Name: Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende protocolos estandarizados de preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido en embriones de tortuga pintada, cáscaras de huevo rígidas y cultivos fúngicos.

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Los autores quieren agradecer al Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego por sus útiles discusiones y comentarios sobre el manuscrito. Este estudio fue apoyado por Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge Concede a SUNY Oswego y a la National Science Foundation (NSF) pequeñas subvenciones a PGL y JG.

NOTA: Los huevos de tortuga pintada (Chrysemys picta) utilizados en este estudio fueron recogidos durante la temporada de anidación de mayo a junio de 2015-16 de Rice Creek Field Station, Oswego New York con permiso obtenido del Departamento de Medio Ambiente del Estado de Nueva York Conservación (DEC).
1. Método de secado químico para procesar embriones para SEM
<ol><li>Recoger huevos de tortuga de sitios de campo durante la temporada de anidación. Preparar las cámaras de incubación con antelación, hechas de cajas de plástico con tapas (L x An x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm llenas de medio de cama preparado con una mezcla húmeda de vermiculita y musgo de turba (1:1 relación). Hacer 4-6 agujeros de aproximadamente 0,25 cm a lo largo de los lados de las cajas y en la tapa para permitir la aireación.</li>
	<li>Retire suavemente el suelo del nido para descubrir los huevos. Limpie la superficie de los huevos de tortuga con tintura de yodo diluido (1:25.000) para controlar la contaminación microbiana durante la incubación. Coloque las garras separadas entre sí, el tamaño del embrague de la tortuga pintada puede variar de 5-9 huevos y colocar un máximo de 8-9 huevos por caja. NOTA: Manipule cuidadosamente los huevos durante la recolección, limpiando, etiquetando y colocando dentro de las cajas. La posición y la alineación de los óvulos deben ser las mismas que se establecieron, cualquier movimiento inhibirá el desarrollo embrionario.</li>
	<li>Entierra manualmente los huevos la mitad en la ropa de cama, cubre y coloca la caja dentro de la incubadora a 30oC. Incubar los óvulos durante 10-17 días para obtener las etapas embrionarias 12, 13 y 18 utilizadas respectivamente en este estudio. Añadir agua destilada para humedecer parcialmente el medio de cama cada dos días para evitar la deshidratación y mantener el nivel de humedad para el desarrollo normal de los embriones. NOTA: Los embriones de incubación y puesta en escena se realizan de acuerdo con una tabla de desarrollo completa publicada anteriormente39.</li>
	<li>Fijar los embriones haciendo el primer corte en un lado de la cáscara de huevo dorsal y la membrana de la yema juntos, vertical al eje largo utilizando tijeras puntiagudas. Inserte las tijeras en la yema cuidadosamente para evitar cortar el disco embrionario. Ahora corte el lado lateral del huevo a lo largo del eje largo y luego corte el otro lado del huevo a lo largo del eje corto.</li>
	<li>Abra la pieza extirpada con el lado del embrión hacia arriba usando fórceps. Corte el otro lado lateral de la cáscara de huevo y coloque la pieza extirpada en solución salina tamponada de fosfato (PBS a un pH de 7,4). NOTA: El huevo de tortuga está lleno de yema de huevo altamente viscosa y el lado dorsal del embrión se adhiere a la membrana de la cáscara de huevo. La membrana de cáscara de huevo cerca del embrión cambia con la incubación de blanco translúcido a un blanco opaco y calcáreo. Esto permite ubicar el embrión en el centro del eje largo y ser visto como un punto calcificado oscuro desde el exterior40,41.</li>
	<li>Utilice un estereomicroscopio para aislar los embriones junto con la membrana de la yema pelándolos de la cáscara de huevo usando fórceps. Retire las membranas extraembrionarias utilizando fórceps y microtijeras. Transfiera el embrión usando una cuchara de embrión a PBS fresco en un plato de Petri para lavar cualquier sangre o yema.</li>
	<li>Utilice placas claras de 12 pocillos para fijar los embriones durante la noche en un 4% de paraformaldehído en PBS a 4oC o en 2-3% de glutaraldehído en PBS. Coloque de uno a tres embriones en cada pozo dependiendo del tamaño de los embriones. Asegurar una infiltración completa (las muestras aparecerán blancas) para embriones más viejos extendiendo el tiempo de fijación durante 2-3 días. Enjuague los embriones 3veces con PBS fresco durante 5 min cada enjuague. NOTA: Evite dañar la superficie del embrión utilizando inserciones de poliestireno con fondos de malla de poliéster para placas de 12 pocillos para transferir muestras de un disolvente a otro.</li>
