Prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido postmortem de campo para la configuración de recursos limitados con otras aplicaciones moleculares

Este protocolo se puede utilizar para el diagnóstico postmortem de la rabia animal desde la vista inicial de la dicción en el campo hasta la conformación molecular en un nivel centralizado de actividad. Las pruebas de diagnóstico inmunocromatográfico rápido son una alternativa útil para los rasgos rurales y rurales en Africa y Asia en los que no se dispone de materiales de referencia para el diagnóstico de la rabia. Demostrando el procedimiento estará Simon Bonas un técnico de mi laboratorio.

Demostrando la primera parte del procedimiento estará Ibrahima Dicko, una técnica del Laboratoire Central Veterinaire en Bamako, Malí. Para acceder al foramen magnum, utilice un cuchillo para extraer la cabeza del animal antes de las primeras vértebras cervicales. Y usa una herramienta apropiada para recolectar una muestra de tallo cerebral.

Como una pipeta desechable, paja para beber, abrazadera o cuentagotas como se muestra aquí. El tallo cerebral es entonces claramente visible como se muestra aquí con la punta de esta pipeta. Utilice una herramienta adecuada para recoger una parte de este tallo cerebral, como una pajita para beber.

Insértelo cuidadosamente y gire suavemente para recoger el tejido cerebral. No olvide tapar la pajita con el dedo antes de extraerla, para recoger la biopsia. El uso de una abrazadera también es posible.

Con el fin de recoger piezas más grandes de tallo cerebral a nivel del foramen magnum. Alternativamente, es posible utilizar directamente el gotero proporcionado en el kit para recoger el tallo cerebral. De forma similar a la pajita para beber, inserte el cuentagotas cuidadosamente mientras presiona y gire suavemente para recoger el tejido cerebral.

Luego aspirar el tejido cerebral y colocarlo en un recipiente como el tapón de un tubo. Para un diagnóstico preciso es fundamental recoger el tronco encefálica que contiene la médula ablongata, durante la recolección de la muestra. Aplaste cuidadosamente el material cerebral directamente en el tubo que contiene el tampón con el hisopo o cuentagotas durante unos 30 segundos hasta obtener una suspensión homogénea.

Con el cuentagotas, deposite cuatro gotas de aproximadamente 100 microlitros de la suspensión en la entrada de la muestra en el dispositivo de prueba. En caso de retraso debido a la suspensión de alta viscosidad o para acelerar el inicio de la migración, rasque suavemente la parte inferior del sitio de depósito del dispositivo con el cuentagotas. Espere la migración de muestra completa, de uno a cinco minutos antes de leer el dispositivo de prueba.

Una muestra se considera positiva para la rabia cuando dos líneas son visibles. Negativo, si sólo está presente la línea de control. Y no es válido si solo la línea de prueba o ninguna línea está visible.

Para extraer el ARN de una muestra de dispositivo, abra cuidadosamente el dispositivo y retire el papel de filtro. Recoja el área de depósito de la muestra y coloque la muestra en un mililitro de trireagente LS. Después de una hora a temperatura ambiente con agitación manual suave regular, extraiga el ARN de los tubos sobrenadantes de acuerdo con los protocolos estándar de extracción de ARN. Adición de dos microlitros de glucógeno para facilitar la precipitación de ARN de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes.

Ajuste el volumen final de la resuspensión del ARN a 50 microlitros con agua libre de nucleasas. Y prepare la solución de reacción de mezcla maestra para los tres ensayos de PCR cuantitativos de la transcriptasa inversa diferentes de acuerdo con la tabla. Usando las imprimaciones y sondas como se indica en la tabla.

A cinco microlitros de las muestras de ARN diluido. Y 15 microlitros de mezcla maestra a cada uno de los tres ensayos diferentes por duplicado en las placas de reacción de 96 pozos apropiadas. Agregue los controles positivos y negativos adecuados para cada ensayo a cada placa por duplicado.

A continuación, ejecute los diferentes ensayos siguiendo las condiciones de ciclo térmico indicadas en la tabla. Los resultados se pueden analizar como se describe en la tabla. La recolección de una biopsia cerebral es lo más simple posible para garantizar la recolección de muestras de alta calidad.

En comparación con la técnica de referencia, la sensibilidad y especificidad de la prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido fue alta en todos los laboratorios que utilizan estos protocolos. Sobre la base del número acumulado de muestras analizadas, la sensibilidad y especificidad global fueron superiores al 95%La prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido es adecuada para detectar lisavirus en biopsias cerebrales de animales infectados. Sin embargo, dado que el nivel de antígenos de lisavirus es importante para el diagnóstico de la rabia, el límite de detección sigue siendo alto al analizar suspensiones de virus valorados.

En estos resultados representativos, obtenidos después de la detección de ARN por doble combinación de la transcriptasa inversa PCR cuantitativa dirigida a la polimerasa viral de lisavirus, se realizó un panel de 51 pruebas de diagnóstico inmunocromatográfico rápido positivo. Además, se podría realizar un genotipado durante catorce de las muestras utilizando la focalización de PCR hemi-anidada del gen de nucleoproteína parcial. Diagnóstico y extracción para la tira de prueba para genotipado basado en después de RT PCR, o por para el análisis de cadena larga adicional.

La prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido puede proporcionar un diagnóstico rápido y preciso de la rabia. Lo cual es crucial para mantener la función de onda en sistemas continuos de vigilancia y control basados en ondas. Y minimizando las cosas humanas.