Name: Un método directo y simple para evaluar la viabilidad de Drosophila melanogasterde Embryo a Adult (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 s
Description: Aprende a evaluar la viabilidad de Drosophila melanogaster desde embrión hasta adulto con este protocolo simple y preciso. Este método evita pérdidas técnicas y facilita estudios genéticos y de biología del desarrollo.

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Nuestro trabajo está financiado por NIH 1R15GM1131-01 a CFH y NIH PA -12-149 A CFH.

1. Preparación de medios
<ol><li>Preparar el agar de uva de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales)y verter en un plato Petri de 35 mm a medio lleno (Figura5).  Dejar solidificar durante aproximadamente 1 h. Después de que el agar de uva se solidifique, inmediatamente utilizar o conservar a 4oC.</li>
	<li>Suavemente hacer arañazos a través de la placa de agar usando un pequeño cuchillo de plástico (moscas como para acostarse en superficies irregulares) dejando el centro de la placa sin arañazos (Figura5). Coloque una pequeña cantidad de pasta de levadura (hecha fresca; ver Tabla de Materiales)en el centro de la placa (Figura5).</li>
</ol>2. Embryo Collection Mini Jaula Set Up
<ol><li>Establecer una cruz utilizando dos hembras vírgenes y un macho joven dentro de la jaula de recogida de embriones que contiene la placa de agar de uva complementada con pasta de levadura (Figura5).</li>
	<li>Después de 24 h, inspeccione las jaulas en busca de embriones establecidos sin abrir la jaula mirando la parte inferior de la placa de agar.  Si se han colocado embriones, retire la placa de agar de la cámara y colóquela dentro de una cámara húmeda para observación microscópica (Figura6).  Si se puntúan varios días de colocación (por ejemplo, ensayos de fertilidad/longevidad), mantenga a los padres reproductores y reemplace la placa por una fresca preparada como se describe. Se pueden hacer colecciones tempranas de menos de 24 h pero, al utilizar hembras vírgenes, tenga en cuenta que no se quedarán hasta las 48 h después de salir de su caso de pupa.</li>
	<li>Cubra la placa de agar que contiene embriones con la tapa de la placa Petri para evitar la deshidratación y colóquela inmediatamente dentro de una cámara húmeda (Figura7). Observar bajo un microscopio de disección y registrar embriones eclosionados y L1.  Reemplazar la tapa y almacenar a temperatura ambiente en cámara húmeda hasta que todos los embriones hubieran eclosionado y desarrollado en larvas L1 (Figura6).</li>
</ol>3. Contar embriones y larvas
<ol><li>Después de 48 h, observe las placas bajo el microscopio de disección y registre los números una última vez antes de transferir el disco de agar al vial de alimentos.  Los embriones fertilizados/viables deben convertirse en L1 para entonces.  Es posible períodos de incubación más largos antes de la transferencia, pero tenga en cuenta que las placas pueden comenzar a perder humedad y el agar puede agrietarse comprometiendo una transferencia limpia a los viales de alimentos (Figura7).  Para garantizar que las placas permanezcan hidratadas y que la viabilidad de los embriones no se vea comprometida durante el recuento, evite utilizar una luz directa de cuello de cisne sobre la superficie del agar (laFigura 7E muestra una distancia adecuada).</li>
	<li>Después de contar, cubra la placa y guárdela en la cámara húmeda hasta que esté lista para ser trasladada. Registrar los hallazgos.</li>
</ol>4. Transfiera el disco de agar uva a un vial de alimentos para monitorear la viabilidad durante el desarrollo
<ol><li>Una vez registrados los números (embriones en picado/L1/L2), utilice una espátula para transferir cuidadosamente el disco de agar uva a un vial lo suficientemente grande como para acomodar un disco de 35 mm que contenga medios alimenticios Drosophila preparados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la lista de reactivos). Coloque el disco de agar de uva L1-side hacia abajo en el alimento (Figura 7).  Después de transferir el disco de agar con larvas al vial de alimentos, inspeccione cuidadosamente la placa vacía de Petri en busca de larvas que queden atrás (Figura7E).</li>
	<li>Establecer un horario para inspeccionar los viales de alimentos diariamente, aproximadamente a la misma hora cada día, para garantizar que las larvas L2/L3 se observen haciendo su camino a los alimentos en el vial (Figura8).</li>
	<li>Registre el número de pupas y Drosophila adulta (Figura9). Sigue contando hasta que no se observen más adultos y evita contar la siguiente generación (no cuentes más de 9 días después de observar a los primeros adultos).</li>
	<li>Observe y registre los hallazgos. Ajuste el marco de tiempo de la recolección, conteo y grabación de embriones en consecuencia a la acción mutante que se está utilizando.</li>
	<li>Realice un análisis cuadrado de chi. La hipótesis nula supone una viabilidad del 100% de tal manera que el número de adultos será igual al número de embriones eclosionados y L1 registrados y transferidos originalmente a los viales de alimentos</li>
</ol>