	<li>Deshidratar muestras utilizando una serie de concentraciones de etanol en agua destilada: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% y 100% y tratar muestras durante 1 h en cada solución de deshidratación. Repita el paso con 100% de etanol dos veces para asegurar una deshidratación completa. Si no se utiliza inmediatamente, almacene las muestras en etanol al 70% a -20 oC durante un período más largo.</li>
	<li>Embriones secos utilizando una serie de hexametildisilazana (HMDS) a 100% concentración de etanol: 1:2, 2:1 y 100%. Deje las muestras en cada solución durante 20 minutos y mantenga la placa Petri parcialmente cubierta durante el proceso. NOTA: Lleve a cabo todos los pasos que impliquen HMDS en la campana de humos con el equipo de protección personal necesario, ya que HMDS es altamente tóxico.</li>
	<li>Deje los embriones en la solución final 100% HMDS cubierta total o parcialmente en una campana de humo durante la noche ayudando en evaporación de HMDS, dejando las muestras listas para el montaje y el recubrimiento de esputo. Cubra el plato para eliminar el desasover el polvo sobre las muestras. NOTA: El tejido aparecerá blanco después de un secado completo y las muestras parcialmente secas se verán de color amarillo, dejar estos tejidos en la campana de humos durante más tiempo.</li>
	<li>Elija el tamaño de los talones de aluminio y la cinta adhesiva de carbono por tamaño de la muestra analizada. Monte las muestras secas cuidadosamente en un talón de pasador de aluminio estándar (12,7 mm x 8 mm) utilizando cinta conductora de carbono de doble palo (12 mm).</li>
	<li>Introducir muestras montadas en la cámara de la recubridora de esputo para recubrir la muestra con una película muy delgada de oro para eliminar el efecto de carga. Placa de oro de los especímenes para 60-120 s en un sputter de 35 mA.</li>
	<li>Monte los talones en las placas de poro correspondientes fijando firmemente los tornillos. Transfiera el portamuestras dentro o fuera de la cámara de muestras de SEM utilizando la herramienta de intercambio de muestras. Imagen de las muestras en modo de vacío alto con una tensión de haz de aceleración de 10 kV y corriente de emisión de 10 oA. NOTA: Use siempre guantes mientras manipula muestras, portamuestras, talones de montaje y herramientas de transferencia para evitar la contaminación por grasa de las manos al sistema SEM.</li>
	<li>Pruebe las técnicas alternativas enumeradas a continuación para comparar la resolución de las muestras obtenidas del procedimiento anterior.<ol>
<li>Incluya una post-fijación con 1% de tetróxido de osmio durante 1 h a temperatura ambiente después del paso 1.7.</li>
		<li>Retire parcial o completamente el HMDS en el paso 1.10 para una rápida evaporación rápida de HMDS.</li>
		<li>Procesar embriones después del paso 1.8 utilizando el secado de punto crítico (CPD) siguiendo los pasos 3.3-3.4.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de la cáscara de huevo para SEM utilizando un método de secado al aire
<ol><li>Recoger e incubar los huevos de tortuga pintada (Chrysemys picta) para fijar los embriones como se especifica en los pasos 1.1-1.7.</li>
	<li>Ahorre cáscaras de huevo en agua destilada después de la fijación embrionaria en el paso 2.1. Limpie bien las cáscaras de huevo remojándolas en agua destilada durante al menos 1 h para eliminar la contaminación por yema y albúmina.</li>
	<li>Cáscaras de huevo secas al aire después de lavarse delicadas toallitas antiestáticas en la campana de humos durante la noche. Almacene las cáscaras de huevo secas en botellas de muestras limpias etiquetadas por número y etapa.</li>
	<li>Monte, cubra e iimagene los especímenes siguiendo los pasos especificados en los pasos 1.11-1.13.</li>
</ol>3. Método de secado de puntocrítico crítico para preparar cultivos de hongos para SEM
<ol><li>Establecer cultivos de diapositivas<ol>
<li>Preparar medios de agar dextrosa de patata (PDA) para cultivos de hongos: Añadir 39 g de potencia PDA en 1 L de agua destilada en un matraz Erlenmeyer. Mezcle bien girando el matraz y el autoclave el medio a 121 oC durante 30 minutos. Permita que la solución de medios se enfríe y luego agregue el antibiótico cloramphenicol (25 g/ml) utilizando una micropipette estéril. NOTA: Después de la esterilización, la solución de agar debe estar caliente y no se solidifique pronto. Enfríe lo suficiente para que no inactive los antibióticos.</li>
		<li>Mezclar arremolinando y verter las placas (aproximadamente 10-12 ml de medios para cada plato Petri de 10 cm), apilar cuidadosamente y dejar solidificar.</li>
