Name: Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios mediante alimentación de anticuerpos. Este protocolo permite analizar internalización y reciclaje para comprender la plasticidad sináptica.

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Agradecemos al Northwestern Center for Advanced Microscopy por el uso del microscopio Nikon A1 Confocal y su asistencia en la planificación y análisis de los experimentos. Esta investigación fue apoyada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), y NIA (R00AG041225) y una Beca de Investigador Joven NARSAD de la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento (#24133) (A. S. -C.).

El Trabajo relacionado con la preparación del cultivo primario hipocampal fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern (protocolo #IS00001151).
1. Preparación antes del etiquetado
<ol><li>
Preparación y mantenimiento de las culturas primarias del hipocampo
	<ol>
<li>Preparar cultivos primarios de hipocampo a una densidad de 150.000 células chapadas en gafas de cubierta recubiertas de poli-D-lisina (0,1 mg/ml) de 18 mm. Excelentes guías para la preparación disociada del cultivo neuronal están disponibles7,8. NOTA: Si es necesario, los cultivos pueden ser tratados con citosina arabinósido (Ara-C, 10 mM de DIV1) para evitar la proliferación glial en la preparación. NOTA: Se pueden utilizar reactivos de recubrimiento alternativos como la fibronectina (1 mg/ml) o laminina (5 mg/ml) en lugar de poli-D-lisina.</li>
		<li>Mantener los cultivos en una incubadora celular a 37oC y 5% CO2 en 2 mL/pozo de medios neurobasales complementados con B27 y 2 mM de L-glutamina. NOTA: Se pueden utilizar sustitutos de L-glutamina (por ejemplo, Glutamax), si se desea.</li>
		<li>Cada semana, eliminar la mitad del volumen de medios y reemplazar con el mismo volumen de medios neurobasales suplementados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPCIONAL: Transfección de receptores mutados y/o etiquetados con epítopos NOTA: Las neuronas deben ser transfectó al menos 3-4 días antes del punto de tiempo de análisis para permitir la expresión del receptor. El uso de neuronas jóvenes [Días in vitro 6–9 (DIV6–9)] da como resultado una mejor eficiencia de transfección que las neuronas más antiguas (DIV15–20), pero se puede lograr un número suficiente de células transinfectantes (>20) independientemente del DIV empleado.<ol>
<li>Para cada pozo de una placa de 12 pocillos, diluir 1,5 g de plásmido que contenga la construcción de interés en 100 ml de medios neurobasales frescos sin b27 o suplementos de glutamina en un tubo de microcentrífuga y mezclar por vórtice rápidamente. NOTA: Para una transfección exitosa, es fundamental que los medios neurobasales utilizados sean lo más frescos posible, idealmente menos de 1 semana después de la apertura del frasco.</li>
		<li>En un segundo tubo de microcentrífuga, mezcle 1 l de un reactivo de lipofección adecuado en 100 ml de medios neurobasales frescos y mezcle suavemente. NOTA: No vórtice la mezcla de reactivos de lipofección. El uso de reactivos de lipofección frescos puede mejorar la eficiencia de la transfección.</li>
		<li>Incubar los tubos durante 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Añadir la mezcla de reactivo de lipofección en forma abisal a la mezcla de ADN, mezclar suavemente e incubar durante 20 minutos a RT.</li>
		<li>Ajuste el volumen de medios en cada pocel a 1 ml de soporte acondicionado.</li>
		<li>Añadir el reactivo de lipofección -Mezcla de ADN gota en el pozo.</li>
		<li>Devolver las células a la incubadora y permitir al menos 3-4 días para la expresión de proteínas. NOTA: A los efectos de los protocolos de internalización y reciclaje descritos a continuación, las neuronas del hipocampo fueron transfectó en DIV11–12 con construcciones que expresaban GluN2B etiquetadas con GFP en el dominio extracelular (GFP-GluN2B) e imágenes en DIV15–16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPCIONAL: Incubación de células con fármacos (crónica o agudamente) en los medios acondicionados hasta la fijación. NOTA: Para el tratamiento agudo, comience a tratar las células antes de etiquetarlas. Dependiendo del protocolo de tratamiento de drogas utilizado, las células se pueden mantener en medios que contienen drogas durante la sección 2. En nuestro ejemplo, las células DIV21 estaban sujetas a un protocolo cLTP para aumentar AMPAR9expresado en superficie.<ol>
<li>Intercambio de medios condicionados para la solución extracelular (ECS).</li>
		<li>Tratar las células con glicina de 300 m en ECS durante 3 min a RT. Como control, trate a una cubierta hermana con ECS (sin glicina).</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con ECS de 37 oC y devolver las células en ECS (sin glicina) a la incubadora de células durante 20 minutos antes de continuar con la sección 2. NOTA: ECS (en mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 Glucosa, 0.001 TTX, 0.01 estricnina, y 0.03 picrotoxina a pH 7.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Etiquetado en vivo de receptores expresados en superficie
