto.
Asegúrese de que haya flujo a través del tubo de 1,5 mililitros y deseche la columna. La muestra de ARN purificado puede almacenarse a menos 80 grados centígrados o utilizarse inmediatamente para la preparación de la biblioteca. Transfiera 10 microlitros del ARN total purificado a un pozo limpio en una placa PCR de 96 pozos.
Añadir cinco microlitros de rRNA Binding Buffer seguidos de cinco microlitros de rRNA Removal Mix, luego pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar los reactivos. Selle la placa e ibloquela durante cinco minutos a 68 grados centígrados en un bloque termociclotro preprogramado y precalentado. Después de la incubación, deje reposar la placa a temperatura ambiente durante un minuto.
Retire el sello de la placa y agregue 35 microlitros de perlas de extracción de ARN de temperatura ambiente con vórtices a la muestra. Ajuste la pipeta a 45 microlitros, y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces para mezclar a fondo. Deje que la placa se siente a temperatura ambiente durante un minuto.
Transfiera la placa a un soporte magnético e imagíe allí durante un minuto o hasta que la solución se despeje. Transfiera el sobrenadante a un nuevo pozo en el plato. A continuación, transfiera la placa del soporte magnético al soporte de la placa.
Cuentas de limpieza de ARN vortex hasta que estén bien dispersas, y agregue 99 microlitros de cuentas a la muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar, e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera la placa al soporte magnético, y déjela allí durante cinco minutos o hasta que la solución se aclare, luego retire y deseche todo el sobrenadante del pozo.
Con la placa todavía en el soporte magnético, añadir 200 microlitros de 80% etanol recién preparado al pozo sin interrumpir las perlas. Deje el etanol en el pozo durante 30 segundos, luego retírelo y deséchelo. Agregue 11 microlitros de Elution Buffer al pozo, y pipetearlo arriba y abajo para mezclar.
Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos minutos, luego transferirla de vuelta al soporte magnético, y mantenerla allí hasta que la solución se despeje. Transfiera 8,5 microlitros del sobrenadante a un nuevo pozo en la misma placa, y agregue 8,5 microlitros de Elute, Primer, Fragment High Mix a cada pozo que contenga una muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar bien, sellar la placa e incubar durante ocho minutos en un termociclador precalentado a 94 grados centígrados.
Enfríe la muestra a cuatro grados centígrados, retire la placa del termociclo y centrifugar brevemente. Se evaluaron dos kits de preparación de bibliotecas, TruSeq y KAPA, para este protocolo. En general, se detectó un mayor número de ARN circulares y un menor porcentaje de ARN ribosomal cuando se utiliza el kit TruSeq, por lo que TruSeq fue seleccionado para otros experimentos.
La importancia del pretratamiento de RNase R se evaluó comparando los datos generados a partir de bibliotecas pretratadas y no pretratadas. Como era de esperar, se identificó sistemáticamente un mayor número de ARN circulares en las bibliotecas pretratadas en comparación con las no pretratadas. La cantidad de ARN de entrada se optimizó para detectar una mayor diversidad de ARN circulares.
Las bibliotecas se prepararon utilizando uno, dos y cuatro microgramos de ARN de entrada, y se observó la mayor diversidad de especies de ARN circular cuando se utilizaban cuatro microgramos de ARN total. El protocolo optimizado se utilizó para comparar las abundancias circulares de ARN en cinco regiones cerebrales de cuatro donantes sanos y para otros tipos de tejidos de seis donantes sanos. En general, se observó una mayor abundancia de ARNa circular en el cerebro en comparación con otros tipos de tejido.
Es importante recordar seguir los procedimientos apropiados cuando se trabaja con ARN, incluyendo el uso de guantes, limpiar a fondo el banco y las pipetas con toallitas RNase o aerosol antes de comenzar el protocolo, y mantener el ARN en hielo de antemano. Después de este procedimiento, se puede realizar la validación ortogonal como la secuenciación de Sanger de cruces de circRNA identificados. El descubrimiento de nuevos circRNAs y más evidencia de su presencia tallan una nueva área de investigación para explorar sus funciones biológicas.
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Descripción general
Este protocolo detalla la preparación de bibliotecas de secuenciación de ARN circular (circARN), haciendo hincapié en la evaluación de diversos parámetros para la detección óptima de circARN. Proporciona información sobre el impacto del tratamiento con RNasa R y las cantidades de entrada en la identificación de circARN.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del ARN
- Genómica
Antecedentes
- Los ARN circulares son ARN no codificantes implicados en la regulación transcripcional.
