Modulación de la localización subcelular Tau como herramienta para investigar la expresión de genes relacionados con enfermedades
20 de diciembre de 2019
El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel directo del tau en el compartimento nuclear, excluyendo cualquier posible contaminación citoplasmático de tau. La principal ventaja de esta técnica es que es ampliamente aplicable al estudio sobre la función nuclear de tau en otros tipos de células y en diferentes condiciones celulares. Demostrando el procedimiento estará Giacomo Siano, un post-doc de mi laboratorio.
Comience por envolpar cuatro veces 10 a las cinco células de la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y para ser transfectadas con el vector de control vacío, cuatro veces 10 a las cinco células para ser transfectadas con tau sin etiquetar, cuatro veces 10 a las cinco células que se trans infectan con tau-NLS. Al día siguiente del chapado, incuba por separado 400 nanogramos de ADN y el volumen adecuado de lípidos catiónicos en un tubo de 250 microlitros de suero reducido por pozo. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, combine cada vector con un volumen de lípidos catiónicos e incubar los complejos lipídicos del ADN durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, sustituya los sobrenadantes de cada pozo por dos mililitros de medio de cultivo completo fresco y transfecten cada pocó cada pocidio con la solución adecuada del complejo de lípidos de ADN para una incubación nocturna a 37 grados centígrados. Al día siguiente, sustituya los sobrenadantes por un medio de diferenciación fresco. Para el análisis de Western Blot, lave las células trans infectadas y diferenciadas en cada pozo con PBS e incubar las células con 500 microlitros de 0.1%Trypsin por pozo durante cuatro minutos a 37 grados Celsius.
Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con un volumen igual de medio completo y transfiera la suspensión celular de cada pozo a tubos individuales para la centrifugación. Después de retirar cuidadosamente los sobrenadantes, resuspender los pellets en un mililitro de PBS por tubo para una segunda centrifugación y retirar los sobrenadantes de nuevo. Para extractos de proteínas totales, incubar los gránulos durante 30 minutos sobre hielo en 50 a 100 microlitros de tampón de lelisis complementados con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.
Al final de la incubación, centrifugar el extracto a 16.000 veces g durante 15 minutos y cuantificar la concentración de proteínas mediante cualquier ensayo de cuantificación estándar. A continuación, mezcle 20 microgramos de cada muestra de proteína con cinco microlitros de tamplio 4X Deemmli a un volumen total de 20 microlitros y hierva las muestras a 100 grados celsius durante cinco minutos. Para fraccionamiento subcelular, resuspender las células en medio completo para contar y girar hacia abajo una vez 10 a las seis células por muestra.
Para aislar la fracción citosólica, incubar los gránulos en 100 microlitros de tampón de extracción citoplasmática helada complementado con inhibidores de la proteasa a cuatro grados Centígrados con mezcla suave durante 10 minutos. Al final de la incubación, recoger las muestras por centrifugación y transferir los sobrenadantes en tubos pre-refrigerados. Añadir 100 microlitros de tampón de extracción de membrana fría con hielo complementado con inhibidores de la proteasa al pellet para una incubación de 10 minutos a cuatro grados Celsius con mezcla suave.
Luego centrifuga los pellets durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y 3.000 veces g y recoger los sobrenadantes en nuevos tubos. Para recoger la fracción nuclear soluble, añadir 50 microlitros de tampón de extracción nuclear complementados con inhibidores de la proteasa a los pellets con vórtice antes de incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Al final de la incubación, centrifugar las muestras y recoger los sobrenadantes.
Para recoger la fracción nuclear insoluble, añadir 50 microlitros de tampón de extracción nuclear complementados con inhibidores de la proteasa, cloruro de calcio y nucleasa micrococal a los pellets con vórtice. Incubar las muestras durante cinco minutos a 37 grados centígrados antes de vórtice y centrifugar. A continuación, recoger los sobrenadantes.
Para recoger la fracción citoesquelética, añadir 50 microlitros de tampón de extracción citoesquelética complementados con inhibidores de la proteasa a los gránulos con vórtice. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugar las muestras y recoger los sobrenadantes. Para el análisis SDS-PAGE, agregue siete microlitros de tampón 4X Laemmli a 20 microlitros de cada una de las muestras de fracción subcelular recogidas y hierva las muestras a 100 grados celsius durante cinco minutos.
