Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune
16 de agosto de 2019
Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.
Este protocolo le permite generar un gran número de células T funcionales específicas del antígeno que son un enfoque seguro deseado en el tratamiento de enfermedades autoinmunes. La principal ventaja de esta técnica es que le proporciona un proceso de transducción altamente eficiente y un gran número de células T funcionales. Esta técnica se puede ampliar para tratar la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes en las que se conocen los antígenos.
Además, los células T CAR pueden ser un tratamiento prometedor para ciertos tipos de cáncer. Este método se puede utilizar para generar células inmunitarias que expresen otros CAR. Es importante tener una buena técnica aceptada, leer todo el protocolo y planificar todo el experimento con antelación.
Este protocolo de dos semanas de duración incluye mini-pasos y el éxito depende del rendimiento adecuado de cada paso. Las demostraciones visuales de este método son fundamentales para que los alumnos las sigan correctamente. Prepare las células Phoenix para la transfección como se describe en el manuscrito.
Es una buena práctica marcar la pared lateral donde se agregará y eliminará el medio para minimizar el soplado de las células. En el día cero aspirar el sobrenadante de las células y lavarlos con cinco mililitros de PBS. Agregue cuidadosamente siete mililitros de medio sérico reducido a la pared lateral de la placa y transfiera las células de vuelta a la incubadora.
Añadir 1,5 mililitros de medio sérico reducido a dos tubos de polipropileno de fondo redondo de 14 milímetros. Añadir 40 micrómetros de reactivo de transfección a uno de los tubos y 15 microgramos de anticuerpos redirigidos plásmido CAR junto con cinco microgramos de plásmido de envase al otro. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego añadir reactivo de transfección al tubo de plásmido.
Mezclar en pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces e incubarla a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Añadir tres mililitros de la mezcla a las células Phoenix y colocarlos en una incubadora de cultivo de tejido. Después de cuatro a cinco horas añadir un mililitro de FCS a las células y cultivarlos durante la noche a 37 grados Celsius.
Al día siguiente, retire el sobrenadante de las células y agregue cuatro mililitros de medio de cultivo precalificado fresco. Cosecha el virus el segundo día recogiendo el medio que contiene el virus de las células Phoenix y filtrándolo para eliminar los desechos celulares residuales. Añadir acciones humanas IL-2 recombinantes al virus para una concentración final de 200 unidades internacionales por mililitro y utilizarla inmediatamente para la transducción.
Agregue cuatro mililitros de medio fresco a las células Phoenix y colóquelos en la incubadora durante la noche. Repita la recolección de virus al día siguiente para una segunda transducción y deseche las células. Un día antes de sembrar células T8 murinas, añadir un mililitro de una mezcla de anticuerpos antiratón CD3 y CD28 a cada pozo de una placa de 24 pozos e incubar la placa durante la noche a cuatro grados Celsius.
En el día cero, cosecha bazos de ratón y colóquelos en un colador celular empapando en 10 mililitros de PBS en un plato de cultivo celular sobre hielo. En una capucha de cultivo celular, corte cada bazo en tres a cinco piezas y use un émbolo estéril de una jeringa para presionar el tejido a través de la malla de alambre. Retire suavemente los glóbulos rojos resuspendiendo los espleocitos en un oto amortiguador de lelisis de células rojas diluidos e incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego diluya 10 microlitros de la suspensión celular con Trypan Blue para el recuento de células.
Y pele el resto de las células centrifugando a 350 veces g durante siete minutos. Utilice un kit de aislamiento de células T CD8 de ratón para enriquecer las células T CD8 y suspender los pellets celulares en 400 microlitros de tampón con 100 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina por uno por 10 a las células octavas. Mezcle bien la suspensión celular e icleine durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados para permitir la unión de anticuerpos.
Luego agregue 300 microlitros de tampón de etiquetado y 200 microlitros de micro-biotina MicroBeads por uno por 10 a las octavas células. Mezclar bien e incubar durante otros 10 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras tanto, configure una columna de separación en el separador y lávela con tres mililitros de tampón de etiquetado.
