Name: Pruebas de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 en secciones de cerebro de abeja con CRISPR-Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a editar genes con CRISPR-Cas9 en cerebros de abeja adulta para estudiar receptores GABAA y glutamato metabotrópico. Este método permite analizar la especificidad de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 mediante inmunocitoquímica.

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Este trabajo fue apoyado por los siguientes premios a BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). El péptido y los anticuerpos para DmGluRA fueron diseñados en el laboratorio Dr. Serge Birman (Marseille, Luminy, Francia) cuando IS fue apoyado por el Programa d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 de la Fondation pour la Recherche Medicale. Agradecemos a Daniela Junqueira Marosi y Alex Hanter de Integrated DNA Technology (IDT) por la ayuda con el diseño de guías RDL y ensayos de entrega qPCR.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Caracterización del anti-RDL y anti-mGlutR1 En primer lugar, caracterizamos los anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 por inmunoblot y pre-adsorción en las rebanadas de cerebros fijos de abejas. Cada anticuerpo fue hecho para reconocer todas sus isoformas conocidas, y el análisis occidental muestra que reconocen las bandas que corresponden a sus pesos moleculares predichos. A continuación, ambos anticuerpos fueron bloqueados por el péptido conjugado contra el cual se produjeron en secciones del cerebro de abeja.
Uno de los primeros objetivos de nuestro estudio fue establecer que los anticuerpos producidos contra el péptido conjugado específico son específicos de su proteína en el tejido cerebral fijo. Para ello, aprovechamos el sistema CRISPR-Cas9. Diseñamos guías específicas para las abejas melísetas RDL y mGlutR1 y las utilizamos para hacer CRISPR-Cas9 etiquetado con la sonda fluorescente ATTO550. Para cada receptor, inyectamos una mezcla de tres ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 diferentes en el ocelli para reducir la cantidad de proteína dirigida en el cerebro adulto de abejas al eliminar el gen correspondiente en las células que tomaron nuestro sistema Cas9 diseñado. En nuestro estudio, logramos este paso.
Uno de los primeros pasos cruciales para el éxito de estos experimentos es diseñar los ARN de guía adecuados. Recomendamos diseñar hasta cinco ARN guía, ubicados al principio, al medio y al final de la secuencia genética. En nuestro trabajo preliminar, los probamos en varias combinaciones en tres a cinco abejas. También probamos diferentes concentraciones de inyecciones, así como tiempos después de la inyección, y varias mezclas de RNP en las inyecciones. Diseccionamos cerebros y los procesamos usando anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1. En estas pruebas iniciales, establecimos la combinación adecuada, tiempo post-inyección, así como la concentración y la cantidad de CRISPR-Cas9 para inyección. Estas pruebas iniciales fueron la base para configurar los experimentos que describimos en detalle aquí.
El objetivo era doble: 1) demostrar en una abeja que nuestra tinción de anticuerpos se redujo después del tratamiento con CRISPR-Cas9 y 2) para trabajar a través de las mejores condiciones experimentales para estudios conductuales. Por lo tanto, mostramos que si muchos núcleos celulares contienen CRISPR-Cas9 48 h después de la inyección, la reducción de la tinción anti-RDL y anti-mGlutR1 es significativa. Además, eso demuestra que los anticuerpos probados reconocen específicamente la proteína mGlut1 y RDL en la preparación del cerebro de abeja y que se pueden utilizar para estudios de localización en el cerebro de abeja.
Ajuste experimental CRISPR-Cas9 para el estudio del comportamiento A continuación, creamos los experimentos para que CRISPR-Cas9 pudiera utilizarse en estudios de comportamiento. Se recogieron ocho o nueve abejas para el control y los tratamientos experimentales. Se probaron de forma conductual antes y después de la inyección, y luego sus cerebros fueron procesados para ATTO550 y/o inmunocitoquímica para determinar las regiones cerebrales que mostraron la reducción de la proteína diana. Aquí es esencial tener en cuenta que el número de abejas tomadas para un conjunto de experimentos se limitó a no más de 8-9 abejas para el control y las condiciones experimentales. De esta manera ambas condiciones podrían ser probadas en el mismo día. Además, una vez que preparamos las mezclas CRISPR-Cas9 para inyección, nunca las congelamos. La mezcla CRISPR-Cas9 no cambió de potencia cuando se usaba 3 días seguidos y se mantenía a 4-8 oC. Sin embargo, no lo probamos después de 3 días.
Como describimos en la sección Resultados para ambos conjuntos de inyecciones experimentales y para ambos anticuerpos, sólo tres abejas de 16 probados mostraron una gran distribución ATTO550 en el cuerpo del hongo, protocerebrum, y lóbulos antenales. En todas las demás abejas, la distribución de CRISPR-Cas9 se limitó al cuerpo del hongo, complejo central, y / o protocerebrum posterior. Es esencial entender para cualquier estudio de comportamiento que el uso de este método de inyección la reducción de la proteína diana se limitará sólo al cuerpo de la seta en la mayoría de las abejas. No se extenderá al lóbulo antenal o al ganglio subesofágico. Por lo tanto, la técnica de inyección que utilizamos es adecuada para estudiar el efecto de la reducción de receptores en el cuerpo de la seta y complejo central en experimentos conductuales, mientras que un método diferente de introducción de CRISPR-Cas9 será más adecuado para el estudio de otras regiones cerebrales.
