Name: Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende a preparar bibliotecas de secuenciación de ARN circular usando tratamiento con RNase R y evaluación de parámetros óptimos. Este método permite identificar circRNAs en muestras de ARN total para estudios de biología del ARN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estamos agradecidos al Programa de Donación de Cerebros y Cuerpos del Instituto de Investigación de la Salud del Sol Banner (BBDP, por sus siglas en la) cuenta con el suministro de tejidos cerebrales humanos. El BBDP ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), el National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), el Departamento de Servicios de Salud de Arizona (contrato 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), la Comisión de Investigación Biomédica de Arizona (contratos 4001, 0011, 05-901 y 1001 al Consorcio de Enfermedad de Parkinson de Arizona) y el Consorcio de Enfermedadde Parkinson de Arizona) y el Consorcio Michael J. Fundación Fox para la Investigación de Parkinson27. Este estudio también fue apoyado por el DHS y el Estado de Arizona (aun vez ala DeDHS 14-052688). También agradecemos a Andrea Schmitt (Banner Research) y Cynthia Lechuga (TGen) por su apoyo administrativo.

Esta investigación se ha llevado a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Los tejidos cerebrales se obtuvieron del Programa de Donación cerebral y corporal del Instituto de Investigación de la Salud del Sol Banner en Sun City, AZ. Las operaciones del Programa de Donación cerebral y corporal son aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de Occidente (protocolo #20120821). Todos los sujetos o sus representantes legales firmaron el consentimiento informado. Los bioespecímenes comerciales (no cerebrales) fueron comprados a Proteogenex.
1. Tratamiento RNase R
NOTA: En los pasos siguientes, el volumen de reacción se ajusta a un volumen total de 50 sL. Este es el volumen de muestra mínimo que se utilizará en el kit de limpieza y concentrador de ARN (ver Tabla de Materiales). Además, el protocolo optimizado descrito aquí es para una cantidad de entrada de 4 g de ARN total. Se recomienda un tiempo de incubación más largo para el tratamiento con RNase R para una cantidad de entrada >4 g.
<ol><li>Diluir el ARN total a 4 g en agua libre de RNase de 39 ml en un tubo de microcentrífuga y mezclar bien mediante pipeteo.</li>
	<li>En un tubo separado, diluir la RNase R a una concentración de trabajo de 2 U/L con 1 búfer de reacción RNase R. Haga sólo lo suficiente para su uso inmediato.</li>
	<li>Pipetear 39 l de ARN total y 5 l de búfer de reacción RNase 10x renase en un tubo de reacción de 1,5 ml y mezclar bien mediante pipeteo (50 l será el volumen de reacción total). A continuación, añadir 6 l de RNase R (2 U / L).</li>
	<li>Ajuste la pipeta al volumen de reacción completo (50 l) y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.</li>
	<li>Colocar el tubo en un baño de agua de 37 oC durante 10 minutos. Asegúrese de que el volumen de reacción completo esté sumergido en el baño de agua.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre hielo y proceda inmediatamente con la limpieza y concentración del ARN (sección 2).</li>
</ol>2. Purificación de ARN utilizando un kit de limpieza y concentrador de ARN
NOTA: Cuando se utiliza ARN de alta calidad (RIN>8, DV200>80%), el tratamiento con RNase R puede resultar en una pérdida de aproximadamente el 60% de ARN. Usando una entrada de 4 g, se estima que 2–2,5 g de ARN tratado se deja después de la sección 1.
<ol><li>Antes de empezar, prepare el búfer de lavado de ARN añadiendo 48 ml de etanol al 100% al concentrado tampón y mezcle bien pipeteando. Coloque las columnas de purificación en los tubos de recogida (ver Tabla de materiales)y colóquelas en un estante de tubo. NOTA: Utilice los siguientes ajustes de centrifugación para todos los pasos siguientes: 10.000–16.000 x g. Si ya se ha realizado el tratamiento con DNase I, omita el tratamiento con DNase I en esta etapa.</li>
	<li>Añadir 2 volúmenes de búfer de enlace de ARN a la muestra tratada RNase R, y mezclar bien mediante pipeteo (volumen total: 150 l).</li>
	<li>Añadir 1 volumen de 100% de etanol a la mezcla de muestras tratadas con ARN Binding Buffer y RNase R, y mezclar bien pipeteando (volumen total: 300 l).</li>
	<li>Transfiera todo el volumen a la columna y centrifugar la columna durante 30 s. Deseche el flujo a través.</li>
	<li>Agregue 400 l de búfer de preparación de ARN directamente a la columna, centrifugar la columna durante 30 s y deseche el flujo a través.</li>
	<li>Agregue 700 s de ARN Wash Buffer directamente a la columna, centrifugar la columna durante 30 s y deseche el flujo.</li>
	<li>Añadir 400 l de búfer de lavado de ARN directamente a la columna, centrifugar la columna durante 2 minutos y transferir la columna a un tubo fresco sin RNase de 1,5 ml.</li>
	<li>Agregue 11 l de agua libre de RNase directamente a la columna sosteniendo la punta de la pipeta justo encima del filtro de columna y asegurándose de que el agua aterrice solo en el filtro de columna.</li>
	<li>Incubar la columna durante 1 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 min.</li>
	<li>Antes de desechar la columna, compruebe si hay flujo en el tubo libre de RNase. Si la elución se realizó correctamente, almacene la muestra a -80 oC o proceda inmediatamente con la preparación de la biblioteca. El volumen de elución total final de aproximadamente 10 l se utiliza para la construcción de la biblioteca. NOTA: Punto de parada: Deje el ARN a -80 oC durante un máximo de 7 días antes de continuar con la preparación de la biblioteca.</li>
</ol>3. Preparación de la biblioteca de circRNA
NOTA: Consulte Tabla de materiales para el kit, que contiene la mayoría de los reactivos utilizados en esta sección.
<ol><li>rRNA agotamiento y fragmentación<ol>
