Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón
17 de diciembre de 2019
Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.
El corazón contiene población heterogénea de células inmunitarias que desempeñan un papel crucial en la inflamación cardíaca, así como la reparación. Con el fin de entender la heterogeneidad de las células inmunitarias y obtener más información sobre su función, es importante tener un método que permita la recuperación de estas células del corazón. Esta técnica puede ayudar a descubrir la diversidad celular inmune, así como no no inmune que reside en el corazón sano o enfermo.
Esta técnica tiene tres ventajas principales. En primer lugar, es un flujo de trabajo único simple que conduce a la generación de suspensión de una sola celda de varios tipos de celdas dentro de las tres horas de tiempo. En segundo lugar, conduce a una alta recuperación de poblaciones de células inmunes y no no inmúnticas viables.
Y en tercer lugar, es un método muy versátil y se puede aplicar a los tejidos del corazón en otras especies también. Prestar atención a la cantidad de tejido utilizado para una sola reacción de digestión es importante. Utilice tijeras estériles, diseccione la muestra de tejido de la pared apical o lateral del ventrículo izquierdo en solución salina fría o HBSS.
Diseccionar cuidadosamente la grasa epicardial y las tendineas cordae del espécimen. Con la ayuda de una cuchilla estéril o tijeras, disecciona los trozos de tejido en trozos que pesen aproximadamente 200 miligramos. Después de eutanasiar el ratón, abra la cavidad torácica con la ayuda de tijeras afiladas.
Usa hemostats contundentes para elevar el corazón hacia arriba. Perfuque el corazón con PBS frío utilizando una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de cinco mililitros. Perfuse hasta que el corazón aparezca blanqueado en color.
Retire el corazón y colóquelo en un plato estéril de Petri sobre hielo. Coloque 200 miligramos de trozos de tejido cardíaco humano o corazón murino en una placa estéril de Petri. Picar finamente el tejido usando una cuchilla estéril o tijeras.
Para establecer digestiones, en un tubo cónico de 15 mililitros, prepare un volumen de digestión final de tres mililitros para cada trozo de tejido cardíaco humano o un corazón murino con enzimas colagenasa I, DNase I e hialuronidasa a concentraciones de 450, 60 y 60 unidades por mililitro. Añadir 2,5 mililitros de DMEM en el tubo. Con la ayuda de fórceps limpios, coloque el tejido finamente picado en cada tubo de reacción.
Mezclar bien por vórtices suaves. Digerir durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora de temblores a una velocidad de agitación baja a media. Después de una hora de digestión, saque los tubos de la incubadora y colóquelos en hielo.
Configure tubos cónicos de 50 mililitros con un colador celular de 40 micras en la parte superior. Humedezca los filtros con dos mililitros de tampón de desactivación de enzimas. A continuación, desactive las enzimas de digestión añadiendo ocho mililitros de tampón de desactivación de enzimas a cada tubo de digestión.
A continuación, vierta los 13 mililitros resultantes de la mezcla total a través del colador celular de 40 micras en los tubos cónicos de 50 mililitros. Transfiera las muestras filtradas en tubos cónicos frescos de 15 mililitros. Girar las muestras a 400 veces g durante seis minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante dejando 0,5 mililitros de medios. Resuspender el pellet celular por pipeteo suave y añadir un mililitro de tólomo de lelisis ACK. Suave girar el tubo e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos para realizar la lelisis de glóbulos rojos.
Después de cinco minutos en el búfer ACK, agregue nueve mililitros de DMEM a la muestra. Vuelva a colocar la tapa en los tubos e invierta suavemente los tubos para mezclar. Filtrar a través de un colador celular de 40 micras y recoger el filtrado en tubos cónicos de 15 mililitros.
Centrifugar los tubos a 400 g durante seis minutos y deseche el sobrenadante. Añadir un mililitro de tampón FACS y resuspend el pellet. A continuación, transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar de nuevo a 400 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 microlitros de tampón FACS. Una suspensión de una sola célula ya está lista para la tinción de anticuerpos.
Agregue un panel de anticuerpos humanos típico a las muestras del corazón de una a 50 dilución. Utilice diferentes anticuerpos para las células estromales y los macrófagos cardíacos murinos. Incubar durante 30 a 40 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Añadir un mililitro de tampón FACS, vórtice suave y centrífuga a 400 veces g durante cinco minutos. Repita este paso de lavado una segunda vez. A continuación, resuspender la muestra en 350 microlitros de tampón FACS y añadir DAPI para alcanzar una concentración final de un micromolar.
Las muestras ya están listas para el análisis FACS. En este protocolo, se logró el aislamiento de macrófagos del ratón y del miocardio humano. Esta figura muestra el núcleo LVAD humano no procesado y procesado.
Se presentó el esquema de medición para la clasificación de flujo de macrófagos humanos CCR2 negativos y CCR2 positivos del miocardio humano, así como para células estromales negativas CD45 de cardiomiopatía isquémica humana. Las imágenes de las células CD45 positivas y CD45 teñidas de Wright muestran una membrana celular intacta que indica viabilidad. El esquema de gating para ordenar los macrófagos de un corazón de ratón también tuvo éxito.
El peso del tejido utilizado para la reacción enzimática es fundamental para una digestión eficiente. No utilice más de 200 miligramos de tejido para las concentraciones enzimáticas indicadas en el protocolo. Después de este método, las células se pueden cultivar para ensayos de estimulación in vitro.