En conclusión, nuestro estudio demostró la aplicación exitosa de CRISPR-Cas9 como un control para la tinción de anticuerpos en el cerebro. Tanto para los anticuerpos (anti-RDL como anti-mGlutR1), cuando la ingesta de mGlutR1-CRISPR-Cas9 o RDL-CRISPR-Cas9 fue exitosa, el nivel de tinción de anticuerpos correspondiente también se redujo significativamente. Además, es esencial tener en cuenta que la inyección en el ocelli condujo a una distribución de CRISPR-Cas9 en el cerebro que no era homogénea. La distribución varió desde un área mínima que rodea el cuerpo de ocelli y setas a muchas células en todo el cerebro. La variabilidad de la ingesta de mGlutR1-o RDL-CRISPR-Cas9 por las células probablemente se debió a la variación en las inyecciones. Nuestros datos muestran que el sistema CRISPR-Cas9 funciona en abejas, pero el método de inyección debe mejorarse para reducir la variabilidad de la ingesta de CRISPR-Cas9 a través de cerebros de abejas individuales. Dentro de estas restricciones, ahora es posible emplear esta técnica para manipular genes en abejas adultas para experimentos conductuales.

El sistema CRISPR/Cas9 recientemente descubierto es una poderosa herramienta que se ha utilizado para alterar el ADN genómico en varios sistemas y organismos modelo. Ha acelerado la investigación biomédica y los grandes avances tecnológicos al hacer que la modificación del genoma sea más eficiente y robusta que los métodos anteriores1. Nativo de las bacterias S. pyogenes, el sistema se basa en una endonucleasa Cas9, cuya actividad conduce a roturas de doble cadena (DSB) en el ADN, y un ARN guía (gRNA) que dirige la proteína Cas9 a una ubicación específica, dependiente de la secuencia2. Los descansos de doble cadena generados por CRISPR/Cas9 se pueden reparar a través de unión final no homóloga (NHEJ), un proceso propenso a errores que puede conducir a cambios de marcos o reparación directa de homología cuando hay una plantilla de donante presente. El propio ARNm consiste en un ARN CRISPR (CRRNA) específico de cada objetivo y un crRNA universal transactivador (tracrRNA) que puede sintetizarse químicamente y administrarse con nucleasa Cas9 purificada como complejo ribonucleoico (RNP)2,3. El etiquetado fluorescente del ARNm o de la nucleasa Cas9 puede permitir la detección y visualización intracelular de componentes moleculares mediante microscopía fluorescente4.
En nuestro trabajo actual, aprovechamos el sistema CRISPR-Cas9 para reducir los niveles de proteínas en cerebros adultos de abejas. Estudiamos los anticuerpos receptores metabotrópicos (mGluR) y anti-mGlutR1 y la subunidadreceptora GABA A RDL y anticuerpos anti-RDL. Desarrollamos un método sencillo para reducir la cantidad de proteína en el cerebro de la abeja adulta y la utilizamos para impulsar pruebas adicionales de los anticuerpos desarrollados contra las proteínas correspondientes. El seguimiento de la fluorescencia de CRISPR-Cas9 nos permitió estimar las áreas y células implicadas en la reducción de la proteína.
Usando este método, también caracterizamos los anticuerpos anti-mGlutR1 que se hicieron en conejos contra el péptido conjugado. El genoma de abejas codifica un AmGluRA altamente conservado (llamado mGlutR1 según la nomenclatura NCBI) receptor de glutamato metabotrópico5. El gen mGlutR1 de abeja tiene cuatro variantes de empalme predichas según la base de datos NCBI. Se ha informado que se expresa en el sistema nervioso central (SNC) de las etapas de abejas pupal y adulto y está involucrado en la formación de la memoria a largo plazo5. Los anticuerpos desarrollados contra mGlutR1 pueden ser una herramienta esencial para el estudio del sistema glutamatérgico en el proceso de aprendizaje y memoria en las abejas melíferas.
En nuestros estudios, también caracterizamos anticuerpos anti-RDL desarrollados en conejos inmunizados con péptidos conjugados de la subunidad receptora Aps mellifera RDL. El gen Honeybee Rdl, AmRdl (XM_006565102.3, base de datos NCBI), tiene 14 variantes de empalme pronosticadas. Se ha notificado un fragmento parcialmente clonado en la base de datos NCBI AF094822.1. La función receptora RDL y su fisiología está bien estudiada en insectos6,7,8,incluyendo abejas melísas9,10,11. Los anticuerpos desarrollados contra el anti-RDL pueden ser una herramienta esencial para estudiar el sistema GABAérgico en el proceso de aprendizaje y memoria en las abejas melíferas.