<ol><li>
Preparar los cubreobjetos para el etiquetado
	<ol>
<li>Para guardar los reactivos y facilitar la manipulación, transfiera el lado de la celda de coverslips hasta una bandeja cubierta de película de parafina. NOTA: Es fundamental que nunca deje que las muestras se sequen.</li>
		<li>Guardar y mantener los medios acondicionados a 37oC para los pasos de incubación y lavado. NOTA: Para un cubreobjetos de 18 mm, se recomienda la incubación con 75-100 ml de medios para el etiquetado de anticuerpos y 120–150 l para internalización/reciclaje.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado de receptores de superficie con anticuerpo primario
	<ol>
<li>Incubar células con anticuerpo primario diluido en medios acondicionados durante 15 min a RT. NOTA: Para los receptores etiquetados con GFP, se utilizó anticuerpo anti-GFP de conejo a una dilución de 1:1000. Para GluA1 endógeno, se utilizó un ratón anti-GluA1 a una dilución de 1:200.</li>
		<li>Aspirar cuidadosamente el medio que contiene anticuerpos utilizando una pipeta de vacío y lavar las células tres veces con medios acondicionados. NOTA: Si los medios acondicionados no están disponibles, todos los pasos de lavado se pueden realizar utilizando PBS+ [sal insa tamponada de fosfato (PBS) que contiene 1 mM MgCl2 y 0,1 mM CaCl2]. La aspiración manual con un micropipeta se puede realizar si no se dispone de una aspiración de vacío suave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Expresión de superficie (Figura 2)
<ol><li>
Etiquetado secundario de anticuerpos de receptores expresados en superficie
	<ol>
<li>Lavar una vez con PBS+.</li>
		<li>Arreglar las células incubando con 4% de paraformaldehído (PFA) y 4% sacarosa en PBS durante 7-8 min. NOTA: A diferencia de otros métodos de fijación como la incubación de metanol, PFA no permeabiliza la membrana plasmática y, por lo tanto, es adecuado para el análisis de la expresión superficial. Para obtener resultados óptimos, utilice PFA recién preparado. El almacenamiento a corto plazo de PFA a 4 oC o a largo plazo (hasta 30 días) de almacenamiento a -20 oC es permisivo para una fijación adecuada. PRECAUCION: La PFA es un carcinógeno conocido. Utilice el equipo de protección personal adecuado y una capucha de seguridad cuando manipule.</li>
		<li>Lave las células tres veces con PBS regular. NOTA: Alternativamente, 0.1 M glicina se puede utilizar para lavar PFA en lugar de PBS, ya que la glicina apagará cualquier fijador restante que pueda aumentar el fondo en la preparación.</li>
		<li>Bloquear sitios de unión inespecíficos incubando con 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBS durante 30 min a RT. NOTA: El tiempo de bloqueo se puede extender sin efectos adversos en el etiquetado.</li>
		<li>Incubar con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente diluidos en 3% NGS en PBS durante 1 h a RT para etiquetar receptores primarios etiquetados con anticuerpos (es decir, expresados en la superficie). NOTA: En estos ejemplos, se utilizó una dilución 1:500 de anticuerpos secundarios conjugados por Alexa 555: anticonejo de cabra para receptores etiquetados por GFP y antiratón de cabra para GluA1.</li>
		<li>Lave las células con PBS 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado de receptores intracelulares
	<ol>
<li>Permeabilizar celdas con 0.25% Triton X-100 en PBS durante 5-10 min en RT. NOTA: Para comprobar que la ronda inicial de etiquetado de anticuerpos ocupa todos los epítopos de superficie, este paso de permeabilización se puede omitir en una cultura hermana. En este caso, no se debe obtener ninguna señal para los receptores intracelulares. Además, para comprobar que no se han etiquetado receptores internos en la sección 2 anterior (es decir, que muestra la integridad de las membranas plasmáticas en el cultivo), el paso de permeabilización se puede omitir en un cultivo hermano, y un anticuerpo primario contra un proteína intracelular (por ejemplo, PSD-95 o MAP2) se puede utilizar en el paso 2.2.1. No se debe obtener ninguna señal de este primario en estas condiciones. En este caso, se utilizó un anticuerpo anti-PSD-95 de conejo (1:500).</li>
		<li>Bloque con 10% NGS en PBS durante 30 min en RT.</li>
		<li>Etiquetar los receptores intracelulares mediante la incubación de células permeabilizadas con el mismo anticuerpo primario utilizado en la sección 2.2 diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT. NOTA: La dilución de anticuerpos para el etiquetado de receptores intracelulares puede ser diferente de la necesaria para etiquetar receptores expresados por la superficie. En el ejemplo de GluA1, se utilizó la misma dilución de anticuerpos (1:200).</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS.</li>