<li>Transfiera 10 ml de ARN purificado del paso 2.10 a un pozo limpio en una nueva placa PCR de 96 pocillos de 0,3 ml. Para el pozo, agregue 5 l de tampón de enlace de arnm seguido de una mezcla de eliminación de arRNA de 5 l. Pipetear suavemente 10 veces para mezclar.</li>
		<li>Sellar la placa e incubar durante 5 min a 68oC sobre un bloque termociclador preprogramado y precalentado. Después de la finalización de la incubación de 5 minutos, coloque la placa en el banco e incubar a temperatura ambiente durante 1 min.</li>
		<li>Retire el sello de la placa. Añadir 35 l de perlas de eliminación de ARN raxaaa a temperatura ambiente vórtice a la muestra. Ajuste la pipeta a 45 s y la pipeta hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces para mezclar bien. Placa de incubación durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Transfiera la placa a un soporte magnético e incubar en el soporte durante 1 min o hasta que la solución se despeje. Transfiera todo el sobrenadante (45 l) a un pozo nuevo en la misma placa, o placa nueva (dependiendo de cuántas muestras esté trabajando).</li>
		<li>Vortex las perlas de limpieza de ARN (ver Tabla de Materiales) hasta que estén bien dispersas, y añadir 99 l de perlas a cada muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10x para mezclar. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Transfiera la placa al soporte magnético e incubar 5 minutos adicionales o hasta que la solución se despeje. Retire y deseche todo el sobrenadante del pozo.</li>
		<li>Con la placa todavía en el soporte magnético, añadir 200 s de EtOH recién preparado 80% al pozo sin interrumpir las cuentas. Incubar durante 30 s, luego retirar y desechar el etanol. Repita el proceso para un total de 2 lavados.</li>
		<li>Agregue 11 ml de búfer de elución a cada pocto y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min, y luego transferir al soporte magnético hasta que la solución se despeje (1-5 min).</li>
		<li>Transfiera 8,5 l del sobrenadante del pozo a un pozo nuevo en la misma placa o a una placa nueva. Añadir 8,5 l de la mezcla Elute, Primer, Fragmento alto a cada pozo que contenga la muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.</li>
		<li>Sellar la placa e incubar durante 8 min a 94oC sobre un bloque termociclador preprogramado y precalentado. Retirar del termociclador cuando alcance los 4oC y centrifugar brevemente. NOTA: Proceda inmediatamente al protocolo CDNA Synthesize First Strand.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizar cDNA<ol>
<li>Para cada muestra que se esté preparando, mezcle la mezcla de síntesis de primera hebra de 9 l con 1 l de transcriptasa inversa (ver Tabla de materiales). Añadir 8 l de la mezcla a la muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 6 veces para mezclar.<ol>
<li>Sellar la placa e incubar en un bloque termociclador preprogramado y precalentado utilizando los siguientes parámetros: 25oC durante 10 min, 42oC durante 15 min, 70oC para 15 min, 4oC de retención. Proceda inmediatamente a la síntesis de la segunda hebra.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Añadir 5 l de tampón de resuspensión a cada muestra seguido de 20 l de mezcla maestra de marcado de segunda hebra. Pipetear todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 6 veces.</li>
		<li>Sellar la placa e incubar en un bloque termociclador preprogramado y precalentado ajustado a 16oC durante 1 h. Después de la incubación, retire la placa del termociclador y déjela a la temperatura ambiente.</li>
		<li>Cuentas de purificación de PCR vórtes (ver Tabla de Materiales)y añadir perlas de 90 l a cada pozo de muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Transfiera la mezcla de perlas/muestras al soporte magnético e incubar durante 5 min o hasta que el líquido se despeje. Retire y deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 200 l de 80% EtOH a cada muestra. Incubar muestras en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 30 s. Deseche el sobrenadante. Repita 1x.</li>
		<li>Deje que las perlas se sequen a temperatura ambiente durante 6 minutos y, a continuación, retírelas del soporte magnético.</li>
		<li>Resuspenda las perlas en 19,5 ml del tampón de resuspensión. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos, luego transferir al soporte magnético e incubar durante 1 min adicional o hasta que el líquido se despeje.</li>
		<li>Transfiera 17,5 l de sobrenadante a un pozo nuevo/placa nueva. NOTA: Si no procede inmediatamente, las muestras pueden almacenarse a -20 oC durante un máximo de 7 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la biblioteca<ol>
<li>Añadir 12,5 l de mezcla A-Tailing a cada pocal que contenga sobrenadante. Pipetear todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar.</li>
		<li>Incubar la reacción en un bloque termociclador preprogramado y precalentado ajustado a 37 oC utilizando los siguientes parámetros: 37 oC durante 30 min, 70 oC para 5 min, 4 oC de retención. Cuando las muestras alcancen los 4 oC, proceda inmediatamente a la ligadura del adaptador.</li>
		<li>A cada muestra añadir 2,5 ml de tampón de resuspensión, 2,5 ml de un adaptador de ARN único y 2,5 ml de mezcla de ligaduración. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10x para mezclar.</li>
		<li>Incubar muestras en un bloque termociclador preprogramado y precalentado a 30 oC durante 10 min.</li>
		<li>Agregue 5 ml de búfer Stop Ligation a cada muestra y pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar.</li>
		<li>Añadir 42 s l de perlas de purificación de PCR mixtas a cada muestra y mezclar bien. Siga los pasos 3.2.6 a 3.2.10, pero cambie el volumen de resuspensión a 52 s y el volumen de elución final a 50 s.</li>
		<li>Repita el protocolo de perlas de purificación de PCR de nuevo con la elución de 50 l de la etapa 3.3.6, pero cambie el volumen de resuspensión a 22 l y el volumen de elución final a 20 l. NOTA: Si no procede inmediatamente, las muestras pueden almacenarse a -20 oC durante un máximo de 7 días.</li>
