Síntesis jerárquica y programable de oligosacáridos de una olla
6 de septiembre de 2019
Este protocolo demuestra cómo utilizar el software Auto-CHO para la síntesis jerárquica y programable de oligosacáridos. También describe el procedimiento general para los experimentos de determinación de RRV y la glicosilación de una olla de SSEA-4.
Demostramos cómo utilizar nuestro software recién desarrollado, Auto-CHO, para la síntesis jerárquica y programable de oligosacáridos de una olla. Auto-CHO incluye algoritmos en bloques de creación expandidos, con valores de reactividad relativos predichos a través del aprendizaje automático. El software Auto-CHO proporciona una guía valiosa para la selección de bloques de construcción, y un plan jerárquico para la síntesis múltiple de una olla de glicanos más complejos a través de la composición de fragmentos.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de cánceres o enfermedades infecciosas por terapias basadas en carbohidratos. Antes de utilizar Auto-CHO, asegúrese de que Java Runtime Environment se ha instalado en un PC o Mac. La demostración visual de la manipulación automática del software y el experimento de determinación de valor de reactividad relacionado ayudará a los químicos a seguir el protocolo y continuar con el experimento rápidamente.
Para realizar la inicialización de software del Entorno de ejecución Java, vaya al sitio web de Auto-CHO y descargue el software según el sistema operativo. Actualmente, Auto-CHO es compatible con Windows, macOS y Ubuntu. La última guía del usuario de PDF se proporciona en el sitio web de Auto-CHO.
Para los usuarios de Windows, descomprima las ventanas Auto-CHO. zip, y haga doble clic en Auto-CHO. jar en la carpeta Auto-CHO Windows para iniciar el programa.
Introduzca la estructura de glicano deseada. Elija dibujar una estructura de glicano o leer un archivo de estructura existente. Para introducir por dibujo, haga clic en editar glycan por GlycanBuilder, o el área de clic aquí para editar el destino sintético para dibujar y editar la estructura de consulta por GlycanBuilder.
La información de vinculación y quiralidad no debe ser ignorada. Haga clic en los botones Globo-H, SSEA-4 u OligoLacNAc para mostrar los ejemplos. Cierre el diálogo GlycanBuilder para completar la edición.
Defina los parámetros de búsqueda en la pestaña de configuración de parámetros para obtener resultados de búsqueda razonables. Haga clic en el botón Ok para habilitar la nueva configuración. La configuración predeterminada es buscar solo en la biblioteca experimental.
Si desea buscar las bibliotecas experimentales y virtuales, seleccione la pestaña Biblioteca de bloques de creación virtuales. Seleccione Usar bibliotecas experimentales y virtuales y aplique el filtrado para mostrar bloques de creación virtuales con determinados criterios. Los bloques de construcción experimentales y virtuales pueden trabajar juntos para mejorar la capacidad de búsqueda de Auto-CHO.
Actualmente, Auto-CHO proporciona más de 50.000 bloques de creación virtuales, con RRVs predichos en la biblioteca. Compruebe uno o varios bloques de creación virtuales deseados que el usuario desea utilizar para la búsqueda. Haga clic en el botón Mostrar bloques de creación virtuales seleccionados para mostrar solo los bloques de creación virtuales seleccionados.
Haga clic en el botón Mostrar bloques de creación virtuales filtrados para mostrar solo los bloques de creación virtuales con ciertos criterios definidos por el usuario. Haga clic en el botón Mostrar todos los bloques de creación virtuales para mostrar todos los bloques de creación virtuales disponibles y restablecer el filtro. Seleccione la pestaña estructura de consulta y haga clic en el botón de biblioteca de bloques de creación de búsqueda para buscar las soluciones sintéticas de una olla para la estructura de consulta.
A continuación, confirme la configuración de los parámetros. Busque en el visor de resultados. El resultado de la búsqueda se muestra en la pestaña de visualización de resultados.
Los aceptadores finales reductores de diferentes números de residuo se muestran en la columna de aceptador final reductor. A continuación, seleccione un aceptador final reductor. Las soluciones se muestran en la lista de soluciones sintéticas.
Los fragmentos se muestran en la lista de fragmentos para sugerir cuántos fragmentos se deben utilizar en la síntesis. El sistema proporciona información detallada de cada fragmento, incluyendo el RRV del fragmento, el rendimiento computacional, así como qué grupo protector debe desprotegerse para el uso del fragmento en la reacción de una olla. También se muestran los bloques de creación utilizados para ensamblar el fragmento seleccionado y la información de conexión del fragmento.