		<li>Utilice una cuchilla de bisturí estéril para cortar pequeños bloques de agar alrededor de 1/2 a 3/4 de una pulgada. Retire y coloque un bloque de agar en un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio.</li>
		<li>Coloque el portaobjetos en un plato Petri limpio para evitar la contaminación y preservar la humedad durante la incubación.</li>
		<li>Levante el portaobjetos de la parte inferior de la placa Petri usando un palillo estéril para crear tensión superficial entre la placa y la corredera para quitar el portaobjetos de vidrio sin interrumpir el delicado crecimiento después de la incubación.</li>
		<li>Utilice un lazo estéril o una aguja para transferir algunos de los hongos del inóculo de la muestra a cada uno de los cuatro lados del bloque de agar en la diapositiva.</li>
		<li>Coloque un cubreobjetos limpio en la superficie del bloque de agar después de la inoculación. Agregue unas gotas de agua destilada estéril a la placa Petri alrededor del portaobjetos para asegurar la humedad de los hongos en crecimiento.</li>
		<li>Sellar parcialmente la placa con película de parafina e incubar la placa a 30 oC durante un período de tiempo adecuado (para la incubación de especies de Fusarium durante 36 a 48 h).</li>
		<li>Retire el portaobjetos de la placa Petri y separe el cubreobjetos herméticamente del bloque de agar utilizando fórceps estériles. Fijar los bloques de agar en 3% glutaraldehído en PBS durante la noche a 4 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deshidratar las muestras pasando por una serie de etanol: 10%, 25%, 50%, 75% y 90% con 15 min por cambio. Procesar las muestras para la deshidratación final con dos cambios en 100% etanol que duran 30 minutos cada uno para asegurar la saturación completa.</li>
	<li>Secado de punto crítico: Colocar muestras deshidratadas en la cámara del aparato CPD. Selle y enfríe la cámara abriendo las válvulas para permitir la entrada de CO2 líquido y el etanol de ventilación, hasta que el CO2 líquido llene completamente la cámara.<ol>
<li>Sellar y calentar la cámara lentamente para lograr un punto crítico cuando la presión de la cámara supere los 1000 psi y la temperatura supere los 31 oC, la fase de líquido y gas de CO2 está en equilibrio. Drenar lentamente el CO2 de la cámara y la muestra como gas para evitar efectos de tensión superficial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realice el montaje, el chapado en oro y la toma de imágenes de las muestras siguiendo los pasos especificados en los pasos 1.11-1.13.</li>
	<li>Realice análisis comparativos secando químicamente las muestras del paso 3.2 utilizando HMDS siguiendo los pasos 1.9-1.13.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

En nuestro estudio, se probaron diferentes agentes de fijación, métodos de deshidratación y secado para preparar tres muestras biológicas delicadas diferentes para la toma de imágenes SEM: embriones, cáscaras de huevo y cultivos de hongos. El SEM se utiliza comúnmente para el análisis de superficie, por lo que la penetración fijativa es menos preocupante, pero debe entenderse que las estructuras internas mal fijas causarán una contracción interna o/y estructuras superficiales colapsadas. También se debe considerar un tie...

El análisis ultraestructural del microscopio electrónico de barrido (SEM) y la imagen intracelular complementan la microscopía de luz para el perfilado tridimensional de prokaryotes, plantas y animales. La alta resolución espacial de un SEM lo convierte en una de las técnicas más versátiles y potentes disponibles para el examen de las características microestructurales de las muestras a escala de nanómetro a micrómetro. Los especímenes desecados se resuelven en estructuras compositivas y topográficas con detalles intensos, lo que proporciona la base para el desarrollo de conclusiones válidas sobre las relaciones funcionales1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. Al interpretar imágenes SEM de especímenes biológicos, es un gran desafío distinguir entre las estructuras nativas y los artefactos que se crean durante el procesamiento. El SEM generalmente se opera a vacíos muy altos para evitar cualquier interferencia de moléculas de gas que afecte a los haces de electrones primarios, secundarios o retrodispersos emitidos por la muestra10,11. Además, los materiales biológicos son susceptibles a daños por radiación debido a sus propiedades deficientes o no conductoras. Es esencial que los especímenes cargados en el SEM estén completamente secos y libres de contaminantes orgánicos para eliminar cualquier posible desgasificación en un entorno de alto vacío10,11. Dado que los especímenes biológicos se componen principalmente de agua, se requieren técnicas preparativas adicionales para garantizar que las estructuras nativas se mantengan.