Un estudio anterior sobre el papel de los receptores de octopamina y tiramina utilizado RNAi inyectado en el cerebro con una prueba posterior de la cantidad de proteína por Western blot12,13. Sin embargo, el ARNI tiene algunas limitaciones significativas. Sólo hay una breve ventana de tiempo después de la inyección de ARNi dentro de la cual se produce una reducción de la proteína13. CRISPR-Cas9 se utilizó muy recientemente en embriones de abeja sellos para eliminar o modificar genes en todo el animal14,15,16. Informamos del uso de CRISPR-Cas9 para reducir la cantidad de proteína en la abeja adulta. Desarrollamos este enfoque para las abejas melíferas debido a la capacidad de acoplarlo a estudios conductuales de aprendizaje y memoria bajo condiciones de laboratorio controladas17.
En el presente trabajo, desarrollamos anticuerpos contra dos receptores y los probamos en las secciones adultas del cerebro de abeja después de que la proteína se redujera mediante la inyección CRISPR-Cas9. Al mismo tiempo, establecimos un diseño experimental que permite el uso del método para experimentos conductuales.

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis Acrylamida</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>utilizado con agua destilada para fijar el cerebro de la abeja melífera en bloques</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson Laboratorios de investigación</td><td>711-546-152</td><td>anticuerpo secundario para revelar los anticuerpos primarios del conejo</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT 1075934</td><td></td><td>con ARN guía diseñado, crea gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 nucleasa V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>enzima utilizada para producir ribonucleoproteínas para el sistema CRISPR</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-mGlutR1</td><td>Covalab (FRANCIA)/21st Century Biochemical</td><td>caracterizado por los autores en el presente artículo</td><td>Utilizado para la incubación primaria de mGlut 1 en abejas melíferas</td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-RDL</td><td>21st Century Biochemical</td><td>caracterizado por los autores en el presente artículo</td><td>Utilizado para la incubación primaria de RDL en abejas melíferas</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Y0001154 inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Tijeras Barraquer Iris 7mm Hoja Punta afilada</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>utilizado para la disección cerebro de abeja melífera</td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Cuchilla (rompible) para soporte de cuchilla</td><td>Fine Science Tool</td><td>10050-00</td><td>disección para Western blot</td></tr><tr><td>Portacuchillas y rompedor</td><td>Fine Science Tool</td><td>15309</td><td>disección para Western blot</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>para procedimiento de inyección</td></tr><tr><td>Sustrato quimioluminiscente de detección de Western blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL Aislamiento de</td><td>ARN</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Kit fácil de ADN</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Extracción de ADNUJ</td></tr><tr><td>Kit sin ADN</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>Se utiliza para extraer ADN</td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf Research plus, paquete de 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Pocillos Multipocillo Poliestireno</td><td>Multipocillo Falcon</td><td>351147</td><td>Multipocillos</td></tr><tr><td>Cápsulas de inclusión de fondo plano,</td><td>microscopía electrónica de polietileno Cesta Science</td><td>70021</td><td>para secciones cerebrales</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 (par)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11254-20</td><td>para la disección del cerebro de abeja melífera desde la cabeza</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5S (par)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-00</td><td>para limpiar el cerebro de la tráquea antes de la disección</td></tr><tr><td>Expresión génica Master Mix</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1055770</td><td>Ensayo</td></tr> <tr><td>de caída de qPCRGlutaraldehído</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>utilizado para la preparación de péptidos conjugados para el control de la peabsorción</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td> Western <td>blot, medios de inclusión</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>western blot</td></tr><tr><td>Hidrofóbico filtrado de nylonmesh Spectrum</td><td>Labs</td><td>145910</td><td>para el fondo de la cesta para secciones cerebrales</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL Aislamiento de</td><td>ARN</td></tr><tr><td>Hemocianina de lapa Keyhole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>utilizado para la preparación de conjugados para el control</td></tr><tr><td>LSM800 microscopio cofocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>diseñado ARN guía para CRISPR-Cas 9. Secuencias del genoma mGlutR1 diana</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td> ARN guía diseñado por <td>IDT</td><td></td><td>para CRISPR-Cas 9. Las secuencias del genoma mGlutR1 diana</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 3</td><td>ARN</td> guía diseñado por IDT <td></td><td>para CRISPR. Secuencias del genoma de mGlutR1</td></tr><tr><td>objetivo: metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 96 pocillos</td><td>Biosistema aplicado</td><td>4346907</td><td>ensayo de caída de qPCR y qRT-PCR</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 384 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich Z374911</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td><td>para procedimiento de inyección</td></tr><tr><td>Modelo p87 Extractor de micropipetas marrón