Al final de la incubación, cargue las muestras en un gel de acrilamida y realice la electroforesis a una tensión constante de 120 voltios. Luego transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa a 250 miliamperios durante 90 minutos. Incubar la membrana durante cinco minutos en la solución de tinción de Ponceau para comprobar si hay electroforesis de gel proteico adecuada y una hinchazón exitosa.
Al final de la incubación, enjuague la membrana en agua destilada hasta que el fondo esté limpio y retire la mancha con un lavado continuo con solución salina tamponada Tris complementada con Tween 20 durante 10 minutos en una coctelera. A continuación, incubar la membrana con solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente con agitación antes de lavar tres veces con solución salina tamponada Tris más Tween 20 durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, hibrida la membrana con el anticuerpo primario de interés en bloquear la solución durante la noche a cuatro grados Celsius seguido de tres lavados con solución salina tamponada Tris más Tween 20 durante cinco minutos.
Después del último lavado, hibrida la membrana con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante adecuado en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente antes de lavar la membrana con solución salina tamponada Tris más Tween 20 tres veces durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, detecte la banda de proteínas usando quimiuminescencia y cuantifique la intensidad de las bandas Western Blot de ImageJ. En ausencia de ácido retinoico y factor neurotrófico derivado del cerebro, las células SH-SY5Y indiferenciadas asumen una morfología más redonda y forman grumos celulares.
Como era de esperar, después de cinco días de tratamiento con ácido retinoico, los grumos se relajan y las células se extienden. Después de tres días adicionales de tratamiento con factor neurotrófico derivado del cerebro, las células aparecen uniformemente distribuidas e interconectadas a través de una red de neuritas ramificadas. Después de la transfección tau-NLS o tau-NES, la localización subcelular tau se puede detectar mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-tau.
Dependiendo de la eficiencia de la transfección, las células muestran una fuerte tinción nuclear fusionándose con la señal DAPI después de la transfección tau-NLS o una tinción citoplasma con los núcleos vacíos después de tau-NES. El análisis de Western Blot revela el enriquecimiento de la actina dentro de la fracción citoesquelética, la tubulina dentro de las fracciones citoplasmáticos y citoesqueléticas, y el H2B dentro de las fracciones nucleares. El análisis de Western Blot también confirma la expresión de tau etiquetado y sin etiquetar dentro del compartimiento nuclear y del transportador de glutamato vesicular una expresión en el extracto total.
De hecho, la proporción de tau en las fracciones nucleares y citoplasmáticos solubles pone de relieve el hecho de que el tau-NLS está altamente enriquecido en la fracción nuclear soluble, mientras que el tau-NES disminuye. Además, el tau-NLS se enriquece en la fracción ligada a la cromatina con respecto a la fracción citoplasmática, mientras que el tau-NES disminuye. Asegúrese de comprobar cuidadosamente el número de células utilizadas para el fraccionamiento de cada muestra y verificar el enriquecimiento de los genes de limpieza en las fracciones adecuadas.
Después de ver este video, usted debe ser capaz de aislar los compartimentos celulares y evaluar el papel funcional del tau en el núcleo.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para investigar el papel de la proteína Tau nuclear, implicada en la enfermedad de Alzheimer, eliminando al mismo tiempo las interferencias procedentes de la Tau citoplasmática. La técnica es aplicable a diversos tipos y condiciones celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación sobre la enfermedad de Alzheimer
Antecedentes
- La proteína Tau es una proteína neuronal implicada en la unión a microtúbulos.
- Tiene funciones no convencionales en el núcleo.
- La proteína Tau nuclear puede modular genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer.
- Comprender su función es crucial para desarrollar estrategias terapéuticas.
Objetivo del estudio
- Investigar la función de la proteína Tau nuclear sin contaminación citoplasmática.
- Proporcionar un método ampliamente aplicable para estudiar Tau en diversos contextos celulares.
- Mejorar la comprensión del papel de Tau en las enfermedades neurodegenerativas.