La resolución obtenida se basa en la optimización de métodos de preparación específicos para los tipos de muestras y parámetros instrumentales utilizados. Por lo tanto, es necesario evitar el uso de pasos de procesamiento generalizado para todos los tipos de tejido. Algunos especímenes biológicos requerirán un procesamiento menos estricto para preservar su estructura, mientras que podría ser necesario más tiempo y cuidado para los tipos delicados de muestras para evitar la introducción de artefactos de secado, como la contracción y el colapso. La preparación de muestras es un paso crítico en la toma de imágenes SEM; los resultados de los estudios morfométricos están notablemente influenciados por los procedimientos de preparación de muestras12,13. Los pasos de preparación comunes para muchas muestras biológicas son la fijación, deshidratación y recubrimiento con un metal como oro, platino o paladio para convertir sus superficies en conductoras para el análisis SEM. La naturaleza y la combinación de pasos utilizados variarán dependiendo del tipo de tejido, y los objetivos específicos del estudio. La acumulación de carga, la sensibilidad al vacío y el daño del haz de electrones plantean problemas al procesar muestras biológicas delicadas y blandas, lo que requiere pasos de procesamiento adicionales para conservar la estructura nativa del objeto. El uso de métodos convencionales como la fijación de tetróxido de osmio, y la deshidratación causan contracción y el colapso de los tejidos delicados14,15,16,17. El objetivo del estudio es establecer metodologías elegantes derivadas de la combinación de ideas de estudios anteriores con modificaciones para preparar e imaginar tejidos delicados blandos (por ejemplo, embriones de reptiles, cáscara de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos).
La selección de un método de fijación adecuado es el primer paso más importante para el análisis microscópico de muestras biológicas. La fijación de los tejidos inmediatamente después del aisleo de un organismo es esencial para evitar alteraciones en su morfología debido a la descomposición. Un fijador eficaz debe terminar los procesos celulares permeando las células rápidamente y manteniendo el efecto irreversiblemente para estabilizar la estructura de la muestra para soportar tanto los pasos de procesamiento subsiguientes como el examen bajo el SEM17 , 18. Aunque se conocen varios métodos de fijación química y física, la fijación química se utiliza más comúnmente para especímenes biológicos para evitar cualquier cambio celular debido a la autolisis, putrefacción, y efectos de secado. Hay numerosas formulaciones químicas fijativas discutidas en la literatura17,19,20,21,22,23, fijadores que funcionan por desnaturalización y coagulando macromoléculas biológicas, y las que se fijan mediante macromoléculas reticulantes covalentemente. Los alcoholes se utilizan como fijadores desnaturalizantes que preservan muy mal la ultraestructura y se utilizan principalmente para la microscopía de luz y no se recomiendan para el análisis microscópico electrónico. Los fijativos reticulantes como el formaldehído, el glutaraldehído y el tetróxido de osmio crean reticulación intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro de los tejidos, proporcionando una excelente preservación de las ultraestructuras11 ,24,25,26. Las muestras biológicas son sensibles a la temperatura. Se recomienda que la temperatura al comienzo de la fijación sea de 4oC para reducir la movilidad lateral de las proteínas de membrana, ralentizar la difusión de moléculas intercelulares y ralentizar la velocidad de fijación11. El tiempo necesario para la fijación de los tejidos depende en gran medida del tamaño de la muestra y de la velocidad a la que el fijador difunde y reacciona con los componentes de la muestra. Una fijación durante la noche en 4% paraformaldehído o 3% de glutaraldehído en PBS a 4oC es el método preferido para el análisis SEM de los especímenes utilizados en este estudio por sus propiedades penetrantes secuenciales, que permiten procesar muestras delicadas más pequeñas17 , 18 , 19 , 20 , 27. Se elimina un paso posterior a la fijación con tetróxido de osmio no sólo debido a su naturaleza tóxica, sino que también se ha encontrado que no implementa ninguna ventaja adicional para mejorar la calidad de imagen de las muestras analizadas en este estudio.
Las muestras biológicas contienen fluidos que interfieren con el funcionamiento de la SEM; por lo tanto, las muestras deben secarse antes de insertarlas en la cámara de muestras SEM. Una vez asegurada la deshidratación, el disolvente debe retirarse del tejido sin crear artefactos en las muestras debido a la tensión/secado superficial. Tres métodos de secado diferentes se utilizaron comúnmente durante el procesamiento de tejidos para imágenes SEM: secado por aire, secado de punto crítico, y muestras de secado por congelación28,29,30,31. Pocos estudios informan de los tres métodos de secado que producen resultados idénticos con muestras de tejido animal28,29,30,31. Una práctica general utilizada para especímenes más pequeños es la deshidratación química por una serie de concentración ascendente de alcohol y hexametildisilazane (HMDS), pero los especímenes más grandes se secan utilizando un instrumento de secado de punto crítico (CPD)32. Durante el proceso de secado, fuerzas considerables formadas en pequeñas cavidades que pasan a través de la muestra por una interfaz líquido/gas; esto puede incluso conducir a un colapso completo de las estructuras huecas33. Cualquier deformación que se produzca debido al tratamiento podría confundirse como una característica estructural nativa de la muestra. Por lo tanto, se debe eliminar el fenómeno generalizado para el procesamiento y se debe estandarizar un proceso de secado único para cada tipo de tejido, especialmente cuando se analizan muestras de tejido delicadas.