<ol><li>Hartung, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+the+larval+growth+rate+and+viability+of+two+tumor+strains+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster.</a> Science. 107 (2777), 296-297 (1948).</li>
<li>Moree, R., King, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Studies+on+Relative+Viability+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).</li>
<li>Da Costa, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+F1+and+F2+generations+of+crossed+Drosophila+and+Oregon+previously+adapted+to+2+different+nutrient+media%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+de+l%27Acad%C3%A9mie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media.</a> Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).</li>
<li>Garcia-Dorado, A., Caballero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutational+rate+of+Drosophila+viability+decline%3A+tinkering+with+old+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data.</a> Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).</li>
<li>Lence, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+modulates+neuronal+functions+and+sex+determination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila.</a> Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).</li>
<li>Haussmann, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m%286%29A+potentiates+Sxl+alternative+pre-mRNA+splicing+for+robust+Drosophila+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination.</a> Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).</li>
<li>Stockwer, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+An+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting started: An overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Hales, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+Fly%3A+A+Primer+on+the+Drosophila+Model+System%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Variation+for+Preadult+Viability+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster.</a> Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).</li>
<li>Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Inducer+of+MEiosis+4+%28IME4%29+is+required+for+Notch+signaling+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTA+Is+an+Arabidopsis+Messenger+RNA+Adenosine+Methylase+and+Interacts+with+a+Homolog+of+a+Sex-Specific+Splicing+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor.</a> The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+modification+destabilizes+developmental+regulators+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).</li>
<li>Hsu, P. J., Shi, H., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomics+influence+on+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomics influence on development and disease.</a> Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).</li>
<li>Kan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+m6A+pathway+facilitates+sex+determination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila.</a> Nature Communications. 8, 1-16 (2017).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture-Based+Screening+Identifies+the+Anthelmintic+Drug+Nitazoxanide+as+a+Candidate+for+Treatment+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).</li>
<li>Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+bioactive+molecule+screening+based+on+a+bioelectrical+impedance+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform.</a> International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).</li>
<li>Weltin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+monitoring+for+drug+screening+and+cancer+research%3A+a+transparent%2C+microfluidic%2C+multi-sensor+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).</li>
<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses.

En resumen, este método proporciona una evaluación precisa y sencilla de la viabilidad en Drosophila. Todo el protocolo tarda aproximadamente 14 días en completarse. El procedimiento no requiere habilidades técnicas expertas; sin embargo, el momento adecuado, un cronograma de observaciones diarias y una transferencia cuidadosa de agar es importante para la precisión y reproducibilidad.
Además de la colocación del embrio del disco de uva-agar en el vial de alimentos, otro paso crucial en el procedimiento es transferir el disco de agar a un vial de alimentos a más tardar 48 horas después de retirar la placa de agar de uva de las mini jaulas de colección de embriones. La transferencia del agar después de 48 h dio lugar a la pérdida de embriones y larvas, probablemente debido a la deshidratación del disco de agar. Para contar las transiciones L2/L3, la placa necesita incubar durante 72 h. Si esta etapa es crucial, las placas de agar de uva deben ser vertidas más gruesas y se debe utilizar una cámara húmeda para evitar la desecación. Las cruces se instalaron en jaulas de recogida de embriones que acomodan placas de 35 mm; sin embargo, este procedimiento también se puede realizar utilizando jaulas de recolección de embriones más grandes, como una que acomoda placas Petri de 60 mm o 100 mm.  Las botellas de comida deben ser lo suficientemente grandes como para acomodar esos tamaños.