		<li>Añadir 5 s de PCR Primer Cocktail y 25 l de PCR Master Mix a cada muestra. Mezclar pipeteando 10 veces. Incubar la reacción en un bloque termociclador preprogramado y precalentado utilizando los siguientes parámetros: 98 oC durante 30 s; a continuación, 8 ciclos de 98 oC para 10 s, 60 oC para 30 s y 72 oC para 30 s; luego 72 oC durante 5 min, luego 4 oC de retención. NOTA: La optimización del número total de ciclos de PCR puede ser necesaria para generar cantidades suficientes de biblioteca para la secuenciación.</li>
		<li>Siga el protocolo para la purificación de perlas de PCR (pasos 3.2.4 a 3.2.9), excepto añadir 50 l de perlas de purificación de PCR bien mezcladas y cambiar el volumen de resuspensión a 32,5 l con un volumen de elución final de 30 l. NOTA: Las muestras deben almacenarse a -20 oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación y Control de Calidad utilizando un analizador de ácido nucleico<ol>
<li>Permita que las cintas y los reactivos se equilibren a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Mezclar 2 l de biblioteca con 2 l de tampón HS D1000 y añadir a una placa de pozo compatible.</li>
		<li>Selle firmemente con sello de lámina compatible y vórtice durante 1 min a 2.000 rpm.</li>
		<li>Gire hacia abajo y cargue la placa en el analizador siguiendo las indicaciones de software. NOTA: Las bibliotecas deben tener aproximadamente 260 bp de tamaño.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Flujo de trabajo de análisis de datos
<ol><li>Secuenciar bibliotecas de ARN-seq (consulte Tabla de materiales) para generar lecturas de extremo emparejado de 82 bp. Convierta los datos de secuenciación sin procesar en forma de archivos basecall (.bcl) en FASTQ utilizando la herramienta bcl2fastq (v0.2.19).</li>
	<li>Detectar circARN. NOTA: Basándonos en la evidencia previamente reportada de que un enfoque de detección de círculos de conjunto funciona mejor en comparación con el uso de una sola herramienta de detección21,22, sugerimos el uso de múltiples herramientas para la detección de circRNA. Aquí, los circRNA se identificaron utilizando seis algoritmos de predicción de circRNA existentes: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE y DCC, aplicando la configuración de parámetros recomendada para cada algoritmo.<ol>
<li>Descargue e instale cada algoritmo de detección de círculos en un clúster informático de alto rendimiento de Linux utilizando las instrucciones proporcionadas por los desarrolladores.</li>
		<li>Alinee los TAq DE ARN-seq con el genoma de referencia (GRCh37), utilizando el alineador recomendado para cada herramienta.</li>
		<li>Después de la alineación, ejecute algoritmos de detección de círculos aplicando sus respectivos parámetros recomendados.</li>
		<li>Cada herramienta generará un archivo de resultados de varias columnas con la lista de círculos detectados, extraerá las coordenadas de circRNA y el número de lecturas de apoyo de esto con el fin de cuantificar el número de candidatos detectados en cada condición de muestra/prueba.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convierta la salida de coordenadas de circRNA por CIRI, Mapsplice y DCC en coordenadas basadas en 0 para que sean coherentes con los otros tres algoritmos.</li>
	<li>Seleccione los círculos circulares con dos o más lecturas de soporte o análisis y comparaciones posteriores. La Tabla 1 resume todos los parámetros evaluados en nuestro estudio junto con el número total de lecturas de secuenciación generadas para cada muestra.</li>
	<li>Para cada condición de muestra/prueba, cuente el número de circRNAs detectados normalizados en el número de lecturas asignadas generadas para esa biblioteca, por millón. Resuma los resultados en las distintas herramientas/muestras en las gráficas de cuadro, como se detalla en los Resultados representativos.</li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733(2012).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li>
<li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li>
<li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrambled+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).</li>
<li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li>
<li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li>
<li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p%2FmiR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919(2016).</li>
<li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIRI%3A+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MapSplice%3A+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).</li>
<li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).</li>
<li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant%2C+conserved%2C+and+dynamically+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li>
<li>Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).</li>
<li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).</li>
<li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACValidator%3A+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li>
<li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circular+RNAs%3A+bioinformatic+and+experimental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li>
<li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).</li>
<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, se probaron dos kits de preparación de bibliotecas disponibles comercialmente, opciones de pretratamiento y cantidades de ARN de entrada con el fin de optimizar un protocolo de enriquecimiento de circRNA para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA. Sobre la base de las evaluaciones de este estudio, una serie de aspectos clave y pasos críticos en la creación de bibliotecas de secuenciación de circRNA son evidentes. Nuestra evaluación confirma la utilidad del pretratamiento RNase R, com...