llameante</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Preparación capilar</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>para la solución de inclusión</td></tr><tr><td>Nanolitro 2000</td><td>World Precision Instruments Aparato</td> de <td>inyección</td>de nanolitros <td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal Jackson</td><td>Research Laboratories Agente</td> bloqueante <td>AB_2337258</td><td>para inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Suero de cabra no inmune</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>Agente bloqueante para inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Tampón sin nucleasas</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>Tampón sin nucleasas que se utiliza en la preparación de la inyección de CRISPR-Cas9</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>IDT</td><td>AM9337</td><td>Agua libre de nucleasas que se utiliza en la preparación del sistema CRISPR-Cas 9</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>utilizado con PBS para hacer fijador para cerebros de abejas</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Utilizado con paraformaldehído como fijador; tampón para anticuerpos</td></tr></tbody></table>

pruebas de anticuerpos anti-rdl y anti-mglutr1 en secciones de cerebro de abeja con crispr-cas9

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) es una técnica de edición genética ampliamente utilizada en estudios de la función génica. Utilizamos este método en este estudio para comprobar la especificidad de los anticuerpos desarrollados contra el insecto GABAA subunidad receptor Resistencia a la dieldrina (RDL) y un receptor de glutamato metabotrópico mGlutR1 (mGluRA). Los anticuerpos se generaron en conejos contra los péptidos conjugados específicos de las moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) así como a las abejas melíferas (Apis mellifera). Usamos estos anticuerpos en secciones del cerebro de abeja sellos para estudiar la distribución de los receptores en cerebros de abejas. Los anticuerpos fueron purificados con afinidad contra el péptido y probados con inmunoblotting y el método clásico de preadsorción con conjugados de péptidos para mostrar que los anticuerpos son específicos de los conjugados de péptidos correspondientes contra los que fueron criados. Aquí desarrollamos la técnica CRISPR-Cas9 para probar la reducción de dianas proteicas en el cerebro 48 h después de la inyección CRISPR-Cas9 con ARN guía diseñados para el receptor correspondiente. El método CRISPR-Cas9 también se puede utilizar en análisis de comportamiento en las abejas adultas cuando uno o varios genes necesitan ser modificados.

Pruebas de anticuerpos anti-RDL Los anticuerpos se produjeron contra los conjugados de péptido RDL como se muestra en la Figura 1A. El primer paso para caracterizar los anticuerpos anti-RDL es comprobar el homogeneizado de la proteína extraída del cerebro de las abejas utilizando una mancha occidental con anticuerpos anti-RDL y un anticuerpo secundario IgG de cabra con etiqueta HRP(Figura 1A, insertar). Ambos anticuerpos anti-RDL reconocieron la banda situada en 50-60 kD (flecha), correspondiente al peso estimado de las proteínas isoformes de la subunidad RDL. Para demostrar que los anticuerpos anti-RDL reconocieron el péptido en las rebanadas cerebrales, utilizamos un control de preadsorción(Figura 1B,C). Cuando los anticuerpos fueron preincubados con péptidos conjugados, la tinción en la sección estaba ausente. Esto demostró que los anticuerpos anti-RDL reconocieron el péptido conjugado contra el que se plantearon. Para demostrar que los anticuerpos anti-RDL reconocen la proteína en el tejido cerebral fijo, utilizamos CRISPR-Cas9 para eliminar el gen RDL que produce la proteína RDL en las células. Figura 1D1-3, muestra secciones del cerebro de abeja frontal de control que fueron etiquetadas con anticuerpos anti-RDL. Esta abeja no se inyectó con RDL-CRISPR-Cas9 RNP. En la Figura 1D1,las etiquetas anti-RDL se neuropils en la sección frontal del cerebro de las abejas. La misma sección frontal de la Figura 1D2 muestra la ausencia de fluorescencia de ATTO550, porque el complejo RDL-CRISPR-Cas9 no se inyectó.
La Figura 1E1-E3 muestra una sección cerebral de una abeja inyectada con RDL-CRISPR-Cas 9 y luego procesada con la misma cantidad de anticuerpos que el cerebro de control en la Figura 1D1-D3. La tinción anti-RDL se redujo significativamente en todo el cerebro 48 h después de la inyección, y la distribución de la tinción ATTO550 en el cerebro (Figura 1E2) muestra el éxito de las inyecciones de RDL-CRISPR-Cas 9 en la mediana de la abeja ocelli. Las múltiples células dispersas del cerebro exhiben ATTO550. La inyección exitosa de RDL-CRISPR-Cas 9 redujo la expresión proteica en comparación con el control(Figura 1E1-3). A partir de ocho cerebros de abejas inmunomanchados, sólo un cerebro tenía un alto nivel de distribución del RDL-CRISPR-Cas9 en las células del cuerpo de la seta, protocerebrum y lóbulo antenal, mientras que otros cerebros tenían tinción celular con ATTO550 en el cáliz del cuerpo de setas, complejo central, pero no lóbulo antenal. Es importante tener en cuenta que en estas abejas, la inmunomancha anti-RDL de reducción no fue tan dramática como en el cerebro se muestra en la Figura 1E1.
A continuación, para estimar el nivel del ADNr RDL modificado en las abejas 48 h después de la inyección de RDL-CRISPR-Cas9, realizamos una prueba de entrega qPCR, donde la sonda de entrega fue diseñada para que coincida con el área de uno de los RDL gRNAs. En estos experimentos, en los cerebros de abeja inyectados con RDL-CRISPR-Cas 9, la reducción relativa de la fluorescencia correspondió al número de GDNA modificado en las muestras. En nuestras pruebas, el área correspondiente a esta guía en ADN a gDNA en 12 abejas inyectadas con RDL-CRISPR-Cas9 fue del 64 % (media de 30 % SD) en comparación con el ADNente en las abejas no inyectadas(Figura 3A).