Coloque un colador celular de 40 micrómetros en la parte superior de una columna y pase un mililitro de la mezcla de cordón y célula a través del colador en la columna de separación. Recoger el flujo a través de un tubo de 15 mililitros prechilled y lavar la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante, recogiendo efluentes en el mismo tubo. Contar las células y recogerlas por centrifugación a 350 veces g durante cinco minutos.
Lávelos con dos mililitros de medio de célula t y centrífuga de nuevo. Luego resuspenderlos en medio de células T precalentadas a una concentración de 250.000 a 500.000 células por mililitro. Lave las placas recubiertas de anticuerpos CD3 y CD28 previamente preparadas con un mililitro de PBS estéril tres veces y agregue dos mililitros de la suspensión celular a cada pozo.
Utilice un movimiento de remolino para dispensar las células uniformemente. Como control, vajilla el mismo número de células T CD8 en un único pozo no recubierto de la placa e incuba las células a 37 grados Celsius en una incubadora de tanques de gas de dióxido de carbono del 10% durante 48 horas. En el primer día, preparar placas recubiertas de fragmentos de fibronectina humana añadiendo 0,5 mililitros de fibronectina a los pozos de una placa de 24 pozos e incubando durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, retire la solución de fibronectina y agregue un mililitro de 2%BSA y PBS por pozo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos y lavar los pozos tratados con un mililitro de PBS estéril. La placa está lista para usar después de retirar la solución de lavado.
Cuente las células T CD8 activadas usando Trypan Blue. Recógelos por centrifugación. Y los resuspend a cinco millones de células viables por mililitro para la transducción.
Agregue 100 microlitros de la suspensión de células CD8 activadas a cada pozo de la placa recubierta de fibronectina. Luego agregue 1.5 a dos mililitros del virus previamente preparado que contiene el medio y mezcle usando un movimiento de remolino para dispensar uniformemente las células. Selle la placa en una bolsa Ziploc y centríféquela a 2.000 veces g durante 90 minutos a 37 grados centígrados.
Retire la placa de la centrífuga y lléela a un armario de seguridad biológica. Retire con cuidado la bolsa de plástico y asegúrese de que el exterior de la placa no esté contaminado con el medio. Transfiera la placa a una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Centígrados.
Después de cuatro horas, retire un mililitro de medio de cada pozo, reemplácelo por un mililitro de medio de célula T completo preadmanido y vuelva a colocar la placa en la incubadora. Los aspectos críticos de este protocolo son un virus de alto título, células T activadas en buen estado y el método de transducción adecuado. Las células se teñiron conjuntamente con el tamaño de PE siete conjugados anti-CD8, AF647 conjugado anti-CD3, y BV 421 conjugado anti-CD28 para el análisis citométrico de flujo.
Aproximadamente, el 70% de las células T CD8 co-expresadas GFP que indica la expresión CAR. También co-expresaron CD28 y CD3. Es importante destacar que todas las células positivas de GFP de prueba también se han cotumizado con tetrámeros I-Ag7 insulina BR3, lo que indica la expresión de CAR en la superficie celular pero no con el tetrómero de control.
Además, las células T DE CAR de prueba y control ordenadas secretaron altos niveles de interferón gamma sólo después de la cocultura con células diana que expresan sus ligandos cognosos, lo que confirma que las células transducidas tienen un fenotipo de células T efector CD8 dirigido hacia el objetivo de los anticuerpos primarios. La transducción de células productoras de virus, el aislamiento de las células T CD8 primarias y la activación de estas células T son los pasos más importantes de este experimento. Tener células T activadas sanas y transducción de estas células T con reactivos adecuados asegura resultados favorables.
Este método se puede utilizar para transducir otras células T, pero debe personalizarse para el tipo de celda T específico. Este protocolo allana el camino para la prevención de la diabetes tipo 1 con la terapia de células T del receptor de antígeno específico del antígeno.
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Descripción general
Este artículo describe un protocolo para generar un gran número de linfocitos T CD8 funcionales y específicos para antígenos, que pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y cáncer. La técnica destaca un proceso de transducción altamente eficiente para la expansión de linfocitos T in vitro.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología celular
- Autoinmunidad
Antecedentes
- Los linfocitos T CD8 específicos para antígenos son cruciales para respuestas inmunitarias efectivas.
