Name: Un modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada por la instilación unilateral de ácido intrabronal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Aprende a inducir lesión pulmonar aguda unilateral en ratones mediante instilación intrabronquial selectiva de ácido. Este modelo reproducible permite estudiar la inflamación y su resolución en el pulmón izquierdo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores quieren agradecer al Dr. Joseph Mizgerd sus contribuciones al desarrollo del método selectivo intrabronquial y por sus comentarios útiles y revisión del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones P01GM095467 (B.D.L.) y K08HL130540 (R.E.A.).

Todos los procedimientos de animales a continuación han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Brigham and Women's Hospital (Protocolo #2016N000356).
NOTA: Se siguió la técnica estéril para todos los procedimientos de supervivencia. Se estableció un campo estéril para cada cirugía utilizando una toalla de cortina estéril, mientras que los cirujanos llevaban guantes quirúrgicos estériles, gorras, máscaras y abrigos de laboratorio limpios. Todos los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados usando un autoclave, y la esterilidad se mantuvo usando un esterilizador de cuentas.
1. Preparación de 0,1 N HCl
<ol><li>Añadir 11 ml de ddH2O a una botella de vidrio ámbar. Añadir lentamente 1 ml de 37% de HCl (12 N) para crear un stock de trabajo de 1 N HCl. PRECAUCION: Asegúrese de que HCl se añade al agua. Esto es un problema de seguridad porque agregar agua directamente al ácido puede hacer que el ácido hierva y saque la botella. Cuando manipule HCl concentrado, asegúrese de que el ácido se mantiene en una campana química ventilada y se usa el equipo de protección personal adecuado, incluyendo capa de laboratorio, guantes y gafas de seguridad.</li>
	<li>Añadir lentamente 4 ml de la culata de trabajo HCl previamente diluida en 35 ml de ddH2O en un tubo cónico de 50 ml para crear un stock experimental de 0,1 N HCl.</li>
	<li>Mida el pH del material experimental utilizando una sonda electrónica de pH después de una calibración de dos puntos utilizando soluciones de pH bajo. Valorar a pH 1.1 utilizando soluciones de stock NaOH o HCl según sea necesario para que el volumen final sea de 40 ml. NOTA: Medir los valores bajos de pH puede ser difícil. Para garantizar una medición precisa, asegúrese de que la sonda de pH esté correctamente calibrada utilizando estándares de pH bajos para evitar la extrapolación excesiva de la medición.</li>
	<li>Inmediatamente antes del experimento, filtre 1–2 ml de la población experimental de HCl a través de un filtro estéril de 0,22 m en un tubo de microcentrífuga estéril.</li>
</ol>2. Insinsisiación intrabronquial selectiva de HCl
<ol><li>
Preparación del área quirúrgica
	<ol>
<li>Inducir la anestesia general mediante la entrega de una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) por inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado apretando suavemente la punta de la cola o del pie trasero. Se requiere falta de respuesta de abstinencia antes de hacer una incisión cutánea.  Administrar bolos de anestesia adicionales, si es necesario.</li>
		<li>Entregar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea bajo el cuello. El analgésico preoperatorio fortalecerá el efecto de la anestesia y aliviará el dolor pre y postoperatorio resultante del procedimiento.</li>
		<li>Utilice cortadoras eléctricas para afeitar suavemente el área quirúrgica en la superficie ventral del ratón, debajo de la barbilla en la región cervical de la garganta, utilizando golpes lentos hacia abajo. Retire el pelaje suelto para exponer completamente la piel subyacente.</li>
		<li>Preparar el área quirúrgica frotando el sitio afeitado con 10% de solución de povidona-yodo. Después de aplicar la solución aséptica, limpie el sitio con un hisopo de alcohol isopropílico del 70%. Repita este paso 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislar la tráquea
	<ol>
<li>Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla quirúrgica limpia y cubra el ratón en una cortina quirúrgica estéril mientras mantiene la exposición del área quirúrgica. Asegure la cortina en su lugar.</li>
		<li>Hacer una incisión longitudinal de 0,5 cm en la piel por encima de la tráquea y las glándulas salivales. Utilice fórceps serrados ligeramente curvados para retirar cuidadosamente la piel y separar suavemente las glándulas salivales para exponer los músculos traqueales.</li>
		<li>Usando fórceps serrados para la disección contundente, aparta suavemente los músculos paratraqueales y se burla de la fascia que rodea la tráquea hasta que los anillos cartilaginosos de la tráquea estén completamente expuestos.</li>
		<li>Utilice fórceps serrados completamente curvados para levantar la tráquea y separar el tejido conectivo entre la retro-tráquea y la retro-fascia. Una vez que el tejido conectivo está separado, la punta de los fórceps debe deslizarse completamente detrás de la tráquea.</li>
		<li>Mantenga los fórceps curvos detrás de la tráquea y agarre una pieza de 10-15 cm de sutura de seda trenzada 4-0 con las puntas de los fórceps. Tire de la sutura detrás de la tráquea para que haya una longitud uniforme a cada lado.</li>
		<li>Una vez que la sutura esté en su lugar, tire suavemente de los lados de la sutura hacia la parte posterior del ratón y mantenga los lados en su lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cannulación selectiva del bronquio del tronco principal izquierdo e inculcación de HCl