		<li>Etiqueta con el segundo anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT. NOTA: En estos ejemplos, se utilizó una dilución 1:500 de anticuerpo secundario conjugado por Alexa 647 de cabra (para GluA1).</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Internalización (Figura 3)
<ol><li>
Internalización de receptores superficiales etiquetados con anticuerpos
	<ol>
<li>Después del etiquetado de los receptores expresados en la superficie y el lavado de anticuerpos (sección 2.2), mantenga las células en medios acondicionados sin anticuerpos y devuélvalas a la incubadora (37 oC) para permitir la internalización. NOTA: Para los receptores NMDA, se recomienda n.o 30 min para la internalización. Como control, se puede mantener una cultura hermana con medios acondicionados a 4 oC durante el proceso de internalización. La internalización mínima del receptor debe ocurrir en estas condiciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado de receptores de superficie
	<ol>
<li>Lave las células una vez con PBS+.</li>
		<li>Fijar células con 4% PFA y 4% sacarosa en PBS durante 7-8 min. PRECAUCION: Utilice un equipo de protección personal adecuado y una campana de seguridad cuando manipule PFA.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS regular.</li>
		<li>Bloquee con 10% NGS en PBS durante 30 minutos en RT para evitar la unión inespecífica.</li>
		<li>Incubar muestras con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente diluidos en 3% NGS en PBS durante 1 h a RT para etiquetar receptores primarios etiquetados con anticuerpos (es decir, receptores expresados en superficie que no fueron internalizados). NOTA: En este ejemplo, se utilizó el anticuerpo secundario anticonejo de cabra conjugado Alexa 555 (1:500) para el etiquetado.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado de receptores internalizados
	<ol>
<li>Permeabilizar celdas con 0.25% Triton X-100 en PBS durante 5-10 min.</li>
		<li>Bloquear la unión inespecífica por incubación con 10% NGS en PBS durante 30 min a RT.</li>
		<li>Incubar muestras con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente diluidos en 3% NGS en PBS durante 1 h a RT para etiquetar receptores con etiqueta de anticuerpos internalizados. NOTA: En este ejemplo, se utiliza el anticuerpo secundario anticonejo de cabra conjugado Alexa 647 (1:500) para el etiquetado.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Reciclaje (Figura 4)
<ol><li>
Internalización de receptores superficiales etiquetados con anticuerpos
	<ol>
<li>Después del etiquetado de los receptores expresados en la superficie y el lavado de anticuerpos (sección 2.2), mantenga las células en medios acondicionados sin anticuerpos y devuélvalas a la incubadora (37 oC) para permitir la internalización. NOTA: Para los receptores NMDA, se recomienda n.o 30 min para la internalización.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloqueo de receptores de superficie estable expresados
	<ol>
<li>Para bloquear los epítopos en el anticuerpo primario unido a receptores expresados en superficie que no se han internalizado, incubar células con fragmentos de anticuerpos Fab anti-IgG (H+L) no conjugados (contra los primarios utilizados en la sección 2.2) diluidos en medios acondicionados ( 20 g/ml) durante 20 min a RT. Este tratamiento evita la interacción futura con anticuerpos secundarios. NOTA: Para este ejemplo, se utilizaron fragmentos de Fab anticonejo de cabra. NOTA: Experimento de control: para asegurar que se ha producido un bloqueo completo de los receptores expresados en la superficie, los cubreobjetos de las hermanas se pueden incubar con y sin Fab. Los cultivos deben fijarse inmediatamente después del tratamiento con Fab, y ambos cultivos se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 555. Ninguna señal Alexa 555 en las células incubadas por Fab indica un bloqueo adecuado de anticuerpos.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con medios acondicionados.</li>
		<li>Incubar células con medios acondicionados que contengan un dinaso de 80 m para evitar una mayor internalización y devolver las células a la incubadora (37 oC) para permitir el reciclaje de receptores internalizados. Dynasore es un inhibidor de GTPase que inhibe la dinamina y por lo tanto previene la internalización. NOTA: Se recomienda 45 minutos para el reciclaje NMDAR. Tenga en cuenta que Dynasore bloquea exclusivamente el proceso de internalización dependiente de dinamina (por ejemplo, internalización de NMDAR). Sin embargo, la internalización de otras proteínas sinápticas (independientes de la dinamina) todavía puede ocurrir en presencia de Dynasore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado de receptores reciclados