Hay pasos que se pueden agregar a este protocolo. Como se mencionó anteriormente, las transiciones L2/L3 son difíciles de cuantificar en las placas debido al tiempo requerido y a la posible deshidratación del agar. Además, las larvas se vuelven altamente móviles en la superficie del agar, lo que plantea un desafío para contarlas con precisión. Colocar las placas en el refrigerador durante 30 minutos o añadir unas gotas de un anestésico suave (solución de lidocaína) en la superficie del agar antes de contar las larvas L2/L3 puede ayudar a ralentizar sus movimientos para contarlas con mayor precisión.  Una advertencia a estas modificaciones es que pueden introducir variables (sensibilidad fría, sensibilidad anestésica) y confundir los resultados de viabilidad.  Incluso sin estos pasos, mediante el uso de alimentos de colores, los investigadores pueden cuantificar L3s itinerante/prepupae a medida que se asientan en el lado de los viales de alimentos para iniciar la pupación. Una limitación a este método es que requiere que los adultos utilizados en las cruces sobrevivan siendo anestesiados con CO2 para el fenotipado para configurar las cruces en las jaulas de recolección de embriones. Los machos mutantes homocigotos Dm ime4 no se recuperan bien y mueren unas horas después de despertarse del tratamiento con CO2.  Se pueden explorar otros métodos para inmovilizar a los adultos para la clasificación, como colocar viales en el refrigerador durante unos minutos y luego transferir viales al hielo triturado para ralentizar el movimiento y ordenar de forma rápida y eficiente.
Además de comparar las fortalezas alélicas y sus efectos sobre la viabilidad, este método se puede utilizar para la sensibilidad de la pantalla o la resistencia a compuestos farmacéuticos definidos. A diferencia de otros métodos que examinan la toxicidad compuesta en el cultivo celular15,16,17,18, este método utiliza organismos enteros, haciendo la evaluación de los efectos del desarrollo más fácil de analizar. En resumen, utilizando este protocolo y modificaciones en el mismo, permitirá medir las fortalezas alélicas, así como los efectos de factores ambientales y compuestos químicos en la viabilidad de Drosophila, la fecundidad, la fertilidad, la vida útil y la duración de desarrollo.

La vida útil se ve afectada por factores genéticos y no genéticos. En condiciones de crecimiento de laboratorio estándar a temperatura ambiente, nuestro laboratorio ha observado una variación significativa de la aptitud y la viabilidad entre los diferentes alelos Dm ime4 cultivados en condiciones idénticas (Figura1 y Figuras Suplementarias). Los estudios de viabilidad se realizan con frecuencia para investigar los efectos de una determinada combinación de alelo o condición de crecimiento en los estudios genéticos poblacionales1,2,3,4. Sin embargo, los análisis detallados de la viabilidad dentro de un grupo no complementario de mutaciones son difíciles de encontrar en la literatura científica. Un alelo suele estar etiquetado como "no esencial" si el investigador encuentra a unos pocos individuos homocigotos para ese alelo dentro del vial de alimentos que alberga el stock equilibrado5,6. Sin embargo, los análisis precisos de Chi-cuadrado para evaluar si estos homocigotos surgen en las proporciones mendelianas esperadas no se notifican5,6. La temperatura más permisiva para cualquier población de Drosophila es la temperatura ambiente (22-23 oC) y, conlos nutrientes adecuados, el ciclo de vida de las moscas de tipo salvaje tarda aproximadamente doce días en completar 7,8. Como la duración de cada etapa de desarrollo de Drosophila de tipo salvaje se conoce7,8, el método descrito en este informe se puede utilizar para examinar si la cepa drosophila en estudio es adecuada en cada etapa en comparación con un control apropiado para los antecedentes genéticos probados. A diferencia de los estudios que se centran en un aspecto específico del desarrollo9, este protocolo proporciona una forma práctica de evaluar la viabilidad en diferentes etapas del desarrollo.