A continuación, para estimar el nivel del ARN RDL en las abejas 48 h después de la inyección, realizamos qRT-PCR en un grupo separado de abejas(Figura 3B). Comparamos el nivel de ARN RDL de las abejas inyectadas RDL-CRISPR-Cas 9 (n a 19) con el nivel de ARN en las abejas que no se inyectaron (n x 12). En estos experimentos, la reducción relativa del ARNm RDL fue del 59% (media de 15% SE) en comparación con el nivel de ARN en las abejas no inyectadas. Cuando examinamos el nivel de ARN RDL en cada abeja individualmente, sólo 13 abejas de 19 abejas mostraron una reducción significativa del ARN. Estos datos indican que la inyección de RDL-CRISPR-Cas9 a través del ocelli podría no llegar siempre a un gran número de células cerebrales, lo que confirma los datos con las abejas inyectadas RDL-CRISPR-Cas9 teñidas por imágenes inmunitarias. En estas preparaciones, sólo una abeja de 8 tenía RDL CRISP-Cas9 en muchas células cerebrales (cuerpo de setas, protocerebrum y lóbulo de antena) en comparación con otros cerebros de abejas, donde la distribución del RDL-CRISPR-Cas9 se concentró en células en el protocerebrum (cáliz corporal de setas y complejo central) pero no en el lóbulo antenal(Figura 4A-D).
Pruebas de anticuerpos antimGlutR1 Utilizamos los anticuerpos anti-mGlutR1 producidos en conejo contra péptidos conjugados específicos de Drosophila melanogaster (Figura 2A). La secuencia de este péptido muestra una identidad del 94% con el péptido de abeja (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figura 2A. Primero, revisamos los anticuerpos contra la proteína del cerebro de abeja usando inmunoblotting. El homogeneato cerebral de abeja fue separado por un 10% de SDS-PAGE y transferido electroforóticamente de una membrana de nitrocelulosa y manchado con anti-mGlutR1. La plaquita de la Figura 2A muestra dos bandas con pesos estimados (103 y 83 kD) correspondientes a dos isoformas. Cuando probamos este anticuerpo en cerebros de abejas, encontramos que etiquetan perfiles neuropilares y células en las secciones del cerebro de abeja como se ilustra en la Figura 2B, D. Después de la preadsorción del anticuerpo anti-mGlutR1 con péptido conjugado-mGlutR1, la tinción específica desapareció en la rebanada del cerebro de la abeja(Figura 2C). Esto confirma que los anticuerpos anti-mGlutR1 reconocen el péptido(Figura 2C). A continuación, inyectamos una mezcla de mGlutR1-CRISPR-Cas9 en la mediana de ocelli y usamos el noguideRNA de control. En las abejas de control (n.o 7), la fluorescencia de ATTO550 no se concentró en las células. Algunos cerebros tenían etiquetado ATTO550 de fluorescencia dispersa. Por lo tanto, la preparación de control en la Figura 2D1-3 muestra la tinción anti-mGlutR1 en el cerebro, pero no la fluorescencia ATTO550. Cuando mGlutR1-CRISPR-Cas9 fue inyectado en el ocelli y tomado por muchas células, el nivel de fluorescencia de los anticuerpos secundarios se redujo significativamente en el área que toma el mGlutR1RNP funcional(Figura 2E1-3). Las abejas fueron monitoreadas durante 48 horas, y una abeja de cada condición experimental fue encontrada muerta. Así, en este experimento, comprobamos siete abejas de control y ocho abejas CRISPR-Cas9. Todas las abejas inyectadas con CRISPR-Cas9 tenían células que tomaban mGlutR1-CRISPR-Cas9. La mayoría de estas células estaban en el cuerpo del hongo cáliz, complejo central, y protocerebrum posterior. Sólo dos abejas de siete mostraron etiquetado ATTO550 en muchas células en el cuerpo de la seta, complejo central, y el lóbulo antenal. Un ejemplo de una de estas abejas se muestra en la Figura 2E. La reducción del nivel de tinción mGlutR1 en estos preparados fue significativa. Las otras cinco abejas tienen el etiquetado ATTO550 correspondiente a la entrega exitosa del mGlutR1 CRISPR-Cas9 en el cuerpo de la seta y el protocerebrum posterior, pero no en los lóbulos antenales.
A continuación, para estimar el nivel del mGlutR1 gDNA modificado en las abejas 48 h después de la inyección, realizamos una prueba de entrega basada en qPCR, donde la sonda de entrega fue diseñada para estar en el área cerca de la guía mGlutR1. En estos experimentos, en los cerebros de abejainyectados con mGlutR1-CRISPR-Cas 9, la modificación relativa del ADNes en 12 abejas fue del 59% (media de 33 % SD) en comparación con el ADNr en las abejas no inyectadas(Figura 3A).