	<ol>
<li>Lave las células una vez con PBS+.</li>
		<li>Fijar células con 4% PFA y 4% sacarosa en PBS durante 7-8 min. PRECAUCION: Utilice un equipo de protección personal adecuado y una campana de seguridad cuando manipule PFA.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS.</li>
		<li>Bloquee con 10% NGS en PBS durante 30 minutos en RT para evitar la unión inespecífica.</li>
		<li>Etiquetar las células con el primer anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT. NOTA: En este ejemplo, se utilizó el anticuerpo anticonejo de cabra conjugado por Alexa 555 (1:500) para el etiquetado.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS. NOTA: Lavados más largos con PBS (5-10 min) pueden ayudar a reducir el fondo en la preparación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado de receptores internalizados
	<ol>
<li>Permeabilizar celdas con 0.25% Triton X-100 en PBS durante 5-10 min.</li>
		<li>Bloque con 10% NGS en PBS durante 30 min en RT.</li>
		<li>Etiqueta con el segundo anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente diluido en 3% NGS en PBS durante 1 h en RT. NOTA: En este ejemplo, se utilizó el anticuerpo anticonejo de cabra conjugado por Alexa 647 (1:500) para el etiquetado.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Montaje e imágenes de muestras
<ol><li>Monte las celdas colocando suavemente las cubiertas del lado de la celda hacia abajo en 12-15 ml del soporte de montaje adecuado. NOTA: La aspiración de exceso de medios de montaje mejorará la calidad de las imágenes.</li>
	<li>Imagen de células en un microscopio confocal apropiado. NOTA: Se recomienda crear una imagen de una pila z con un aumento de 60x con pasos de 0,35 m, que abarcan todo el grosor de la neurona.</li>
</ol>7. Consideraciones de tiempo
<ol><li>Este es un protocolo largo que se puede detener en varios puntos. Si lo desea, realice pasos de bloqueo e incubación de anticuerpos primarios durante la noche a 4 oC en una cámara húmeda.</li>
	<li>
Alternativamente, si lo desea, utilice un procesador de tejido de microondas para acelerar enormemente los tiempos de incubación después de la fijación. Para todos los pasos, utilice 150 W a 30 oC para la configuración "Activado".
	<ol>
<li>Para bloquear, ejecute el procesador a 2 min "On", 1 min "Off", y 2 min "On."</li>
		<li>Para los pasos de incubación de anticuerpos primarios y secundarios, ejecute el procesador a 3 min "On", 2 min "Off" y 3 min "On." NOTA: No observamos ninguna diferencia de calidad haciendo las alteraciones anteriores al protocolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Análisis de imágenes
<ol><li>Se recomienda utilizar FIJI <https://fiji.sc/> para realizar análisis de imágenes, ya que es compatible con varios formatos de archivo. Para nuestros datos, se adquirieron imágenes en el formato de archivo Nikon ND2.</li>
	<li>Se proporciona un script de macro para facilitar la cuantificación por lotes de diferentes parámetros preseleccionados por FIJI. Los siguientes pasos se incluyen en la macro: NOTA: Para estos ejemplos, se midió la "intensidad integrada".</li>
	<li>Abra los archivos de imagen en FIJI y canales separados.</li>
	<li>Proyecto Z de cada pila de canales como una proyección de intensidad máxima.</li>
	<li>Establezca un umbral inferior para cada canal. NOTA: Los umbrales deben determinarse empíricamente para cada conjunto de datos experimentales. Aunque cada canal puede tener un valor de umbral inferior independiente, es crucial que los valores de umbral de canal se mantengan de forma coherente para todas las imágenes del mismo conjunto de datos.</li>
	<li>Seleccione de tres a cinco dendritas secundarias o terciarias y guárdelas como regiones de interés (ROI).</li>
	<li>Mida la densidad integrada de cada ROI en canales de superficie e intracelulares.</li>
	<li>Normalizar la señal para cada ROI dividiendo el valor de densidad integrado del canal de superficie por el canal intracelular.</li>
	<li>Repita las mediciones de todas las imágenes de control y experimentales y normalice los valores experimentales para controlar los valores (por ejemplo, GluN2B WT o condiciones de no glicina).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La interacción entre una célula y su entorno (por ejemplo, la comunicación con otras células, la respuesta a diferentes estímulos, etc.), depende en gran medida de la expresión correcta de los receptores en la superficie celular. La regulación rápida y ajustada en el contenido del receptor expresado en la superficie permite una respuesta celular adecuada a un entorno en constante cambio. En el caso particular de las neuronas, las alteraciones en el número, la localización y la composición de subunidades de los receptores...