En varios ensayos realizados utilizando varias combinaciones de todos los procesos mencionados, estandarizamos los métodos que se pueden utilizar para el análisis SEM de tres tejidos delicados: embriones de reptiles, cáscaras de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos. Los biólogos y morfologíadels del desarrollo describen la morfogénesis normal y anormal durante el desarrollo embrionario en animales vertebrados representativos. Las investigaciones sobre las vías de señalización génica dependen de la descripción morfológica de las estructuras novedosas. Para evitar cualquier cambio abrupto en la estructura del embrión vertebrado durante el análisis sem, recomendamos el secado químico después de la deshidratación. El secado químico con HMDS es el método de secado relativamente más reciente y las ventajas incluyenrapidez relativa, facilidad de uso, pérdida de costos y la limitada experiencia y equipo necesarios 9. La CPD es una técnica de secado comúnmente utilizada utilizando CO2 de paso a través de las muestras a una temperatura y presión específicas. Identificamos que HMDS es adecuado para secar tejidos blandos delicados y permite procesar muestras más grandes en comparación con el secado de puntocrítico, lo que causó una deformación extensa a los tejidos embrionarios. Se han utilizado varios métodos para preparar muestras para imágenes SEM para estudiar las características morfológicas de los hongos34. Los especímenes fúngicos se fijan comúnmente en tetróxido de osmio seguido de deshidratación de etanol y secado de puntocrítico, lo que puede proporcionar resultados satisfactorios, aunque los efectos tóxicos del tetróxido de osmio6,7,35 y la pérdida de materiales fúngicos mientras se cambian las soluciones durante el procesamiento son desventajas pronunciadas. La técnica de preparación de muestras utilizando secado al aire sin fijación también se ha practicado36, pero resulta en estructuras encogidas y colapsadas, y la observación de tales especímenes puede ser fácilmente malinterpretada mientras se caracteriza la especie. La hifa fúngica pierde su integridad en contacto con líquidos y es posible que no se logre un secado uniforme para restaurar la estructura. Debido a este efecto, secar por congelación se utiliza comúnmente para secar tejidos blandos como el micelio fúngico. El secado por congelación funciona bien para materiales limpios, pero la presencia de cualquier sales o secreción oscurecerá los detalles de la superficie que se identificarán solo en la etapa de visualización del SEM. Acoplamos el método de cultivo de diapositivas con la fijación de glutaraldehído y el secado de punto crítico para producir detalles estructurales de hifas y esporas fúngicas intactas. Aunque el secado por CPD causó contracción en embriones, resultó en estructuras miceliales bien conservadas cuando se combina con la fijación de glutaraldehído. La cáscara de huevo es de importancia primordial para el embrión de animales ovíparos, no sólo actuando como una cubierta protectora, sino también proporcionando estabilidad mecánica, permeabilidad al gas y al agua, y una reserva de calcio para el embrión en desarrollo. Las cáscaras de huevo de tortuga de agua dulce se clasifican como "rígidas" en función de su estructura, y debido a su disponibilidad han recibido una atención significativa de los biólogos1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Detallamos métodos simples para un fácil examen de las membranas de cáscara de huevo y concha de tortuga pintada que se pueden aplicar a cualquier especie rígida de cáscara de huevo. Las metodologías de preparación se evaluaron en función de la calidad de imagen resultante y la reducción de los artefactos potenciales.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fischer Scientific</td><td>S25127A</td><td>para cultivos de portaobjetos</td></tr><tr><td>Trozo de alfiler de aluminio</td><td>Tedpella</td><td>16111</td><td>12,7 mm x 8 mm</td></tr><tr><td>BD Difco Medios de cultivo deshidratados: Agar patata dextrosa</td><td>BD 213400</td><td>DF0013-17-6</td><td>Medios para el aislamiento y cultivo de hongos, levaduras y mohos</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Fischer BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>Antibiótico para medios de comunicación</td></tr><tr><td>Vermiculita gruesa</td><td>invernadero Megastore</td><td>SO-VER-12</td><td>cama mediana</td></tr><tr><td>Transparente placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>07-201-589</td><td>para la fijación de embriones</td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>Fischer