Los ARN circulares (ArnNA) son ARN endógenos y no codificantes que han ganado atención dada su expresión generalizada en el transcriptoma eucariota1,2,3. Se forman cuando los exons se empalman entre sí y por lo tanto se consideraron inicialmente como artefactos de empalme4,5. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los circRNAs exhiben tipo de célula, tejido y etapa específica del desarrollo expresión específica3,6 y se conservan evolutivamente2,3. Además, participan en la mediación de interacciones proteína-proteína7,la unión de microARN (miRNA)3,8,9,10, y la regulación de la transcripción genética parental11.
En la secuenciación clásica de ARN (RNA-seq), los círculos pueden perderse por completo durante la construcción de la biblioteca como resultado de la selección de poli-A para ARNm o pueden ser difíciles de aislar dada su baja abundancia. Sin embargo, estudios recientes de caracterización de circRNA han incorporado un paso de pretratamiento utilizando RNase R con el fin de enriquecer para circRNAs2,12,13. RNase R es una exoribonucleasa que digiere los ARN lineales, dejando atrás estructuras circulares de ARN. Los protocolos de enriquecimiento de CircRNA se optimizaron generando y comparando datos de dos kits de construcción de bibliotecas de transcriptomes completos disponibles comercialmente, con y sin un paso de pretratamiento RNase R, y utilizando cantidades variables de entrada total de ARN (1 a 4 g). El protocolo optimizado se utilizó a continuación para evaluar la abundancia de circRNAs en cinco regiones cerebrales diferentes (cerebelo [BC], lóbulo parietal inferior [IP], giso temporal medio [MG], corteza occipital [OC] y gros frontal superior [SF]) y otros cuatro tipos de tejido (hígado [LV], pulmón [LU], ganglio linfático [LN] y páncreas [PA]). Las bibliotecas RNA-seq se emparejaron secuenciadas finales y los datos se analizaron utilizando seis algoritmos de predicción de circRNA diferentes: find_circ3, CIRI14,Mapsplice15,KNIFE16, DCC17y CIRCexplorer18. Según nuestro análisis, se detectó el mayor número de circRNAs únicos cuando se utilizó un kit de preparación de la biblioteca de ARN total varado con pretratamiento RNase R y ARN de entrada total de 4 g. El protocolo optimizado se describe aquí. Como se informó anteriormente19,20, el mayor enriquecimiento de los círculos en el cerebro en comparación con otros tipos de tejido.