Estos resultados también fueron confirmados por pruebas qRT-PCR en un grupo diferente de abejas, donde estimamos los niveles de ARN mGlutR1 utilizando qRT-PCR en las abejas 48 h después de las inyecciones con RNPmGlutR1mix(Figura 3B). Comparamos el nivel de ARN mGlutR1 de las abejas inyectadas mGlutR1-CRISPR-Cas9 (n x 6) con los niveles de ARN en las abejas que no se inyectaron (n x 6). En estos experimentos, la reducción relativa de la ARNm mGlutR1 en las abejas inyectadas fue del 53% (media de 18% SE) en comparación con las abejas no inyectadas(Figura 3B).
La sección de cuatro abejas diferentes que expresaelan el RNP RDL-CRISPR-Cas9 en Kenyon célula del cuerpo de la seta se muestra en la Figura 4A-D. La abeja ejemplo con fluorescencia ATTO550 en el cuerpo del hongo y el lóbulo de la antena se muestra en la Figura 4E,F.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Guías</td>
			<td>Secuencias</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>Rnp</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[guideRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 Nuclease]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGCCCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAACACGTGCCC</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTATCTGACGGTGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias de nucleótidos de guías diseñadas para RDL y mGlutR1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> Figura 1: Caracterización de anticuerpos anti-RDL. (A) Esquema de la subunidad RDL, donde los círculos rosados indican la localización del péptido 2 (CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amida) en el Término N y el péptido 1 (CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amida intracelular) en el Término C. El inserto en A muestra las bandas en la mancha occidental de extractos de cerebro de abeja procesados con los anticuerpos anti-RDL correspondientes (uno con pep1 anti-RDL y pep2 anti-RDL). Cada inmunoblot muestra el tamaño aparente de la proteína 50-60 kD, correspondiente a los pesos estimados de las diversas isoformas de las subunidades RDL. (B,C) Preadsorción de los anticuerpos anti-RDL con péptido conjugado 1. La imagen en C muestra una reducción en la tinción en la sección cuando los anticuerpos fueron preincubados con péptido conjugado 1. El cuerpo en forma de abanico (Fb) y el cuerpo elipsoide (eb) son estructuras complejas centrales en el cerebro. M - lóbulo medial del cuerpo de la seta. (D1-3) Tinción anti-RDL de un control, sección de cerebro de abeja no inyectada después de 48 h. Verde indica el perfil positivo anti-RDL en el cerebro. (D2) Esta abeja no se inyectó y no contiene fluorescencia ATTO550. (D3) Imágenes combinadas de D1 y D3. (E1-3) La inyección de RDL-CRISPR-Cas9 redujo la tinción anti-RDL después de 48 h. (E2) fluorescencia ATTO550 en los núcleos celulares indicó que la administración exitosa de RDL-CRISPR-Cas9. (E3) La imagen combinada de anti-RDL (verde) y ATTO550 (rojo). Barra de escala a 100 m (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> Figura 2: Caracterización de anticuerpos anti-mGlutR1. (A) Esquema de GCPR mGluR que muestra el péptido Drosophila melanogaster utilizado para la inmunización. Para la comparación, el péptido Apis mellifera se muestra a continuación. El círculo indica la localización del péptido en el N-terminus del dominio extracelular del receptor mGlutR1. El inserto en A muestra que los anticuerpos anti-mGlutR1 reconocieron dos bandas en la mancha occidental de cerebros de abejas de 103 kD y 83 kD que corresponden a los pesos estimados de las isoformas conocidas. (B,C) Control de preadsorción del anticuerpo anti-mGlutR1 en dos secciones consecutivas del lóbulo antenal glomérulos. La imagen de anti-mGlutR1 en la sección de glomérulos antenales en C muestra la reducción de la tinción como resultado de la preincubación del péptido anti-mGlutR1 con el anticuerpo anti-mGlutR1. Este procedimiento hace que el anticuerpo se precipite fuera de la solución, lo que elimina la tinción en comparación con B (control, ausencia del péptido en la preincubación). (D1) muestra la tinción de anti-mGlutR1 en una rebanada de cerebro de abeja después de una inyección de control en la mediana de ocellus. Esta inyección carecía del gRNA mGlutR1 que permite el derribo de los receptores mGlutR1 por CRISPR-Cas9, y por lo tanto la tinción del anticuerpo anti-mGlutR1 no se redujo (verde). (D2) La ausencia de fluorescencia ATTO550 indica la ausencia de CRISPR-Cas9 funcional en el cerebro. (D3) Imágenes combinadas de anti-mGlutR1 y ATTO550. (E1-E3) muestra nifura de anti-mGlutR1 en una sección cerebral donde mGlutR1 ha sido derribado permanentemente 48 h después de la inyección con mGlutR1-CRISPR-Cas 9 en la mediana de ocelo. Por lo tanto, la tinción en este cerebro se reduce en gran medida debido al éxito de la mGlutR1 en muchas células. (E2) La tinción ATTO550 en muchos núcleos celulares en el cerebro de las abejas indica que la inyección de mGlut1-CRISPR-Cas 9 fue exitosa. (E3) Imagen combinada de ATTO550 (rojo) y anti-mGlutR1 (verde). Barra de escala a 10 m (B,C); 100 m (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> Figura 3: Evaluación del ADNr modificado y expresión de ARNm de RDL y mGlutR1 mRNA en cerebros de abeja48 h después de la inyección con 345 nL de RPN CRISPR-Cas9 correspondiente. (A) La prueba de ensayo de entrega basada en qPCR para evaluar la cantidad de gDNA con un área de modificación se calculó utilizando el método de 2- .Ct y se normalizó contra el control, cerebros no inyectados. Los datos se expresan como media + SD. (B) La prueba qRT-PCR se utilizó para evaluar la cantidad de ARNm en las abejas inyectadas y no inyectadas de CRISPR-Cas9. AmActin se utilizó como un gen de referencia. La expresión génica relativa se calculó utilizando 2métodos -Ct y se normalizó contra el control, cerebros no inyectados. Los datos se expresan como media + SE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> Figura 4: Ejemplo de la distribución de RNP CRISPR-Cas9 en cerebros de abejas a través de fluorescencia ATTO550. (A-D) Las secciones cerebrales de cuatro abejas diferentes que expresaron el RNP RDL-CRISPR-Cas9 en la célula Kenyon del cuerpo de la seta. (E,F) Ejemplo de dos cerebros 48 h después de la inyección con RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Barra de escala a 150 m (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se presenta un protocolo para utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para reducir la producción de una proteína en el cerebro adulto de abeja sellos para probar la especificidad de anticuerpos.

Pruebas de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 en secciones de cerebro de abeja con CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Por primera vez hemos establecido una modificación de los genes codificados para GABAA ionotrópico y receptores de glutamato metabotrópicos en subconjuntos de neuronas en el cerebro adulto de la abeja miel. La edición de genes CRISPR-Cas9 se puede utilizar para modificar uno o varios genes en cerebros adultos de abejas para explorar sus funciones en el aprendizaje y la memoria bajo condiciones de laboratorio controladas. Este método se puede utilizar para estudiar la función de proteínas específicas en las abejas adultas, así como para probar la especificidad de los anticuerpos contra sus proteínas correspondientes.Demostrando el procedimiento con Irina Sinakevitch serán Lev Kurtzman y Hyun Choi, ex estudiantes de mi laboratorio. Para probar la expresión de RDL y mGlutR1 mediante análisis inmunocitoquímicos después de la inyección DE CRISPR-Cas9, primero, utilice una herramienta en línea CRISPR-Cas9 para diseñar las guías utilizando la secuencia de ADN guía de apis mellifera, RDL y mGlutR1. Para preparar formaciones complejas de ARN guía para cada ARN guía, etiquete un tubo de ensayo para cada guía con el nombre del ARN guía, y agregue 92 microlitros de tampón libre de nucleótidos, cuatro microlitros de 100 fluoróforos micromolares, ARN CRISPR transactivado etiquetado y cuatro microlitros de la solución de ARN guía adecuada para cada tubo.Una vez añadidos todos los materiales, mezcle las soluciones suavemente y gire el contenido del tubo en una centrífuga de sobremesa durante cinco segundos para sedimentar la solución. A continuación, mantenga las soluciones a 95 grados centígrados durante cinco minutos para crear un complejo de ARN guía seguido de 10 minutos de enfriamiento a temperatura ambiente. Para preparar las formaciones complejas de ribonucleoproteína añadir seis microlitros de cada solución de ARN guía y seis microlitros de 0,5 microgramos por microlitro SP-Cas9 nucleasa V3 a los tubos debidamente etiquetados.Después de una mezcla suave, incubar las soluciones a 37 grados Celsius durante 10 minutos Para hacer mezclas de ribonucleoproteína RNP para inyección, al final de la incubación añadir cuatro microlitros de cada ribonucleoproteína al RDL apropiado. Para realizar un control, la solución de ARN sin guía mezcla cuatro microlitros de ARN trazador con 92 microlitros de tampón y cuatro microlitros de agua. Después de la adición de agua, mantener la solución durante cinco minutos a 95 grados Celsius y dejar que la mezcla se enfríe hasta que alcance la temperatura ambiente.A continuación, mezcle seis microlitros de la solución de ARN sin guía con seis microlitros de 0,5 microgramos por microlitros Cas9 nuclese V3. Para la inyección de mezcla de ribonucleoproteína, después de capturar abejas individuales en viales con un pequeño agujero en las tapas, inmovilice las abejas durante no más de tres minutos en hielo y asegure cada abeja en soportes metálicos previamente preparados con cinta adhesiva. Con el tórax trasero, las alas y la cabeza expuestas. Utilice una jeringa de cinco mililitros para alimentar a las abejas con una solución de sacarosa molar hasta que ya no tengan hambre, y coloque las abejas aseguradas en una caja con una toalla de papel húmeda para la humedad.A continuación, coloque la cera en el interior de las tapas de dos platos petri de 35 mililitros y coloque los fondos de los platos sobre la cera. Inyecte una sacarosa molar entre la cubierta y la parte inferior de cada plato, y coloque un