Scientific</td><td>S17525B</td><td>para el cultivo de portaobjetos</td></tr><tr><td>Secador de punto crítico</td><td>Quorum CPD</td><td>EMS850</td><td>Secado de punto crítico</td></tr><tr><td>Platos de cultivo</td><td>Fischer Scientific</td><td>08 747B</td><td>PLATO PETRI 100X10MM 12/PK</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A406P 4</td><td>agente de deshidratación</td></tr><tr><td>Pinzas - Aquarius Pinzas</td><td>Tedpella</td><td>5804</td><td>estilo 4, longitud 108 mm, ancho x espesor 0,017 x 0,17 mm</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Fischer Scientific</td><td>G151-1</td><td>fijador</td></tr><tr><td>Objetivo de oro para recubridor de pulverización catódica</td><td>DENTON VACUUM</td><td>TAR001-0158</td><td>Objetivo de oro, 2.375 y Prime; D X .002 y primo;</td></tr><tr><td>Hexametildisilazana</td><td>Fischer Scientific</td><td>C19479-5000</td><td>agente de secado químico</td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimtech</td><td>S-8115</td><td>limpieza</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>67-762-16</td><td>para cultivo de portaobjetos</td></tr><tr><td>Tijeras de microscopía</td><td>Tedpella</td><td>1327</td><td>Doble punta, acero inoxidable, 100 mm L (3-5/8").</td></tr><tr><td>Microtijeras</td><td>Tedpella</td><td>1346</td><td>Tipo Vannas, recta, 80 mm</td></tr><tr><td>L Moria Cuchara de embrión perforada</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Longitud 14,5 cm, diámetro de la punta 20 mm, profundidad de la cuchara 5 mm</td></tr><tr><td>Insertos Netwell</td><td>Corning</td><td>0330B09</td><td>15 mm Insertos con 74 &micro; m Tamaño de malla La membrana de poliéster actúa como prácticos portadores durante el procesamiento de muestras en diferentes solventes</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fischer Scientific</td><td>T353 500</td><td>fijador</td></tr><tr><td>Musgo de turba</td><td>Walmart- Miracle Gro</td><td>551705263</td><td>medio de cama</td></tr><tr><td>PELCO tabs cinta conductora de carbono de doble adherencia</td><td>Tedpella</td><td>5000</td><td>12 mm de diámetro exterior</td></tr><tr><td>Recubrimiento por pulverización catódica</td><td>DENTON</td><td>VACUUM DESK V</td><td>revestimiento metálico fino</td></tr><tr><td>SEM</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JSM 6610LV microscopía electrónica de barrido</td><td></td></tr></tbody></table>

procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Aunque la microscopía electrónica de barrido (SEM) está siendo ampliamente utilizada para el análisis ultraestructural de diversas muestras biológicas y no biológicas, los métodos involucrados en el procesamiento de diferentes muestras biológicas implican prácticas únicas. Todas las prácticas convencionales descritas en la literatura para el procesamiento de muestras todavía encuentran aplicaciones útiles, pero los cambios sutiles en la preparación de la muestra pueden alterar la calidad de la imagen, así como, introducir artefactos. Por lo tanto, se requiere el uso de una técnica única de preparación de muestras específica para el tipo de tejido analizado para obtener una imagen de buena calidad con resolución ultraestructural. El enfoque de este estudio es proporcionar los protocolos óptimos de preparación de muestras para la toma de imágenes embriones, cáscaras de huevo rígidas y cultivos de hongos utilizando SEM. Se recomendaron las siguientes optimizaciones para obtener buenos resultados para las tres muestras biológicas delicadas diferentes estudiadas. El uso de fijadores más suaves como 4% paraformaldehído o 3% glutaraldehído seguido de deshidratación con series de etanol es obligatorio. El micelio fúngico en bloques de agar obtenidos por cultivos de diapositivas produce una mejor integridad ultraestructural en comparación con los cultivos tomados directamente de placas de agar. El secado químico de embriones con HMDS proporciona secado sin introducir artefactos de tensión superficial en comparación con el secado de punto crítico. HMDS previene el agrietamiento causado por la contracción, ya que las muestras son menos frágiles durante el secado. Sin embargo, para el cultivo de hongos, el secado de puntocrítico proporciona una calidad de imagen aceptable en comparación con el secado químico. Las cáscaras de huevo se pueden crear imágenes sin pasos de preparación especiales, excepto para el lavado a fondo y el secado al aire antes del montaje. Las metodologías de preparación se estandarizaron en función de la calidad de imagen aceptable obtenida con cada ensayo.