Métodos Utilizados
- Transfección de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y con diversos constructos de Tau.
- Uso de lípidos catiónicos para la entrega de ADN.
- Incubación de complejos ADN-lípido para facilitar la transfección.
- Aislamiento de Tau nuclear para análisis funcional.
Resultados Principales
- El método excluye con éxito la contaminación por Tau citoplasmática.
- Permite el estudio directo de las funciones de Tau en el núcleo.
- Demuestra aplicabilidad a diferentes tipos celulares y condiciones.
- Proporciona información sobre el papel de Tau en la modulación génica relacionada con el Alzheimer.
Conclusiones
- Esta técnica es una herramienta valiosa para estudiar la proteína Tau nuclear.
- Abre nuevas vías de investigación sobre las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con Tau.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para explorar las diversas funciones de Tau.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite una interrogación precisa de la función del Tau nuclear en la expresión génica, abordando una brecha crítica en la validación de dianas en la enfermedad de Alzheimer. Al aislar el Tau nuclear de la interferencia citoplasmática, apoya la desactivación mecanicista de vías transcripcionales dependientes de Tau. El enfoque proporciona una herramienta escalable y ampliamente aplicable para evaluar la modulación génica relacionada con la enfermedad en modelos neuronales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación directa del papel de la proteína Tau nuclear en la modulación de genes relacionados con enfermedades, como VGluT1.
- Valor operativo: Utiliza técnicas estándar de transfección y fraccionamiento compatibles con los protocolos existentes en neurociencia.
- Valor estratégico: Reduce la atribución errónea de efectos en la expresión génica a la proteína Tau citoplasmática, mejorando la confianza en el blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de fraccionamiento subcelular para correlacionar la localización de Tau con la expresión de genes diana.
- Valor operativo: Emplea métodos clásicos y confiables (lisado, centrifugación, inmunotransferencia) que permiten la estandarización del ensayo.
- Valor estratégico: Facilita el desarrollo de lecturas reproducibles para la actividad nuclear de Tau en cascadas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la proteína Tau nuclear con las vías de liberación de glutamato relevantes para la fisiopatología inicial del Alzheimer.
- Valor operativo: Aplicable a diversos tipos celulares y condiciones, lo que facilita la consistencia traslacional.
- Valor estratégico: Permite la evaluación ajustada al riesgo de estrategias dirigidas a la proteína Tau al aclarar su mecanismo nuclear.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que la validación del blanco requiere claridad mecanicista sobre la función de proteínas nucleares, particularmente en modelos de enfermedades neurodegenerativas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre la participación de la proteína Tau nuclear en la regulación transcripcional, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Selección: Permite obtener fracciones subcelulares listas para ensayos, para la evaluación cuantitativa de la modulación génica dependiente de Tau.
- Análisis: Proporciona lecturas basadas en inmunotransferencia (Western blot) del enriquecimiento de Tau nuclear y la expresión de genes diana (por ejemplo, VGluT1) para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona la función de Tau nuclear con la expresión génica relevante para enfermedades en modelos neuronales, favoreciendo la continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Compuesta por técnicas ampliamente aplicables, lo que permite su reutilización en diversos estudios sobre Tau en distintos contextos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en el papel funcional de la proteína Tau en el núcleo, reducción de la ambigüedad mecanicista en la regulación génica.
- Valor operativo: Normalización mediante el uso de métodos clásicos y confiables; reproducibilidad mediante controles de fraccionamiento.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción al aislar efectos específicos del núcleo, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas en programas dirigidos a Tau.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de dianas basada en un mecanismo de acción nuclear validado.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la transfección de células de mamífero, fraccionamiento subcelular y análisis por inmunotransferencia (Western blot).
- Depende de instrumentación estándar: centrífugas, sistemas de electroforesis en gel y detectores de quimioluminiscencia.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de fraccionamiento para garantizar la pureza de los compartimentos.
- La adaptación a neuronas primarias u otros modelos puede requerir la optimización de las condiciones de transfección y lisis.
- Limitación práctica: la eficiencia depende del éxito de la transfección y de la validación adecuada de los marcadores de fracción (por ejemplo, H2B, actina, tubulina).