plato de petri de alimentación en una caja blanca con un portaobjetos de vidrio y coloque el otro en una caja negra con un portaobjetos de vidrio. A continuación, coloque un peine pequeño en cada caja y cargue un sistema de microinyección con la mezcla RDL CRISPR-Cas9.Para la inyección de RDL CRISPR-Cas9, inyecte la mediana de ocho abejas con 345 nanolitros de mezcla de ribonucleoproteína RDL seguido de la alimentación con una sacarosa molar antes de liberar las abejas en la caja experimental negra. Alimentar un segundo conjunto de ocho abejas como controles sin ninguna inyección y liberarlos en la caja de control blanca. A continuación, coloque ambas cajas en un recipiente de poliestireno con papel húmedo, observando las abejas dos veces al día para asegurarse de que tienen suficiente comida y una buena humedad.48 horas después de la inyección, inmovilizar las abejas en hielo durante 30 segundos y utilizar tijeras para decapitar a cada insecto. Coloque las cabezas en 4%paraformaldehído EN PBS bajo un microscopio diseccionado en una campana de humo, y use tijeras de iris barraquer para quitar cuidadosamente pero rápidamente las antenas, los ojos compuestos y el exoesqueleto superior. Deje que las cabezas se sienten en la solución fijadora durante 10 minutos antes de retirar el resto del esqueleto de exo de la cabeza y toda la tráquea restante.Luego, coloca cada cerebro en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga al menos un mililitro de 4%paraformaldehído durante la noche a cuatro a ocho grados centígrados. A la mañana siguiente, añadir 3,8 gramos de argrose a 50 mililitros de agua destilada en un matraz de erlenmeyer y microondas la solución hasta que la argrose se liquifiera. Transfiera de tres a cuatro cerebros de abejas de miel fijos a una nueva placa de petri de 35 milímetros y use papel tisú para eliminar el exceso de fijador.Verter cuidadosamente la argrose líquida sobre los cerebros y orientar las muestras dentro de la argrosa para que los lóbulos de las antenas estén mirando hacia arriba. Después de que la argrose se haya solidificado, utilice un bisturí para cortar bloques individuales de argrose que contengan un solo cerebro y llene cada pozo de una placa de 24 pozos cargada con una cesta con un fondo de malla hidrófoba y 600 microlitros de PBS por pozo. Luego, usa un vibratome para adquirir secciones transversales de 70 micrómetros del tejido cerebral de cada bloque de argrose.Colocar las secciones de un solo cerebro en la malla de la misma cesta a medida que se adquieren. Después de etiquetar las secciones con anticuerpos conjugados con fluoróforo, de acuerdo con los protocolos estándar, incruste cada diapositiva con secciones de un solo cerebro utilizando una gota de medio de montaje y visualice las muestras mediante microscopía de fluorescencia. Anti-RDL etiqueta las neuropilas en la sección frontal de tipo salvaje, pero no en cerebros de abejas nocaut CRISPR-Cas9 RDL.Se observó una especificidad similar para los anticuerpos anti-mGlutR1. En estas pruebas cuantitativas de caída de PCR en cerebros de abejas inyectados con RDL CRIPSR-Cas9, la reducción relativa de la fluoresencia correspondió al número del ADN guía modificado en la muestra. Después de la inyección de mGlutR1 CRISPR-Cas9, la modificación relativa del ADN guía fue de aproximadamente el 59% en los cerebros de las abejas inyectadas en comparación con el ADN guía observado en los cerebros de las abejas no inyectadas.En este RT-PCR cuantitativo en un grupo separado de abejas, la reducción relativa del ARN RDL mensajero fue de aproximadamente el 59%en comparación con el nivel de ARN en las abejas no inyectadas, y la reducción relativa del ARN mGlutR1 del mensajero en las abejas inyectadas fue aproximadamente del 53%, en particular, la inyección de RDL CRISPR-Cas9 a través del ocelli podría no llegar siempre a un gran número de células cerebrales. Por ejemplo, en estas preparaciones sólo uno debe estar de ocho años con RDL CRISPR-Cas9 en un gran número de células cerebrales en comparación con otros cerebros de abejas. Con el RDL CRISPR-Cas9 concentrado dentro de las células del protocerebrum, pero no el lóbulo antena.Asegúrese de evitar el ARN congelado y rerozen. Tenga cuidado de no enfendir las abejas. Aprovecharlos inmediatamente una vez que deje de moverse en el vial.Esta técnica se puede utilizar para estudiar los efectos de la reducción de los receptores ionotrópicos y metabotrópicos inhibitorios en el cuerpo de la seta y complejo central en el comportamiento de la abeja miel.

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Investigación

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Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Aprende a editar genes con CRISPR-Cas9 en cerebros de abeja adulta para estudiar receptores GABAA y glutamato metabotrópico. Este método permite analizar la especificidad de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 mediante inmunocitoquímica.

Pruebas de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 en secciones de cerebro de abeja con CRISPR-Cas9

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