En nuestro laboratorio, este protocolo se utiliza para evaluar la viabilidad de las existencias que son deficientes para Drosophila Inducer de Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 es un gen esencial10 que codifica un ARN metiltransferasa con funciones críticas en el metabolismo del ARN en Drosophila y otros organismos multicelulares5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . Para evaluar rápidamente los alelos novedosos de Dm ime4 generados a través de CRISPR/Cas9 (FigurasSuplementarias),se realizó un ensayo de viabilidad de punto final que sólo contaba la progenie adulta producida dentro de viales de existencias equilibradas (Figura1). Algunas de las acciones utilizadas se describen en informes anteriores de Dm ime4 5,6. Los mutantes homocigotos surgieron a niveles sub-mendelianos, según lo determinado por los análisis de chi-cuadrado (Figura1 y Materiales Suplementarios). Para evaluar si estas cifras inferiores a lo esperado se debieron a menos embriones, o menos embriones eclosionados, o a la pérdida de viabilidad en L1/L2 o pupupae, ampliamos el seguimiento para incluir recuentos en cada una de estas etapas del desarrollo (Figura2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8y Figura 9).
Aquí, describimos el método usando moscas de tipo salvaje (OreR). Para probar empíricamente este método para su uso con otros orígenes genéticos o especies de Drosophila, recomendamos utilizar OreR como referencia y ajustar los puntos de tiempo según el organismo experimental.  El protocolo se evaluó además para evaluar la viabilidad de la progenie generada cruzando hembras vírgenes de tipo salvaje con machos de una reserva mutante heterocigoto Dm ime4 5,6 (Figura4).

<table><tbody><tr><td>Aditivo antimoho</td><td>Carolina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Fisher Scentific</td><td>S76100J</td><td>Beaker</td></tr><tr><td>Benchmark Placa calefactora digital científica</td><td>The Lab Depot</td><td>H3760H</td><td></td></tr><tr><td>Agua del grifo filtrada con Britta para preparar agar uva y comida instantánea para moscas</td><td>Cualquier sistema</td><td></td><td></td>de filtración de agua del grifo</tr><tr><td>CO2 pistola o FlyNap</td><td>Carolina</td><td></td><td>Anestésico para clasificar/contar moscas adultas</td></tr><tr><td>Microscopio de disección/estereoscopio</td><td></td><td>Amscope SM-1TSZ-V203</td><td>Microscopio de disección</td></tr><tr><td>Drosophila viales y tapones de cultivo</td> Carolina <td>173120</td><td>Viales de alimentos para el cultivo de Drosophila</td><td></td></tr><tr><td>Embryo Collection mini jaula</td><td>Cámara Genesee Scientific</td><td>59-105</td><td>utilizada para Recoger embriones</td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70980</td><td>Matraz Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Azul</td><td>Carolina</td><td></td><td>https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr</td></tr><tr><td>Agar uva</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td>Medios utilizados para placas de agar</td></tr><tr><td>Mosca instantánea flood</td><td>Carolina</td><td>173210</td><td>Medios azules para viales</td></tr><tr> de alimentos<td colspan="4">Placa de Petri grande o cualquier recipiente transparente para usar como cámara húmeda colocando toallas de papel húmedas para mantener húmedas las placas de agar uva durante la incubación/observación microscópica previa y posterior</td></tr><tr><td>Espátula de metal (pequeña)</td><td>Carolina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Para cocinar agar uva</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Kord-Valmark</td><td>2901</td><td>Placa de Petri para agar uva</td></tr><tr><td>Barra de agitación</td><td>The Lab Depot</td><td>58948-981-EA Barra de</td><td>agitación magnética</td></tr></tbody></table>