Las células utilizan el proceso activo de tráfico para movilizar proteínas a localizaciones subcelulares específicas y ejercer una estricta regulación espaciotemporal sobre su función1. Este proceso es especialmente importante para los receptores transmembrana, ya que las respuestas celulares a diferentes estímulos ambientales dependen de cascadas intracelulares desencadenadas por la activación del receptor. Las células son capaces de modificar estas respuestas alterando la densidad, localización y composición de subunidades de los receptores expresada en la superficie celular a través de la regulación del tráfico subcelular de receptores2. La inserción de receptores recién sintetizados en la membrana plasmática, junto con la endocitosis y el reciclaje delos receptores existentes son ejemplos de procesos de tráfico que determinan el conjunto neto de receptores expresados en superficie 2. Muchos mecanismos moleculares cooperan para regular el tráfico de proteínas, incluidas las interacciones proteína-proteína y las modificaciones posttranslacionales, como la fosforilación, la ubiquitinación o la palmitoylación2.
La regulación del tráfico de receptores es particularmente necesaria en células fuertemente polarizadas con estructuras altamente especializadas. El ejemplo paradigmático es el control de la función neuronal mediante el tráfico regulado de receptores de glutamato (GluRs)3,4. El glutamato, el principal neurotransmisor excitatorio, se une y activa los GluRs expresados por la superficie para controlar las funciones neuronales fisiológicas fundamentales como la neurotransmisión sináptica y la plasticidad sináptica. El hecho de que se haya observado el tráfico de GluR alterado en un amplio espectro de neuropatías, que van desde trastornos del neurodesarrollo hasta enfermedades neurodegenerativas, pone de relieve la importancia de este proceso5. Por lo tanto, entender los eventos moleculares que controlan el tráfico de GluR es de interés en muchas áreas de investigación.
En este protocolo, se utiliza un método basado en la alimentación de anticuerpos para cuantificar el nivel de GluRs expresados por la superficie en las neuronas primarias del hipocampo, así como evaluar cómo los cambios en la internalización y el reciclaje dan lugar a la expresión de superficie neta observada. El uso de farmacología y/o sobreexpresión de receptores exógenos que albergan mutaciones específicas hace de este protocolo un enfoque particularmente poderoso para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la adaptación neuronal a diferentes estímulos ambientales. Un ejemplo final de la utilidad de este protocolo es estudiar cómo los cambios multifactoriales en el medio ambiente (como en los modelos de una enfermedad) afectan el tráfico de GluR a través del examen de la expresión superficial en estos modelos.
Utilizando ejemplos específicos, inicialmente se demuestra cómo una manipulación farmacológica imitando la estimulación sináptica fisiológica [LTP químico (cLTP)] aumenta la expresión superficial de la subunidad Endógena GluA1 del tipo AMPA de GluRs (AMPARs) 6. El tráfico de una forma fosfomimética sobreexpresada de la subunidad GluN2B de GluRs de tipo NMDA (NMDAR) también se analiza para ejemplificar cómo este protocolo puede utilizarse para estudiar la regulación del tráfico de GluR por Modificaciones. Aunque se utilizan estos ejemplos específicos, este protocolo se puede aplicar fácilmente a otros GluRs y otros receptores y proteínas que poseen dominios extracelulares antigénicos. En el caso de que no haya anticuerpos disponibles para dominios extracelulares, la sobreexpresión de proteínas extracelulares etiquetadas con epítopos (por ejemplo, Flag-, Myc-, GFP-tagged, etc.) puede ayudar en el etiquetado de proteínas.
El protocolo actual proporciona instrucciones para cuantificar la densidad específica de subtipos GluR y el tráfico utilizando anticuerpos específicos. Este protocolo se puede utilizar para estudiar 1) expresión total de la superficie GluR, 2) internalización de GluR, y 3) reciclaje de GluR. Para estudiar cada proceso individualmente, se aconseja comenzar con las secciones 1 y 2 y continuar con las secciones 3, 4 o 5. En todos los casos, termine con las secciones 6 y 8 (Figura1).