La Figura 1 muestra el análisis micrográfico de electrones de barrido de embriones de tortuga pintada (Chrysemys picta). Se utilizaron huevos de tortuga pintados recogidos e incubados en un medio de cama, montados en talones de aluminio después del secado químico para imágenes SEM (Figura1A-E). Una vista lateral de un embrión en la etapa 12 muestra las estructuras craneofaciales; prominencia maxilar se extiende más allá de la mandibula...

Aquí, presentamos protocolos de procesamiento detallados para la toma de imágenes de muestras de tejido delicadas utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM). Tres métodos de procesamiento diferentes, a saber, el secado químico de hexametil disilazana (HMDS), el secado simple al aire y el secado de puntocrítico se describen para preparar cáscaras de huevo rígidas, embriones en etapas tempranas del desarrollo y cultivos de hongos, respectivamente.

Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Contamos con protocolos estandarizados de preparación de muestras para embriones de tortuga pintados por imágenes, cáscaras de huevo rígidas y cultivos de hongos utilizando microscopía electrónica de barrido. Estos métodos integrales utilizan alteraciones sutiles en los protocolos conocidos para procesar tres tejidos delicados permitiendo la diferenciación entre las estructuras originales y el procesamiento de los artefactos. Demostrando el procedimiento conmigo será Jessica Gibbons, una estudiante graduada de mi laboratorio.Antes de recoger los huevos de tortuga de un sitio de campo durante la temporada de anidación, haga de cuatro a seis agujeros de 0,25 centímetros a lo largo de los lados de las cajas de plástico y en sus tapas para permitir la aireación. Antes de llenar las cajas con una mezcla húmeda de vermiculita y mezcla de lecho de musgo de turba en una proporción de uno a uno. En el lugar de anidación, retire suavemente el suelo para descubrir los huevos y limpie la superficie de cada huevo de tortuga con una tintura de yodo diluida para proteger contra la contaminación microbiana durante la incubación.Coloque un máximo de ocho a nueve huevos por caja en la misma orientación y alineación que se colocaron, manteniendo las garras individuales separadas entre sí. Una vez recogidos todos los huevos, entierre manualmente la mitad de los huevos en la ropa de cama y coloque las cajas tapadas dentro de una incubadora de 30 grados Celsius durante 10 a 17 días para obtener embriones embrionarios 12, 13 y 18 respectivamente. Agregue agua destilada para humedecer parcialmente el medio de la cama cada dos días para evitar la deshidratación y para mantener el nivel de humedad para el desarrollo normal de embriones.En la etapa apropiada de desarrollo, utilice tijeras puntiagudas para hacer un corte en un lado de la cáscara de huevo dorsal y la membrana de la yema juntos, vertical al eje largo del huevo. A continuación, corta el otro lado del óvulo a lo largo del eje corto, y usa fórceps para abrir la pieza extirpada con el lado del embrión hacia arriba. Corte el otro lado lateral de la cáscara de huevo y coloque la pieza de cáscara extirpada en PBS.Usando un estereomicroscopio y fórceps, pela el embrión y la membrana de la yema de la cáscara de huevo. Utilice los fórceps y micro tijeras para eliminar las membranas embrionarias adicionales, y utilice una cuchara embrionaria para transferir el embrión a un plato Petri de PBS fresco. Después de lavar la sangre y la yema, coloque hasta tres embriones por pozo de una placa de 12 pozos, que contiene un 4% de paraformaldehído a cuatro grados centígrados durante dos o tres días.Cuando las muestras parezcan blancas, utilice inserciones de poliestireno con fondos de malla de poliéster para enjuagar los embriones con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado. Después del último lavado, deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol durante una hora por concentración. Después de la segunda inmersión en etanol, seque los embriones en una serie de concentraciones de HMDS a etanol durante 20 minutos por inmersión con los platos Petri parcialmente cubiertos.A continuación, coloque los embriones en una solución final 100%HMDS, total o parcialmente cubierto en una campana de humo durante la noche. El secado lento aumentando gradualmente la concentración de HDMS a etanol es importante para revelar una excelente estructura superficial en los embriones. A la mañana siguiente, utilice cinta conductora de carbono de doble palo para montar cuidadosamente las muestras completamente secas en un talón de pasador de aluminio estándar.Cuando todas las muestras hayan sido montadas, introduzca las muestras en la cámara de la recubridora para recubrir los especímenes con una película muy delgada de oro durante 60 a 120 segundos a una boquilla de 35 miliamperios. A continuación, fije firmemente los tornillos de fijación para montar los talones en las placas de vertido correspondientes. Utilice la herramienta de intercambio de muestras para transferir el portacuchillas