Las células se pueden ordenar para la secuenciación de ARN a granel o la secuenciación de una sola célula. Este método ha servido como una técnica invaluable en el descubrimiento de la heterogeneidad de macrófagos previamente no reconocidos que está presente en el corazón humano sano o enfermo. Usando este método seguido de secuenciación de una sola célula, se están llevando a cabo estudios para descubrir cómo varias células inmunes y no no no- no+ nulas varían desde el corazón enfermo en comparación con el corazón sano.
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Resumen
Este protocolo describe un método para aislar diversos subconjuntos de macrófagos y células no inmunitarias del miocardio humano y murino. Al preparar una suspensión de células individuales mediante digestión enzimática, los investigadores pueden comprender mejor la heterogeneidad de las células inmunitarias en la inflamación y la reparación cardíacas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología cardiovascular
- Inmunología
Antecedentes
- El corazón contiene una población diversa de células inmunitarias.
- Estas células desempeñan funciones cruciales en la inflamación y la reparación cardíacas.
- Comprender su heterogeneidad es esencial para estudiar la salud del corazón.
- Esta técnica facilita la recuperación de células inmunitarias y no inmunitarias del corazón.
Objetivo del estudio
- Aislar y caracterizar macrófagos y otros tipos celulares del miocardio.
- Revelar la diversidad de células inmunitarias y no inmunitarias en corazones sanos y enfermos.
- Proporcionar un método confiable para estudiar las respuestas inmunitarias cardíacas.
Métodos Utilizados
- Digestión enzimática para preparar suspensiones de células individuales.
- Citometría de flujo para la identificación y caracterización de células.
- Aislamiento de diversos tipos celulares del miocardio humano y murino.
- Flujo de trabajo sencillo completado en menos de tres horas.
Resultados principales
- Alta recuperación de poblaciones celulares viables inmunes y no inmunes.
- Aislamiento eficaz de subpoblaciones de macrófagos.
- Se demostró la heterogeneidad de las células inmunes en el tejido cardíaco.
- Facilitó investigaciones posteriores sobre los mecanismos de inflamación y reparación cardíaca.
Conclusiones
- Esta técnica proporciona una herramienta valiosa para la investigación cardíaca.
- Mejora la comprensión de los roles de las células inmunitarias en la salud del corazón.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para explorar enfermedades cardíacas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la heterogeneidad de los macrófagos en el tejido cardíaco es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos cardiovasculares. Este protocolo permite el aislamiento reproducible de subpoblaciones inmunitarias y estromales a partir del miocardio humano y murino, apoyando estudios mecanicistas que aportan confianza en las dianas y ayudan a priorizar carteras de desarrollo. La simplicidad del método y su aplicabilidad cruzada entre especies mejoran la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las funciones de los subconjuntos de macrófagos en las vías de inflamación y reparación cardíaca.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado para aislar células inmunitarias y no inmunitarias viables con variación mínima de un día a otro.
- Valor estratégico: Apoya la validación de objetivos basada en hipótesis al aclarar los contribuyentes celulares a los fenotipos de la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera poblaciones celulares purificadas adecuadas para ensayos funcionales y aplicaciones omicas posteriores.
- Valor operativo: Proporciona un alto rendimiento de células viables dentro de un protocolo de tres horas, lo que permite la estandarización de ensayos.
- Valor estratégico: Facilita la preparación a escala de sistemas relevantes para la enfermedad, destinados a estudios de cribado de compuestos y de interacción con dianas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Permite la comparación directa de los perfiles de células inmunitarias y estromales entre corazones humanos sanos y enfermos.
- Valor operativo: Compatible con secuenciación de ARN en masa y de célula individual para el descubrimiento de biomarcadores y la reducción mecanicista de riesgos.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de fenotipos celulares a estados patológicos a través de especies.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la investigación preclínica, permitiendo el aislamiento de tipos celulares mecanísticamente relevantes para análisis funcionales y genómicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el aislamiento de subpoblaciones definidas de macrófagos y estromales.
- Tamizaje: Produce suspensiones celulares estandarizadas y viables adecuadas para el desarrollo de ensayos y el tamizaje de compuestos.
- Análisis: Genera entradas cuantitativas para citometría de flujo, secuenciación y lecturas funcionales que permiten el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la aplicabilidad cruzada entre especies y el uso de muestras relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el perfilado inmunitario en modelos de enfermedades cardiovasculares y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en la patología cardíaca mediada por el sistema inmunitario.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad y escalabilidad mediante un flujo de trabajo sencillo y eficiente en cuanto al tiempo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar una desestimación biológica temprana de los objetivos cardiovasculares.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en mecanismos celulares validados en modelos de enfermedad humanos y murinos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disociación enzimática de tejidos, citometría de flujo y manipulación estéril de células.
- Depende del acceso a colagenasa I, DNasa I, hialuronidasa, tampón de lisis ACK y equipos compatibles con FACS.
- Necesita protocolos estandarizados de disección de tejidos (por ejemplo, fragmentos de 200 mg del ventrículo izquierdo apical/lateral) para garantizar la eficiencia de la digestión.
- Requiere la adaptación de paneles de anticuerpos para marcadores específicos de especie de macrófagos y células estromales (por ejemplo, CCR2 para humanos, CD45 para ratones).
- Limitado por la calidad y cantidad del tejido de entrada; pueden obtenerse rendimientos subóptimos con muestras fibrosas o calcificadas.