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de 18 mm de diámetro #1.5 de grosor</td><td>Neuvitro</td><td>GG181.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-conjugado cabra anti-ratón secundario</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-conjugado cabra anti-conejo secundario</td><td>Life Technologies</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-conjugado cabra anti-ratón secundario</td><td>Life Technologies</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 conjugada cabra anti-conejo secundaria</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Placas de cultivo celular de fondo plano</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Dynasore</td><td>Tocris</td><td>2897</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Tocris</td><td>0219</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Fab fragmentos</td><td>Sigma</td><td>SAB3700970</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td></td> 11668019 <td></td></tr><tr><td>Ratón anticuerpo anti-GluA1</td><td>Millipore</td><td>MAB2263</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Medios Neurobasales</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Abcam</td><td>Ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco BioWave</td><td>Ted Pella</td><td>36500</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Tocris</td><td>1128</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antidecoloración Mountant Life</td><td>Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP de conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PSD-95 de conejo</td><td>Señalización celular</td><td>2507</td><td></td></tr><tr><td>Estricnina</td><td>Tocris</td><td>2785</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost más portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de receptores expresados en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, la población de receptores expresados en superficie se está adaptando constantemente y sujeta a estrictos mecanismos de regulación. El ejemplo paradigmático y uno de los eventos de tráfico más estudiados en biología es el control regulado de la expresión sináptica de los receptores de glutamato (GluR). Los GluR median la gran mayoría de la neurotransmisión excitatoria en el sistema nervioso central y controlan los cambios funcionales y estructurales dependientes de la actividad fisiológica a los niveles sináptico y neuronal (por ejemplo, plasticidad sináptica). Las modificaciones en el número, la ubicación y la composición de la subunidad de los GluR expresados en superficie afectan profundamente la función neuronal y, de hecho, las alteraciones en estos factores se asocian con diferentes neuropatías. Presentado aquí es un método para estudiar el tráfico de GluR en las neuronas primarias del hipocampo disociadas. Se utiliza un enfoque de "alimentación de anticuerpos" para visualizar diferencialmente las poblaciones de GluR expresadas en la superficie y las membranas internas. Mediante el etiquetado de receptores de superficie en células vivas y la fijación en diferentes momentos para permitir la endotosis de receptores y / o reciclaje, estos procesos de tráfico pueden ser evaluados y estudiados selectivamente. Este es un protocolo versátil que se puede utilizar en combinación con enfoques farmacológicos o sobreexpresión de receptores alterados para obtener información valiosa sobre los estímulos y mecanismos moleculares que afectan el tráfico de GluR. Del mismo modo, se puede adaptar fácilmente para estudiar otros receptores o proteínas expresadas en la superficie.