<table><tbody><tr><td>1.000 y micro; L puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Puntas de pipeta</td><td>L Rainin</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Accesorios (cubiertas de lámina)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Accesorios (puntas)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>Película adhesiva para microplacas</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads 450 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Purificación por PCR</td></tr><tr><td>Placas de PCR Eppendorf twin.tec de 96 pocillos</td><td>Reactivos</td><td></td> D1000 de alta sensibilidad 951020401 <td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de pantalla D1000 de alta sensibilidad</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sistema de secuenciación</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000 Sistema de secuenciación</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Total RNA Kit</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de grado de biología molecular</td><td>Centro</td><td></td> de suministro de tubos de ensayo de BP28184 <td></td></tr><tr><td>qubits</td> de Fisher Scientific de <td>Thermo Fischer</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr>Centro de suministro de<td>kit de ensayo de alto sentido qubit dsDNA</td><td>de Thermo Fischer</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Limpieza y concentrador de ARN - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>Contiene columnas de purificación, tubos de recolección</td></tr><tr><td>Perlas RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td> Perlas de limpieza de <td></td><td>ARN</td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II transcriptasa inversa 10.000 unidades</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200 Analizador</td> de <td>ácidos nucleicos</td>de <td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>Kit de preparación de bibliotecas de ARN total trenzado TruSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>20020596 Kit utilizado en la sección 3</td></tr><tr><td>Bandeja dividida de dos compartimentos</td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td>Centro de suministro de</tr><tr><td>agua ultrapura</td> de <td>Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>ARN de control universal</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de arn circulares mediante secuenciación de arn