- Las enfermedades autoinmunitarias requieren estrategias de tratamiento seguras y efectivas.
- Los linfocitos T con receptor quimérico de antígeno representan un enfoque novedoso en la terapia contra el cáncer.
- Comprender la generación de linfocitos T puede mejorar las aplicaciones terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo para generar linfocitos T funcionales específicos para antígenos.
- Facilitar la expansión de linfocitos T para uso terapéutico.
- Explorar aplicaciones en enfermedades autoinmunes y tratamiento del cáncer.
Métodos Utilizados
- Generación in vitro de linfocitos T CD8.
- Procesos de transducción para la expansión de linfocitos T.
- Evaluación de la funcionalidad de los linfocitos T.
- Planificación y ejecución de protocolos experimentales.
Resultados principales
- Generación exitosa de un gran número de linfocitos T funcionales.
- Eficiencia demostrada del proceso de transducción.
- Aplicaciones potenciales en el tratamiento de la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes.
- Los linfocitos T con receptor quimérico de antígeno pueden generarse para diversas terapias contra el cáncer.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para la generación de linfocitos T.
- Abre vías para la investigación en enfermedades autoinmunes y cáncer.
- La planificación adecuada y el cumplimiento de la técnica son esenciales para el éxito.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La generación eficiente de linfocitos T citotóxicos primarios específicos de antígeno en ratones permite pruebas funcionales robustas en modelos de diabetes autoinmune, apoyando directamente la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas. Una alta eficiencia de transducción y viabilidad celular proporcionan confianza predictiva para investigaciones traslacionales posteriores y la selección de carteras en líneas terapéuticas de autoinmunidad e inmuno-oncología. La escalabilidad y adaptabilidad de este protocolo lo posicionan como una plataforma reutilizable para el análisis de sistemas relevantes para enfermedades en múltiples áreas terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de antígenos que impulsan enfermedades en modelos de autoinmunidad y cáncer.
- Apoya la validación funcional de hipótesis terapéuticas dirigidas a epítopos patógenos.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de respuestas de linfocitos T específicas para antígenos.
- Proporciona una plataforma para la evaluación rápida del compromiso del objetivo y la modulación inmunitaria.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona una generación de alta eficiencia de linfocitos T validados para el desarrollo reproducible de ensayos.
- Normaliza la preparación de células para lecturas funcionales cuantitativas en flujos de trabajo de cribado.
- Permite la expansión escalable de linfocitos T modificados genéticamente para la evaluación de compuestos o productos biológicos.
- Facilita la comparación robusta de respuestas específicas frente a antígenos en distintas condiciones experimentales.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad en el descubrimiento traslacional de biomarcadores en autoinmunidad.
- Asegura la continuidad desde la validación in vitro hasta los estudios de eficacia in vivo en las fases preclínicas.
- Reduce el riesgo biológico al proporcionar datos funcionales predictivos sobre terapias con linfocitos T modificados.
- Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo para candidatos terapéuticos basados en células.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, permitiendo una transición fluida desde la comprobación de hipótesis hasta la investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas basadas en hipótesis de respuestas inmunitarias específicas frente a antígenos y la aclaración de vías.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite lecturas citométricas y funcionales para comparar fenotipos y actividades de linfocitos T modificados genéticamente.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos de enfermedad in vivo para alinear biomarcadores y eficacia.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a diversos modelos de enfermedad y dianas antigénicas, lo que apoya estrategias de I+D basadas en plataformas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles para la generación de linfocitos T.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir pruebas funcionales robustas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas terapéuticos basados en células.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de células primarias, transducción viral y análisis mediante citometría de flujo.
- Exige acceso a infraestructura para cultivo celular, producción de virus e instrumentación analítica.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de manejo celular y ensayos para garantizar la reproducibilidad.
- Puede requerirse adaptación para diferentes subpoblaciones de linfocitos T o modelos de enfermedad según la especificidad del antígeno.
- El éxito depende del mantenimiento de la viabilidad celular, la obtención de virus con alto título y la ejecución precisa de los pasos del protocolo.