un método directo y simple para evaluar la viabilidad de drosophila melanogasterde embryo a adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En Drosophila melanogaster, ensayos de viabilidad se utilizan para determinar la aptitud de ciertos orígenes genéticos. Las variaciones alélicas pueden resultar en la pérdida parcial o completa de viabilidad en diferentes etapas de desarrollo. Nuestro laboratorio ha desarrollado un método para evaluar la viabilidad en Drosophila de embrión a adulto completamente maduro. El método se basa en cuantificar el número de progenie presente en diferentes etapas durante el desarrollo, comenzando con embriones eclosionados. Una vez cuantificados los embriones, se cuentan etapas adicionales, incluyendo L1/L2, pupupas y adultos maduros. Una vez examinadas todas las etapas, se utiliza un análisis estadístico como la prueba de chi-cuadrado para determinar si existe una diferencia significativa entre el número inicial de progenie (embriones en cuba) y las etapas posteriores que culminan en el número observado de adultos, por lo tanto, rechazar o aceptar la hipótesis nula (que el número de embriones eclosionados será igual al número de larvas, pupupas y adultos registrados a lo largo de las etapas de desarrollo). La principal ventaja de este ensayo es su simplicidad y precisión, ya que no requiere un enjuague embrionario para transferirlos al vial de alimentos, evitando pérdidas por errores técnicos. Aunque el protocolo descrito aquí no examina directamente las larvas L2/L3, se pueden agregar pasos adicionales para tener las cuentas de estas. La comparación del número de embriones eclosionados, L1, pupas y adultos puede ayudar a determinar si la viabilidad se vio comprometida durante las etapas L2/L3 para estudios posteriores (el uso de alimentos de color ayuda con la identificación visual de larvas). En general, este método puede ayudar a los investigadores y educadores de Drosophila a determinar cuándo se ve comprometida la viabilidad durante el ciclo de vida de la mosca. La evaluación rutinaria de las poblaciones utilizando este ensayo puede prevenir la acumulación de mutaciones secundarias que pueden afectar el fenotipo del mutante originalmente aislado, especialmente si las mutaciones originales afectan la aptitud. Por esta razón, nuestro laboratorio mantiene múltiples copias de cada uno de nuestros alelos Dm ime4 y comprueba rutinariamente la pureza de cada stock con este método además de otros análisis moleculares.

Este método permite medir de forma precisa y reproducible la viabilidad de los embriones a los adultos emergidos cuando se acopla a análisis cuadrados de chi.
En los estudios iniciales, después de contar embriones y larvas, el agar de uva se colocó dentro del vial en posición vertical en el lado del vial. Desafortunadamente, cuando el agar se colocó en el lado del vial muchos de los embriones y larvas no maduraron para adultos. Esto fue probablemente debido a que el disco de agar de uva se secó (Figura3). Esta colocación introdujo una variable ambiental (hidratación del disco de agar) que podría confundir los resultados. Aproximadamente el 39% de la progenie se perdió entre embriones y adultos, ya que sólo el 61% de los adultos emergieron. Las mayores pérdidas ocurrieron entre las larvas L1 (contadas en la superficie de las placas de agar de uva) y las pupupas (contadas en paredes de viales de alimentos) cuentan. Sin embargo, cuando el agar de uva fue colocado hacia abajo dentro del vial en contacto directo con la superficie de los alimentos, se perdió menos del 6% de la progenie (Figura2). El agar permaneció hidratado ya que todo el disco de agar uva permaneció en contacto con la humedad del alimento instantáneo dentro del vial (Figura7, Figura 8). Estos resultados indican que la posición del agar dentro del vial es importante para obtener datos fiables y minimizar la contribución de las variables ambientales. Se recopilaron más datos para apoyar la eficacia del método comparando la progenie de tipo salvaje utilizada en la validación del método inicial y la progenie producida por el cruce de hembras vírgenes de tipo salvaje a machos de una reserva mutante Dm ime4 equilibrada ( Figura suplementaria 2, ime4-null/TM3sb). Aproximadamente el 91% de la progenie madura a la edad adulta en comparación con el 94% de la progenie del tipo salvaje (Figura4).  Esta diferencia no fue estadísticamente significativa.