- Comprender la expresión de circARN es fundamental para elucidar sus funciones.
- Las técnicas de preparación de bibliotecas pueden afectar significativamente la detección de circARN.
- El manejo adecuado de las muestras de ARN es esencial para experimentos exitosos.
Objetivo del estudio
- Optimizar los protocolos de preparación de bibliotecas de ARNc.
- Evaluar los efectos de diferentes parámetros en la detección de ARNc.
- Facilitar la identificación de ARNc en diversos tipos de muestras.
Métodos Utilizados
- Preparación de biblioteca de ARN total con cadena definida.
- Tratamiento previo con RNasa R para enriquecer circARNs.
- Evaluación de tipos de kits y cantidades de entrada.
- Evaluación de la integridad del ARN mediante Agilent Bioanalyzer o TapeStation.
Resultados principales
- Se establecieron las condiciones óptimas para la detección de circARN.
- Se proporcionaron datos sobre parámetros ajustables para mayor flexibilidad del usuario.
- La identificación de circARN mejora la comprensión de su distribución de expresión.
- El método es aplicable a cualquier muestra de ARN total.
Conclusiones
- Este protocolo facilita la preparación eficaz de bibliotecas de secuenciación de ARNc.
- Sienta las bases para estudios futuros sobre las funciones del ARNc.
- El manejo y la preparación adecuados del ARN son fundamentales para obtener resultados exitosos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección de ARN circular permite la validación de dianas en la biología del ARN no codificante, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Una preparación optimizada de bibliotecas mejora la confianza predictiva en la identificación de biomarcadores de ARN circular en distintos tipos de tejidos. Este flujo de trabajo potencia el desarrollo de ensayos para modelos de enfermedades neurológicas y periféricas en los que el enriquecimiento de ARN circular se correlaciona con la relevancia biológica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de la regulación mediada por circARN de la interacción miARN y redes de interacción proteína-proteína.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo estandarizado para la validación funcional de candidatos de ARN no codificantes.
- Valor científico: Apoya la desestimación biológica al aclarar los patrones de expresión de circARN en sistemas relevantes para enfermedades.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de expresión de circARNs para la estandarización y reproducibilidad de ensayos.
- Valor operativo: Permite plataformas de cribado escalables utilizando ARN total con cadena definida y tratamiento previo con RNasa R.
- Valor científico: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para estudios de cribado de compuestos y análisis de interacción con dianas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la aplicabilidad en sistemas relacionados con enfermedades mediante el perfilado de abundancia de circARN en múltiples tejidos.
- Valor operativo: Facilita la alineación de biomarcadores traslacionales mediante la identificación de firmas de circARN específicas de tejido.
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos mediante la detección de circARN conservados en diferentes tipos de tejidos humanos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano para apoyar la comprobación de hipótesis y la aclaración de rutas metabólicas antes de los esfuerzos de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la detección de circARNs implicados en la regulación transcripcional y el secuestro de miARNs.
- Tamizaje: Ofrece mediciones cuantitativas de circARNs listas para ensayos, para la evaluación reproducible de compuestos.
- Análisis: Proporciona conteos normalizados de circARNs provenientes de múltiples herramientas de detección para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traductiva: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante patrones conservados de expresión de circARNs enriquecidos en el cerebro.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable de preparación de bibliotecas aplicable a diversos tipos de muestras de ARN total.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación de objetivos mediante una mayor sensibilidad y especificidad en la detección de ARN circulares.
- Valor operativo: Aumenta la reproducibilidad y la estandarización mediante un tratamiento optimizado con RNasa R y una cuantificación precisa de ARN de entrada.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en la selección de objetivos al permitir una evaluación exhaustiva del panorama de ARN no codificantes.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo de objetivos asociados a ARN circulares basándose en evidencia de expresión específica de tejido.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ARN, preparación de bibliotecas y análisis bioinformático de circARNS.
- Depende del acceso a kits de bibliotecas de ARN total con cadena conservada, enzima RNasa R y sistemas de purificación basados en perlas magnéticas.
- Necesita la estandarización entre equipos de métricas de calidad de ARN (RIN, DV200) y la titulación de la cantidad de entrada.
- Implica consideraciones de adaptación para muestras con bajo contenido o degradadas, según la variabilidad de la fuente del tejido.
- Limitado por la variabilidad de las herramientas de detección de circARNs y la necesidad de validación ortogonal de las uniones putativas.