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Los ARN circulares (circARN) son una clase de ARN no codificantes que participan en funciones que incluyen la regulación del microARN (miRNA), la mediación de interacciones proteínas y proteínas y la regulación de la transcripción genética parental. En la secuenciación clásica de ARN de próxima generación (RNA-seq), los círculos se pasan por alto típicamente como resultado de la selección de poli-A durante la construcción de bibliotecas de ARNm, o se encuentran en muy baja abundancia, y por lo tanto son difíciles de aislar y detectar. Aquí, se optimizó un protocolo de construcción de la biblioteca de circRNA comparando kits de preparación de bibliotecas, opciones de pretratamiento y varias cantidades totales de entrada de ARN. Se probaron dos kits de preparación de bibliotecas de transcriptomes completos disponibles en el uso comercial, con y sin pretratamiento de RNase R, y utilizando cantidades variables de entrada total de ARN (1 a 4 g). Por último, múltiples tipos de tejido; incluyendo hígado, pulmón, ganglio linfático y páncreas; así como múltiples regiones cerebrales; incluyendo el cerebelo, el lóbulo parietal inferior, el giso temporal medio, la corteza occipital y el giso frontal superior; se compararon para evaluar la abundancia de circARN a través de tipos de tejidos. El análisis de los datos de ARN-seq generados utilizando seis herramientas diferentes de detección de ARN (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC y CIRCexplorer) reveló que un kit de preparación de la biblioteca de ARN total varado con pretratamiento RNase R y entrada de ARN de 4 g es el óptimo método para identificar el mayor número relativo de circRNAs. De acuerdo con los hallazgos anteriores, se observó el mayor enriquecimiento de los circRNAs en los tejidos cerebrales en comparación con otros tipos de tejidos.