a la cámara de muestra del microscopio electrónico de barrido para obtener imágenes.Para preparar cáscaras de huevo para escanear la microscopía electrónica, coloque las cáscaras de huevo en agua destilada durante al menos una hora después de la cosecha del embrión para eliminar cualquier contaminación por yema o albúmina. A continuación, seque al aire las cáscaras de huevo limpias en delicadas toallitas antiestáticas en la campana de humo durante la noche. Almacene las cáscaras de huevo secas en botellas limpias de muestras, etiquetadas por número y etapa embrionaria.A continuación, monte, cubra la capa e imagen de los especímenes de cáscara de huevo como se acaba de demostrar para los embriones. Para establecer cultivos de hongos deslizantes, utilice un bisturí estéril para cortar bloques de medio a tres cuartos de pulgada de agar dextrosa de patata sólida, y coloque los bloques en diapositivas de microscopio de vidrio individuales. Coloque palillos de dientes estériles en la parte inferior de los platos limpios de Petri para elevar los portaobjetos de ellos para crear tensión superficial entre la placa y el portaobjetos.Coloque cada diapositiva sobre los palillos de dientes en el plato de Petri. A continuación, utilice un bucle estéril para transferir hongos desde el inóculo de la muestra a cada uno de los cuatro lados laterales de un bloque de agar. Agregue unas gotas de agua destilada estéril al plato Petri alrededor del portaobjetos para asegurar la humedad de los hongos en crecimiento.Selle parcialmente la placa con película de parafina y coloque la placa en la incubadora de 30 grados Celsius durante el período de incubación adecuado para las especies de hongos. Al final de la incubación, retire el portaobjetos de la placa Petri y utilice fórceps estériles para transferir el bloque de agar bien adherido del portaobjetos a un recipiente de 3%glutaraldehído para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, deshidrate las muestras en una serie ascendente de etanol durante 15 minutos por concentración.Después de la inmersión del 90%, procesar las muestras para la deshidratación final con dos cambios de 30 minutos en 100% etanol para asegurar una saturación completa antes de colocar las muestras deshidratadas en la cámara del aparato de secado de punto crítico. Selle la cámara y abra las válvulas para permitir que el dióxido de carbono líquido se desahoge y deje que el etanol se ventile hasta que el dióxido de carbono líquido llene completamente la cámara. A continuación, selle y caliente lentamente la cámara para lograr un punto crítico cuando la presión de la cámara supere las 1.000 libras de presión por pulgada cuadrada, la temperatura supere los 31 grados centígrados y el espacio líquido y gas de dióxido de carbono está en equilibrio.A continuación, drene lentamente el dióxido de carbono de la cámara y la muestra como un gas, para evitar cualquier efecto de tensión superficial en la muestra, y monte, placa e imagen de las muestras de hongos como se demuestra. Una vista lateral del micrográfico electrónico de barrido de un embrión de tortuga pintado en etapa 12 revela cómo la prominencia maxilar se extiende más allá del mandibular y limita mediamente un pozo nasal bien marcado. También se pueden observar cinco arcos faríngeos.En un embrión de etapa 15, las somitas recién formadas son visibles en la región posterior de la cola del embrión, y los cogollos de la extremidad delantera apuntan más cortally que ventralmente. Un crecimiento bien definido de una cresta de caparazón también se puede visualizar a lo largo de toda la región del flanco interlimb del embrión. En la etapa 18, se ha formado un hocico corto y débilmente proyectado con un pico inferior ligeramente volcó con un gancho terminal que cabe en la muesca central del pico superior.La mandíbula superior exhibe una apariencia muesca, y un pequeño diente de huevo se puede ver formando en la punta de la mandíbula superior. El análisis ultraestructural de la cáscara de huevo Chrysemys picta y la membrana de la cáscara mediante la microscopía electrónica de barrido, revela una capa externa de cáscara de huevo calcarinus, firmemente unida a la membrana filamentosa interna de la cáscara. La superficie exterior de la cáscara de huevo consiste en unidades de cáscara mineralizadas bien distinguidas hechas de nódulos esféricos globulares dispuestos en grupos y entre unidades adyacentes de concha, con una concentración de pequeñas depresiones redondeadas o poros de varios tamaños.Las metodologías comunes no se pueden generalizar para todas las muestras biológicas para lograr una calidad de imagen decente utilizando SEM. Las alteraciones únicas como se ha demostrado son esenciales para un tipo de tejido específico. El método químico y de secado de aire también podría utilizarse para otras muestras orgánicas, y la técnica de cultivo de deslizamiento de acoplamiento podría utilizarse para todos los cultivos microbianos blandos y robustos.

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