Para los bloques de construcción experimentales, vea y compruebe las estructuras químicas de los bloques de construcción seleccionados en la estructura química de la región de los bloques de construcción, y consulte la información detallada del navegador de bloques de construcción. En un matraz de fondo redondo de 10 mililitros, combine los dos donantes de tiobolósido, metanol absoluto y drierite en DCM. A continuación, revuelva a temperatura ambiente durante una hora.
Tome una alícuota de 30 microlitros de esta mezcla e inyecte la mezcla en cromatografía líquida de alto rendimiento en tres inyecciones separadas. Mida el coeficiente entre la absorción y la concentración de la molécula donante en las condiciones de separación basal. Añadir una solución de 0,5 molar N-Iodosuccinimida en acetonitrilo en la mezcla de reacción, seguida de una solución de ácido trifluorometanofónico 0,1 molar.
Revuelva la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, diluir la mezcla de reacción con cuatro mililitros de DCM. Filtrar y lavar la reacción con tiosulfato sódico acuoso saturado, que contiene 10%carbonato de hidrógeno sódico.
Ahora extraiga la capa acuosa tres veces con cinco mililitros de DCM. Combine todas las capas orgánicas y lave con cinco mililitros de salmuera. A continuación, seque las capas combinadas con aproximadamente 200 miligramos de sulfato de magnesio anhidro.
Agitar la mezcla suavemente durante 30 segundos, y filtrarlo a través de un embudo con un papel de filtro estriado con el fin de eliminar el sulfato de magnesio. A continuación, recoja el filtrado en un matraz de fondo redondo de 25 mililitros. Retire el disolvente con un evaporador rotatorio.
Disolver el residuo en un mililitro de DCM. Tome una alícuota de 30 microlitros de esta mezcla e inyéctela en cromatografía líquida de alto rendimiento en tres inyecciones separadas. Mida las concentraciones de los donantes restantes por HPLC, en las mismas condiciones de separación.
Mida la reactividad relativa. Según el valor de reactividad relativo de DR4, el valor de reactividad relativo de DX1 es tres. El resultado de la búsqueda Auto-CHO basado en la configuración predeterminada del parámetro indica que SSEA-4 se puede sintetizar con un dos más uno más tres reacciones de una olla.
Cuando se selecciona un aceptador final de reducción de trisacáridos, el programa muestra cuatro posibles soluciones para la consulta. La primera solución tiene un fragmento, y su rendimiento calculado es de aproximadamente 94%El fragmento puede ser sintetizado por dos bloques de construcción. El RRV del primer bloque de construcción disacárido es 1462, y el RRV del segundo monosacárido es 32.0.
También se muestra la estructura química del primer bloque de construcción sugerido utilizado en la reacción de una olla. El experimento de una olla muestra que SSEA-4 se puede sintetizar con éxito en un 43% de rendimiento por esta sugerencia. SSEA-4 puede ser sintetizado por tres unidades sugeridas por Auto-CHO.
Estas unidades incluyen silele disacárido building block uno, monosacárido building block dos, y reduciendo el aceptador final tres. Para la configuración de parámetros, sugerimos establecer parámetros con criterios más estrictos al principio. Para la selección de la biblioteca de bloques de creación, sugerimos buscar en la biblioteca experimental sólo al principio.
A través de esta demostración, esperamos que los glicanos más importantes, como los antígenos de carbohidratos asociados al tumor, puedan ser sintetizados por el enfoque de una olla para estudios posteriores. Después de este procedimiento, se puede realizar la síntesis de todos estos antígenos con el fin de diseñar vacunas contra el cáncer basadas en carbohidratos. También esperamos que la inteligencia artificial y los algoritmos informáticos puedan facilitar la síntesis automatizada de glicanos para beneficiar el tratamiento y la prevención de enfermedades.
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Descripción general
Este protocolo demuestra el uso del software Auto-CHO para la síntesis jerárquica y programable en un solo recipiente de oligosacáridos. Incluye una demostración visual de la manipulación del software y experimentos de determinación de RRV.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Síntesis de oligosacáridos
- Desarrollo de software
- Aplicaciones de aprendizaje automático
Antecedentes
- El software Auto-CHO facilita la síntesis de oligosacáridos.
- Los algoritmos predicen valores de reactividad relativa utilizando aprendizaje automático.
- Se proporcionan pautas para la selección de bloques de construcción.
- Implicaciones para aplicaciones terapéuticas en cáncer y enfermedades infecciosas.
Objetivo del estudio
- Demostrar la funcionalidad del software Auto-CHO.
- Proporcionar un protocolo para la glicosilación en un solo paso.
- Facilitar la síntesis de glicanos complejos mediante la composición de fragmentos.
Métodos Utilizados
- Síntesis jerárquica de oligosacáridos.