Los datos generados utilizando un ARN de control universal (UC) disponible comercialmente y utilizando dos kits de preparación de bibliotecas, que incluyen un paso de agotamiento de riboentos en sus protocolos, se evaluaron por primera vez. Utilizando un flujo de trabajo analítico (flujo de trabajo de análisis de datos, sección 4), en general, se detectó un mayor número de círculos en los conjuntos de datos TruSeq en comparación con los de Kapa (Figura 1). Aunque los porcentajes de ARN ribos...

Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Este protocolo es el resultado de evaluar aspectos clave de la preparación de la biblioteca circRNA, como el tipo de kit, el tratamiento RNase R, las cantidades de entrada y su impacto en la detección de circRNA. Permite una detección óptima de circRNA y proporciona datos sobre parámetros ajustables en función de las necesidades del usuario. Identificar los circRNAs en diferentes tipos de muestras nos ayudará a comprender mejor la distribución de su expresión y establece el escenario para delinear el papel funcional de estas moléculas.Este método se puede aplicar a cualquier muestra total de ARN. Es importante mantener las muestras de ARN en hielo antes de comenzar el protocolo. Evalúe los valores RIN y DV200 en el Bioanalyzer Agilent o TapeStation antes de la preparación, y siga los procedimientos adecuados al trabajar con ARN.Comience diluyendo el ARN total a cuatro microgramos en 39 microlitros de agua libre de RNase y pipeteándolo arriba y abajo para mezclar. En un tubo separado, utilice 1 tampón RNase R para diluir la RNase R a una concentración de trabajo de dos unidades por microlitro. Pipeta 39 microlitros de ARN total y cinco microlitros de 10x RNase R Reaction Buffer en un tubo de reacción de 1,5 microlitros, y mezclar.Añadir seis microlitros de la RNase R.Then ajuste la pipeta al volumen de reacción completo, y mezcle la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Coloque el tubo en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 10 minutos, asegurándose de que todo el volumen de reacción esté sumergido en el baño de agua. A continuación, coloque el tubo sobre hielo e inmediatamente proceda con la limpieza y concentración de ARN.Antes de empezar, prepare el tampón de lavado de ARN mezclando el concentrado con 48 mililitros de 100% etanol, y coloque las columnas de purificación en los tubos de recolección. Cuando esté listo, agregue dos volúmenes de búfer de enlace de ARN a la muestra tratada con RNase R y mezcle bien. Agregue 150 microlitros de 100% etanol a la mezcla para un total de 300 microlitros, transfiera todo el volumen a la columna y centrifugar durante 30 segundos.Elimine el flujo a través y agregue 400 microlitros de RNA Prep Buffer directamente a la columna. Centrifugar durante 30 segundos y deseche el flujo a través. A continuación, agregue 700 microlitros de RNA Wash Buffer a la columna, centrifugar durante 30 segundos y deseche el flujo a través.Agregue otras 400 microlitros del wash Buffer, centrifugar durante dos minutos, y transfiera la columna a un tubo fresco de 1,5 mililitros sin RNase. Agregue cuidadosamente 11 microlitros de agua libre de RNase directamente a la columna sosteniendo la punta de la pipeta justo encima del filtro de columna. Deje reposar la muestra durante un minuto a temperatura ambiente y luego centrifugarlo durante un minuto.Asegúrese de que haya flujo a través del tubo de 1,5 mililitros y deseche la columna. La muestra de ARN purificado puede almacenarse a menos 80 grados centígrados o utilizarse inmediatamente para la preparación de la biblioteca. Transfiera 10 microlitros del ARN total purificado a un pozo limpio en una placa PCR de 96 pozos.Añadir cinco microlitros de rRNA Binding Buffer seguidos de cinco microlitros de rRNA Removal Mix, luego pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar los reactivos. Selle la placa e ibloquela durante cinco minutos a 68 grados centígrados en un bloque termociclotro preprogramado y precalentado. Después de la incubación, deje reposar la placa a temperatura ambiente durante un minuto.Retire el sello de la placa y agregue 35 microlitros de perlas de extracción de ARN de temperatura ambiente con vórtices a la muestra. Ajuste la pipeta a 45 microlitros, y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces para mezclar a fondo. Deje que la placa se siente a temperatura ambiente durante un minuto.Transfiera la placa a un soporte magnético e imagíe allí durante un minuto o hasta que la solución se despeje. Transfiera el sobrenadante a un nuevo pozo en el plato. A continuación, transfiera la placa del soporte magnético al soporte de la placa.Cuentas de limpieza de ARN vortex hasta que estén bien dispersas, y agregue 99 microlitros de cuentas a la muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar, e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera la placa al soporte magnético, y déjela allí durante cinco minutos o hasta que la solución se aclare, luego retire y deseche todo el sobrenadante del pozo.Con la placa todavía en el soporte magnético, añadir 200 microlitros de 80% etanol recién preparado al pozo sin interrumpir las perlas. Deje el etanol en el pozo durante 30 segundos, luego retírelo y deséchelo. Agregue 11 microlitros de Elution Buffer al pozo, y pipetearlo arriba y abajo para mezclar.Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos minutos, luego transferirla de vuelta al soporte magnético, y mantenerla allí hasta que la solución se despeje. Transfiera 8,5 microlitros del sobrenadante a un nuevo pozo en la misma placa, y agregue 8,5 microlitros de Elute, Primer, Fragment High Mix a cada pozo que contenga una muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar bien, sellar la placa e incubar durante ocho minutos en un termociclador precalentado a 94 grados centígrados.Enfríe la muestra a cuatro grados centígrados, retire la placa del termociclo y centrifugar brevemente. Se evaluaron dos kits de preparación de bibliotecas, TruSeq y KAPA, para este protocolo. En general, se detectó un mayor número de ARN circulares y un menor porcentaje de ARN ribosomal cuando se utiliza el kit TruSeq, por lo que TruSeq fue seleccionado para otros experimentos.La importancia del pretratamiento de RNase R se evaluó comparando los datos generados a partir de bibliotecas pretratadas y no pretratadas. Como era de esperar, se identificó sistemáticamente un mayor número de ARN circulares en las bibliotecas pretratadas en comparación con las no pretratadas. La cantidad de ARN de entrada se optimizó para detectar una mayor diversidad de ARN circulares.Las bibliotecas se prepararon utilizando uno, dos y cuatro microgramos de ARN de entrada, y se observó la mayor diversidad de especies de ARN circular cuando se utilizaban cuatro microgramos de ARN total. El protocolo optimizado se utilizó para comparar las abundancias circulares de ARN en cinco regiones cerebrales de cuatro donantes sanos y para otros tipos de tejidos de seis donantes sanos. En general, se observó una mayor abundancia de ARNa circular en el cerebro en comparación con otros tipos de tejido.Es importante recordar seguir los procedimientos apropiados cuando se trabaja con ARN, incluyendo el uso de guantes, limpiar a fondo el banco y las pipetas con toallitas RNase o aerosol antes de comenzar el protocolo, y mantener el ARN en hielo de antemano. Después de este procedimiento, se puede realizar la validación ortogonal como la secuenciación de Sanger de cruces de circRNA identificados. El descubrimiento de nuevos circRNAs y más evidencia de su presencia tallan una nueva área de investigación para explorar sus funciones biológicas.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Clonamos y analizamos genes de reportero generando ARN circulares. Estos genes reporteros son más grandes que las construcciones para analizar el empalme lineal y contener elementos Alu. Para investigar los ARN circulares, las construcciones se transinfectan en células y el ARN resultante se analiza utilizando RT-PCR después de la eliminación del ARN lineal.

Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer los sitios endógenos de unión al ARN o "huellas" de los complejos de ARN:proteína (RNP) de células de mamíferos. Este enfoque implica dos inmunoprecipitaciones de subunidades RNP y por lo tanto se denomina inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT).

Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

Presentamos una estrategia circular basada en RT-PCR combinando RT-PCR circular, RT-PCR cuantitativo, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5' y mancha norte. Este protocolo incluye un paso de normalización para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5', y es adecuado para discriminar y mapear las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en el mitocondrion de maíz.

Discriminción y mapeo de las transcripciones primarias y procesadas en mitocondrion de maíz utilizando una estrategia circular basada en RT-PCR

Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.

Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

El protocolo presentado aquí explica la tubería in silico completa necesaria para predecir y caracterizar funcionalmente circRNAs a partir de datos de transcriptoma de secuenciación de ARN que estudian las interacciones huésped-patógeno.

In Silico Identificación y caracterización de circRNAs durante las interacciones huésped-patógeno

La secuenciación de ARN de cuantificación absoluta (AQRNA-seq) es una tecnología desarrollada para cuantificar el panorama de todos los ARN pequeños en mezclas biológicas. Aquí, se demuestran los pasos de preparación de la biblioteca y procesamiento de datos de AQRNA-seq, cuantificando los cambios en el grupo de ARN de transferencia (ARNt) en Mycobacterium bovis BCG durante la latencia inducida por inanición.

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

secuenciación de una sola célula es una herramienta cada vez más popular y accesible para hacer frente a los cambios genómicos en alta resolución. Proporcionamos un protocolo que utiliza la secuenciación de una sola célula para identificar alteraciones en el número de copias en las células individuales.

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Aquí, se detalla el método de S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH), que permite el genoma de la cartografía de todo el intramolecular y intermolecular RNA-ARN interacciones in vivo . SPLASH puede ser aplicado para estudiar interactones de ARN de organismos incluyendo levaduras, bacterias y seres humanos.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Galaxy y David se han convertido en herramientas populares que permiten a los investigadores sin formación bioinformática para analizar e interpretar los datos de RNA-Seq. Se describe un protocolo para C. elegans los investigadores realizar RNA-Seq experimentos, acceder y procesar el conjunto de datos usando Galaxy y obtener información biológica significativa de las listas de genes usando DAVID.

Análisis de transcriptómica<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; ARN secuencia de datos a través de la suite smoking en el Proyecto Galaxy

Describimos a una plataforma de análisis de ARN de transferencia original llamada SPOt (plataforma optimizada para la observación de tRNA). Lugar simultáneamente mide los niveles celulares de todos los tRNAs en muestras biológicas, en sólo tres pasos y en menos de 24 horas.

Etiquetado metabólico y perfiles de RNAs de transferencia utilizando Macroarrays

Aprende a preparar bibliotecas de secuenciación de ARN circular usando tratamiento con RNase R y evaluación de parámetros óptimos. Este método permite identificar circRNAs en muestras de ARN total para estudios de biología del ARN.

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Explorar más videos