Este protocolo para estudiar el tráfico de receptores de glutamato se basa en el etiquetado diferencial de los receptores expresados en la superficie celular y los expresados en membranas internas. La segregación se logra mediante el etiquetado de los receptores antes y después de la permeabilización de la membrana, utilizando el mismo anticuerpo primario pero un anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo diferente. Como se describe en los pasos opcionales incluidos el protocolo, est...

Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.

Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Las respuestas celulares a los estímulos externos dependen en gran medida del conjunto de proteínas que se expresan en la superficie celular en un momento dado. En consecuencia, el número, la localización subcelular y la composición de subunidades de estas proteínas se controlan dinámicamente. Aquí, utilizaremos un enfoque de alimentación de anticuerpos para cuantificar el nivel de receptores expresados en superficie en cultivos celulares, siempre y cuando se reanude la internalización y el reciclaje.Este es un protocolo muy versátil, que proporciona información mecanicista de la regulación de las proteínas expresadas en superficie. En nuestro ejemplo, estudiaremos los receptores de glutamina en las neuronas hipocampales primarias. Este protocolo se puede adaptar a cualquier proteína que posea un epilátopo extracelular anagénico, si no hay anticuerpos disponibles, la transvección de construcciones etiquetadas puede ser útil tanto para el etiquetado como para el estudio de mutaciones específicas.En nuestros ejemplos, utilizamos anticuerpos contra GluA1 endógenos, y etiquetado Glu12 B.To comenzar este procedimiento, transferir la cubierta desliza el lado de la célula a una bandeja cubierta de película de parafina, para guardar reactivos y facilitar la manipulación. Guarde y mantenga los medios acondicionados a 37 grados centígrados para la incubación y los pasos de lavado. Incubar las células con anticuerpos primarios diluidos en medios acondicionados, a temperatura ambiente, durante 15 minutos.Después de esto, utilice una pipeta de vacío para aspirar cuidadosamente el anticuerpo que contiene medios, y lave las células tres veces con medios acondicionados. Si estudia la superficie frente a la expresión del receptor intracelular, corrija las células con paraformaldehído después de este paso, como se describe en el protocolo de texto. Mantener las células en medios condicionados sin anticuerpos, y devolverlas a la incubadora a 37 grados Celsius para permitir la internalización.Si estudia el proceso de internalización, corrija las celdas con paraformaldehído después de este paso, como se describe en el protocolo de texto. Para bloquear los epítopos en el anticuerpo primario unido a la superficie expresó receptores que no han sido internalizados, incubar células con fragmentos de anticuerpos Anti-IgG Fab no conjurados diluidos en medios condicionados, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, lave las células tres veces con medios acondicionados.Incubar los pozos lavados con medios acondicionados que contengan 80 micras de 80 micromolares Dynasore, a 37 grados centígrados, para permitir el reciclaje de receptores internalizados. Después de terminar las modificaciones en células vivas, lave las células una vez con PBS plus. Añadir una solución de 4%paraformaldehído y 4%sacarosa en PBS a las células, e incubar en una campana de humo a temperatura ambiente durante siete a ocho minutos, para fijar las células.Luego lave las células tres veces con PBS regular. Añadir una solución de 10%Normal Goat Serum en PBS a las células, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, para bloquear sitios de unión no específicos. A continuación, incubar las células con anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente diluidos en 3%NGS en PBS a temperatura ambiente durante una hora, para etiquetar los receptores primarios de la etiqueta de anticuerpos.Después de esto, lave las células tres veces con PBS. Para comenzar a etiquetar los receptores intracelulares, añadir una solución de 0.25%TritonX en PBS, e incubar a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos, para permeabilizar las células. A continuación, bloquee con 10%NGS a temperatura ambiente durante 30 minutos.Si estudia la superficie frente al total, incubar las células con el mismo anticuerpo primario utilizado anteriormente, diluidas con 3%NGS en PBS, a temperatura ambiente durante una hora, para etiquetar los receptores intracelulares. A continuación, lave las células tres veces con PBS. Etiqueta con segundo anticuerpo secundario con etiqueta fluorescente, diluido en 3%NGS en PBS, a temperatura ambiente durante una hora.Después de esto lavar las células tres veces con PBS. En primer lugar coloque suavemente los resbalones de la cubierta, el lado de la celda hacia abajo, en 12 a 15 microlitros del medio de montaje adecuado para montar las células. A continuación, imagine las celdas en el microscopio confocal adecuado y analice las celdas como se describe en el protocolo de texto.Este protocolo para estudiar el tráfico de receptores de glutamato se basa en el etiquetado diferencial de los receptores, expresado en la superficie celular, y los expresados en las membranas internas. Después de adquirir imágenes confocales, la señal fluorescente se puede cuantificar fácilmente para mostrar un aumento en la expresión superficial, en relación con la población intracelular, después de LTP químico. No se puede obtener ninguna señal para PSD-95 en células no permeabilizadas, lo que demuestra la integridad de la membrana plasmática.Esto indica que la señal obtenida para la superficie GluA1 corresponde efectivamente a los receptores expresados en superficie. Es importante destacar que se puede observar una señal mínima para GluA1 internalizado en condiciones no permeabilización, lo que demuestra que todos los epítopos de la superficie están ocupados por la ronda inicial de etiquetado de anticuerpos. A continuación, se identifican los receptores que se han interiorizado.Este ejemplo destaca que la fosforilación GluN2B en S1480 promueve la internalización del receptor. Como el mutante fosfomimético S1480E mostró una relación de internalización mucho mayor en comparación con los receptores de tipo salvaje. Como era de esperar, no se obtiene ninguna señal para los receptores internalizados en el control.A continuación, se identifican los receptores reciclados y los receptores internalizados. La relación de reciclaje generada muestra que GluN2B S1480E no tiene ningún efecto en el reciclaje NMDAR. En el control, se puede observar una señal fuerte para la superficie expresada GluN2B en ausencia de bloqueo Fab.Esta señal desaparece en los cultivos tratados con Fab, demostrando que el protocolo de bloqueo es suficiente para bloquear completamente la superficie expresada epítopos, y que las señales superficiales observadas después del reciclaje corresponden efectivamente a los receptores traficados de vuelta a la membrana plasmática. El protocolo actual es sólo uno de los métodos disponibles para estudiar la regulación de las proteínas expresadas en superficie. Se pueden tomar otros enfoques para ampliar o verificar los datos obtenidos aquí.Estos incluyen métodos bioquímicos, como biotinilación, técnicas de imagen de vida o enfoques funcionales, como electrofisiología o imágenes de calcio. Utilizamos PFA para congelar la localización de receptores, sin embargo PFA es un carcinógeno conocido, por lo que es crucial realizar pasos usando PFA bajo una campana de humo, mientras usa el EPP adecuado.