- Algoritmos de aprendizaje automático para predecir valores de reactividad.
- Demostraciones visuales del uso del software.
- Experimentos de determinación de RRV.
Resultados principales
- Demuestra con éxito la síntesis de oligosacáridos en un solo recipiente.
- Pautas eficaces para la selección de bloques de construcción.
- Instrucciones visuales claras para los químicos.
- Se destacan aplicaciones terapéuticas potenciales.
Conclusiones
- El software Auto-CHO es una herramienta valiosa para la síntesis de oligosacáridos.
- El aprendizaje automático mejora el proceso de síntesis.
- El protocolo permite la ejecución rápida de experimentos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La síntesis programable en un solo recipiente de oligosacáridos permite el ensamblaje rápido de glicanos complejos para la validación de objetivos terapéuticos, reduciendo los plazos de desarrollo de candidatos a fármacos basados en carbohidratos. El software Auto-CHO proporciona selección predictiva de bloques de construcción y planificación jerárquica de la síntesis, apoyando la eliminación de riesgos mecanicistas en las primeras etapas del descubrimiento. Este enfoque mejora la selección de carteras al aumentar la confianza en las relaciones estructura-actividad de los glicanos antes de la inversión preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la síntesis rápida de estructuras definidas de glicanos, como SSEA-4, para la validación de marcadores en células madre.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al generar lotes homogéneos de oligosacáridos para ensayos de validación funcional de dianas.
- Valor predictivo: Facilita el mapeo de las relaciones estructura-actividad para priorizar epítopos de glicanos con potencial terapéutico en dianas contra el cáncer y enfermedades infecciosas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayos: Produce preparaciones estandarizadas de glicanos adecuadas para el desarrollo de microarrays de carbohidratos y ensayos de unión.
- Resultados cuantitativos: Proporciona rendimientos medibles y perfiles de pureza que permiten cribados confiables de compuestos frente a proteínas ligadoras de glicanos.
- Reutilización de la plataforma: Permite la refinación iterativa de bibliotecas de bloques constitutivos mediante comentarios de usuarios sobre bloques virtuales, mejorando la escalabilidad a largo plazo del cribado.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: La síntesis demostrada de SSEA-4, un marcador de células madre pluripotentes, apoya la alineación de biomarcadores en medicina regenerativa y en el enfoque hacia células madre cancerosas.
- Continuidad traslacional: Proporciona una vía desde la síntesis a escala de descubrimiento hasta la evaluación preclínica de antígenos hidrocarbonados asociados a tumores para el desarrollo de vacunas.
- Avance ajustado al riesgo: Permite la producción de glicanos con estructura definida para reducir la ambigüedad en los perfiles de eficacia inmunológica y seguridad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la síntesis de glicanos guiada por hipótesis, contribuyendo a la identificación de candidatos prometedores mediante estructuras antigénicas definidas, y apoyando la validación preclínica a través de la producción reproducible de glicanos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar las vías biosintéticas y validar los blancos de glicanos mediante síntesis química definida.
- Tamizaje: Genera paneles de glicanos listos para ensayos con rendimientos cuantificados para el tamizaje de alto rendimiento de interacciones glicano-proteína.
- Análisis: Proporciona valores de reactividad relativa y rendimientos computacionales como lecturas cuantitativas para comparar la eficiencia de las rutas sintéticas y predecir su éxito.
- Investigación Traductiva: Se conecta con trabajos preclínicos al permitir la síntesis de antígenos de carbohidratos asociados a tumores para la evaluación de candidatos a vacunas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable mediante la expansión virtual impulsada por retroalimentación de Auto-CHO, reduciendo la planificación redundante de síntesis en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la función de los glicanos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad de la producción de oligosacáridos mediante protocolos estandarizados en un solo recipiente.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir una exploración rápida de la relación estructura-actividad, reduciendo el riesgo de fracaso biológico en etapas tardías.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos basados en glicanos mediante predicciones definidas de accesibilidad sintética y rendimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en química de carbohidratos e interpretación de estructuras de glicanos para la selección efectiva de bloques de construcción.
- Necesita acceso a HPLC e infraestructura estándar de síntesis orgánica para la determinación de RRV y el monitoreo de reacciones.
- Exige la estandarización entre equipos en cuanto a nomenclatura de glicanos y formatos estructurales de entrada para consultas consistentes en Auto-CHO.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a bloques de construcción no derivados de tioglicósidos o a estrategias alternativas de grupos protectores.
- Está limitado por la precisión de los RRV predichos mediante aprendizaje automático para bloques de construcción novedosos, lo que requiere validación experimental para predicciones de alta confianza.