Homozygous Dm ime4 machos mutantes5 también se utilizaron para proporcionar una validación adicional del método. Sin embargo, los mutantes homocigotos estaban demasiado enfermos para reproducirse y murieron antes de que los embriones fueran depositados. Por lo tanto, una limitación del experimento es que los machos necesitan estar lo suficientemente sanos como para reproducirse para generar una población de embriones iniciales para rastrear.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig1.jpg"> Figura 1 : Las poblaciones mutantes dm ime4 emergen a niveles sub-mendelianos. Se muestran las existencias en las que se mutaron partes del dominio catalítico o del dominio de enlace Ado-Met (consulte la figura suplementaria 1 para obtener más información). Algunas acciones tenían partes de cualquiera de los dominios reemplazadas por Ala (mutagénesis de escaneo alanina), mientras que otras acciones habían eliminado uno o ambos dominios. La relación entre el número observado de homocigotos y los números esperados se representa en porcentajes (en comparación con los controles hermanos heterocigotos, consulte la Figura suplementaria 3 para el esquema de clasificación y el análisis cuadrado de chi). Se realizaron análisis cuadrados de Chi para determinar si la diferencia entre observada y esperada fue estadísticamente significativa y no se debió únicamente al azar (valores p &lt; 0,01). Las barras de error representan un error estándar de la media (mínimo de tres ensayos por cruz indicada).  Una hoja de cálculo con todos los datos se puede encontrar en Materiales Suplementarios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig2.jpg"> Figura 2 : La posición del agar dentro del vial puede introducir variables ambientales no deseadas. Histograma del número de individuos en diferentes etapas de desarrollo contados a partir del lado del embrión del disco de agar de uva en vial de alimento o agar en el lado del vial de alimentos. Colocar el lado embrionario del disco de agar hacia abajo en el vial dio lugar a un 94% (SD a 0,02) de embriones iniciales que sobrevivieron hasta la edad adulta. Colocar el agar en el lado del vial de alimentos dio como resultado sólo el 61% (SD a 0,07) de los embriones originalmente contados que alcanzan la edad adulta. Una hoja de cálculo con todos los datos se puede encontrar en los Materiales Suplementarios. Los números esperados en cada etapa se establecen como el número inicial de embriones/L1 contados en el disco de agar uva antes de transferirse al vial de alimentos (hipótesis nula: se desarrollan el 100% de los embriones eclosionados). Los números observados son el número real de individuos contados para la etapa de desarrollo indicada. Por lo tanto, cada etapa se compara con el número inicial de embriones eclosionados contados en la placa de agar de uva. Se realizaron análisis cuadrados de Chi para determinar si la diferencia entre observada y esperada fue estadísticamente significativa y no se debió únicamente al azar utilizando un umbral de valor p de 0,05. La diferencia fue significativa para los embriones cultivados con agar en el lado del vial de alimentos, pero no para aquellos cultivados en un lado de embrión de disco hacia abajo. Las barras de errores representan un error estándar (mínimo de tres ensayos por cruz indicada). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig3.jpg"> Figura 3 : Los dibujos animados que muestran dos formas en que se pueden colocar discos de agar de uva que transportan embriones/L1 dentro del vial de alimentos. Hubo una diferencia significativa entre el número total de embriones y la progenie adulta en función de la posición del agar en el vial de alimentos. La diferencia se deriva de una variable ambiental (hidratación) creada por la diferencia en la colocación del disco dentro del vial de alimentos: hay una diferencia estadísticamente significativa entre los números esperados y observados en las larvas y las pupupas cuenta cuando el agar disco se colocó en el lado del vial frente a ninguna diferencia significativa en los números esperados frente a los observados cuando el disco de agar estaba en contacto con el alimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig4.jpg"> Figura 4 : Histograma que muestra el número de individuos en diferentes etapas de desarrollo de machos de tipo salvaje frente a machos de un stock equilibrado mutante Dm ime4. Los machos equilibrados cruzaron a hembras vírgenes de tipo salvaje como se describe en 2.1.  El agar fue transferido del lado embrionario hacia abajo en viales de alimentos.  