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Este video muestra un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos neuronales primarios del hipocampo. Este enfoque permite la observación de poblaciones de receptores tanto en el plasma como en las membranas internas. La discriminación entre estos subconjuntos se logra marcando los receptores antes y después de la permeabilización de la membrana, utilizando el mismo anticuerpo primario pero anticuerpos secundarios conjugados con...

Una técnica in vitro para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en las neuronas del hipocampo

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

Aquí se demuestra el uso de colorante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localización en la superficie del receptor y endocitosis en las neuronas del hipocampo. A través del uso de construcciones que tienen una etiqueta extracelular corta que se une α-bungarotoxina, análisis de membrana de tráfico endocítica de proteínas de plasma se puede lograr.

El uso de un enlace del sitio Tag α-Bungarotoxina para el Estudio de GABA A receptor de membrana localización y el Tráfico

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La formación de sinapsis inhibitorias en una Co-cultura modelo que incorpora GABAérgicas Mediano espinosas neuronas y células HEK293 que expresan establemente GABA A Receptores

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El objetivo de este protocolo es facilitar el estudio de receptores de NMDA (NMDAR) a una escala mayor y permitir el examen de los efectos moduladores de pequeñas moléculas y sus aplicaciones terapéuticas.

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Aprende a estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios mediante alimentación de anticuerpos. Este protocolo permite analizar internalización y reciclaje para comprender la plasticidad sináptica.

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