La proporción media de adultos que emergen de los embriones originales contados en discos de agar de uva de tipo salvaje X de tipo salvaje fue del 94%, SD a 0,02, mientras que esa proporción para el tipo salvaje Dm ime4 mutant/+ X fue del 91%, SD a 0,01. El análisis estadístico se realizó como se describe en la Figura2; diferencias no fueron significativas para ninguno de los dos grupos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig5.jpg"> Figura 5 : Configuración experimental. (A) Mini-jaulas de la colección Embryo y mini-Petri de uva-agar. Las placas se colocan dentro de una cámara húmeda (plato Petri estándar con disco de papel absorbente saturado de agua) para evitar la deshidratación.  Se colocó una pequeña cantidad de pasta de levadura en el centro de cada plato de uva-agar.  (B) Separe la tapa del soporte de la placa de recogida de embriones (roja) y coloque una placa preparada, lado de levadura hacia arriba.  (C) Transfiera la cruz a la jaula embrionaria e coloque inmediatamente una tapa de la placa Petri para sujetar las moscas dentro.  (D) Retire rápidamente la cubierta y voltee la jaula embrionaria para que la apertura entre en contacto con la placa de agar de uva.  Incubar durante 24-48 h, inspeccionando diariamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig6.jpg"> Figura 6 : Desarrollo de embriones en placas de uva-agar. (A) Los embriones de tipo salvaje depositados en los platos mini-Petri de uva-agar se cuentan bajo un microscopio de disección. Mantenga las placas dentro de la cámara húmeda cuando no visualice y evite la luz directa para evitar la deshidratación.  (B) Las placas de agar de uva se mantienen en una cámara húmeda y se registran embriones de tipo salvaje eclosionados.  Esta foto muestra tres larvas de tipo salvaje L1 que se desarrollaron a partir de embriones mostrados en A.  (C) Ejemplo de números registrados de embriones (día 1) y larvas L1 (día 2) para las dos placas que se muestran en la Figura 5.  El "número esperado" para la hipótesis nula está determinado por el número de embriones que eclosionaron y se convirtieron en larvas L1 en el momento de la transferencia al vial de alimentos (tabla a continuación).  Para las moscas de tipo salvaje, casi todos los embriones eclosionan y se convierten en larvas L1.  Este puede no ser el caso de otros antecedentes genéticos y este método se utiliza para determinar estas diferencias en la viabilidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig7.jpg"> Figura 7 : Transferencia de larvas.  (A) Después de registrar los recuentos de L1, los discos de agar de uva se retiran cuidadosamente de la placa Petri utilizando una espátula limpia (tordiente de etanol) (B,C) y se transfieren L1 de lado hacia abajo para entrar en contacto con el alimento en los viales como se muestra en D.  (E) La placa vacía de Petri se inspecciona cuidadosamente para detectar las larvas que queden atrás.  Si las larvas que quedan están vivas y se pueden transferir al vial de alimentos, hágalo con cuidado e inmediatamente (F).  Si las larvas que quedan están muertas o no se pueden transferir, registre este hecho para corregir el "número esperado" para los cálculos posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig8.jpg"> Figura 8 : Las larvas L2 se ensuman en lacomida. Ver grietas y ranuras entre el disco de agar de uva y la comida azul.  Establecer un horario para observar los viales diariamente, preferiblemente a la misma hora del día. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig9.jpg"> Figura 9 : Emergencia adulta. (A) Las larvas L3 salen de los alimentos para convertirse en pupupas.  (B) Los adultos comienzan a emerger el día 11.  Establezca un horario para observar los viales diariamente, preferiblemente a la misma hora del día y registre cuidadosamente sus observaciones.  Deja de contar cuando todas las puas han surgido (cuentan los casos de puas vacías) y evita contar la próxima generación de moscas deteniendo el experimento en el día 15 y cuenta las puas muertas si las hay (pusilas negras/secas).  Los mutantes con ciclos de vida más largos pueden necesitar períodos de tiempo más largos, que deben determinarse empíricamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cifras suplementarias. Haga <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">clic aquí para descargar estos archivos.</a>  
Materiales Suplementarios. Haga <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Materials.zip" target="_blank">clic aquí para descargar estos archivos.</a>

Este protocolo está diseñado para evaluar la viabilidad de Drosophila en cada etapa del desarrollo, desde el embrión hasta el adulto. El método se puede utilizar para determinar y comparar la viabilidad de diferentes genotipos o condiciones de crecimiento.

Un método directo y simple para evaluar la viabilidad de Drosophila melanogasterde Embryo a Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

La principal ventaja de este ensayo es la simplicidad y la precisión porque no requiere un enjuague embrionario para transferirse al vial de alimentos y que evita pérdidas por errores técnicos. Este protocolo no requiere habilidades técnicas expertas. Sin embargo, el momento adecuado y la transferencia cuidadosa de agua son importantes para su precisión y reproducibilidad.Demostrar este procedimiento estará Antonio Rockwell, un estudiante de doctorado recién graduado de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, vierta el agar de uva en una placa de Petri de 35 milímetros a medio lleno y deje que el agar se solidifique durante una hora. Cuando el agar se haya solidificado, utilice un pequeño cuchillo de plástico para rascar suavemente la superficie del agar alrededor del exterior de la placa, dejando el centro de la placa libre de arañazos.A continuación, coloque una pequeña cantidad de pasta de levadura recién preparada en el centro del plato y coloque el plato en una mini jaula de recolección de embriones. Para la recolección de embriones, primer lugar dos hembras Drosophila vírgenes y un macho joven dentro de la jaula de recolección durante 24 horas. Al día siguiente, inspeccione la parte inferior de la placa de agar para buscar embriones.Si se han colocado embriones, transfiera la placa de agar a una cámara húmeda y cubra la placa con la tapa para evitar la deshidratación. Si se van a anotar varios días de colocación, coloque una nueva placa de agar en la jaula de recogida. Utilice el microscopio para determinar el número de embriones eclosionados y larvas L1, y devuelva los embriones a la cámara húmeda a temperatura ambiente hasta que todos los embriones hayan eclosionado y se hayan desarrollado en larvas L1.Después de 48 horas, cuente el número de embriones eclosionados y larvas L1 y utilice una espátula para retirar cuidadosamente el disco de agar de uva de la placa Petri, colocando el disco L1 lado hacia abajo en el alimento en un vial de alimentos lo suficientemente grande como para acomodar el disco. A continuación, inspeccione cuidadosamente el plato de Petri en busca de las larvas restantes. Monitoree el vial de alimentos diariamente aproximadamente a la misma hora cada día para confirmar que se pueden observar las larvas L2 y L3 haciendo su camino a los alimentos.Registre el número de pupas y Drosophila adultas, continuando contando hasta que no se observen más adultos y evitando contar la generación posterior. A continuación, realice un análisis chi-cuadrado. La hipótesis nula supone una viabilidad del 100%, de modo que el número de adultos será igual al número de embriones eclosionados y L1 registrados originalmente y transferidos a los viales de alimentos.Cuando el agar se coloca en el lado del vial, muchos de los embriones y larvas no maduran para adultos, probablemente debido a la deshidratación del disco de agar de uva. Cuando el agar de uva se coloca boca abajo dentro del vial en contacto directo con la superficie del alimento, menos del 6% de la progenie se pierde típicamente, ya que el agar permanece hidratado mientras está en contacto con la humedad del alimento instantáneo dentro del vial. En este experimento representativo comparando el desarrollo de progenie mutante y de tipo salvaje, aproximadamente el 91% de la progenie mutante maduró hasta la edad adulta usando este método en comparación con el 94% de la progenie de las moscas de tipo salvaje.Recuerde transferir el embrión del disco de agar hacia abajo en el vial de alimentos y luego, para comprobar el plato vacío de Petri en busca de larvas restantes que no se transfirieron. Otro paso crucial es transferir el disco de agar a un vial de alimentos a más tardar 48 horas después de retirar la placa de agar de uva de las mini jaulas de recogida de embriones para evitar la deshidratación.

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Investigación

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