	<ol>
<li>Tome un angiocatéter de 24 G x 3/4" e inserte la aguja, biselado hacia arriba, en la región anterior de la tráquea entre el primer y el segundo anillo traqueato. Una vez que la inserción adecuada se confirma mediante la visualización directa de la punta de la aguja en el lumen traqueal, suelte la sutura y avance la cánula sobre la aguja y en la tráquea hasta que se alcance la resistencia, luego retire la aguja. Angulo la dirección de inserción hacia el bronquio del tallo principal izquierdo para la insinstalación selectiva en el pulmónizquierdo.</li>
		<li>Una vez que la cánula esté en su lugar, sujete firmemente el puerto de inyección para evitar que el catéter se desplace.</li>
		<li>Usando una pipeta P200 y puntas estériles de pipeta P200, inundar 2,5 ml/kg (50 ml para un ratón de 20 g) de ratón estéril filtrado 0,1 N HCl en el catéter, seguido de un volumen idéntico de aire.</li>
		<li>Retire rápidamente el catéter y levante la placa quirúrgica a un ángulo de 60o durante 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cierre del área quirúrgica
	<ol>
<li>Poner la tabla quirúrgica plana y retirar la sutura de detrás de la tráquea.</li>
		<li>Utilice la sutura de seda trenzada recubierta de cera 4-0 para cerrar la incisión de la piel con 2-3 puntos de sutura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Atención postoperatoria
<ol><li>Una vez cerrada la incisión, coloque el ratón en su lado izquierdo sobre una almohadilla de calentamiento caliente hasta que el ratón se recupere de la anestesia. Comience a monitorear el ratón para el dolor y el nivel de actividad antes de devolverlo a la carcasa normal. NOTA: La buprenorfina se debe administrar a 0,1 mg/kg por vía subcutánea cada 6-12 h durante las primeras 24 horas. Si hay dolor de ruptura persistente, extienda el régimen analgésico hasta que el dolor disminuya.</li>
</ol>4. Lavado broncoalveolar de pulmón entero (BAL) e inmunofenotipado de leucocitos
<ol><li>
Euthanizar el ratón mediante la administración de 3x la dosis de ketamina/xilazina utilizada en el paso 2.1.1.
	<ol>
<li>Para diferenciar los neutrófilos intersticiales e intravasculares, inyectar por vía intravenosa un anticuerpo Ly6G seleccionado etiquetado como Ly6G 5 minutos antes de la eutanasia. Esta etiqueta debe ser adecuada para la detección por citometría de flujo para distinguir los neutrófilos intravasculares de los neutrófilos pulmonares intersticiales y alveolares, que se etiquetarán durante la preparación del tejido con un fluoróforo diferente (ver más abajo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una tabla quirúrgica y enganche los incisivos anteriores alrededor de un bucle de sutura de seda trenzada 2-0.</li>
	<li>Siga los pasos 2.2.2–2.2.6. para preparar la tráquea para la cánulation. NOTA: Asegúrese de que el diafragma no esté perforado para maximizar la presión de inflado trans-alveolar durante el lavado pulmonar; el cumplimiento pulmonar izquierdo disminuye después de la lesión, que puede requerir un mayor requisito de presión transalveolar para el lavado pulmonar.</li>
	<li>Canalizar la tráquea siguiendo el paso 2.3.1, pero no avanzar el catéter por debajo de la carina; insertar el catéter paralelo a la tráquea.</li>
	<li>Con el catéter insertado, ate la sutura alrededor de la tráquea para mantener el catéter en su lugar.</li>
	<li>Inculque y retire dos alícuotas consecutivas de 1 ml de PBS helado -/- (sin magnesio ni calcio) con 0,6 mM de EDTA utilizando una jeringa de 1 cc. Para inmunofenotipado mediante citometría de flujo, retire cada alícuota y vuelva a un tubo FACS de poliestireno de 5 ml sobre hielo.</li>
	<li>Para asegurar la eutanasia, realice una toracotomía con tijeras quirúrgicas seguidas de punción cardíaca. Los pulmones se pueden cosechar para su posterior procesamiento.</li>
	<li>Centrifugar el BAL durante 10 min a 800 g a 4 oC para peletizar las células.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y alícuota en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Conservar a -80oC para su posterior análisis.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en PBS -/- con 2% de FBS para el análisis diferencial de leucocitos por citometría de flujo.</li>
	<li>Para diferenciar los neutrófilos intersticiales e intravasculares, retire el pulmón izquierdo y derecho por separado y procese los pulmones para la citometría de flujo como en Abdulnour et al. 20146.</li>
	<li>Manchar la suspensión celular resultante utilizando anticuerpos FACS seleccionados, asegurándose de manchar Ly6G que se conjuga con un fluoróforo diferente al anticuerpo Ly6G del paso 4.1.1.</li>
</ol>5. Evaluación de la permeabilidad de la barrera alveolar utilizando el tinte azul de Evan (EBD)
<ol><li>Inyectar por vía intravenosa el tinte azul de Evan (40 mg/kg) 30 minutos antes de la eutanasia.</li>
	<li>Eutanasia del ratón con sobredosis de ketamina/xilazina (paso 4.1).</li>
	<li>Para medir la integridad de la barrera alveolar, siga los pasos 4.2–4.9 para la recolección de BAL.</li>
	<li>Transfiera 100 l de BALF a una microplaca de 96 pocillos de fondo transparente, junto con 100 s de estándares EBD duplicados. Utilice PBS -/- como espacio en blanco.</li>
	<li>Utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia del BALF a 620 nm y 740 nm. Utilice la absorbancia a 740 nm para corregir la contaminación del heme en las muestras7.</li>
	<li>Para medir la integridad de la barrera vascular, perfundie los pulmones inyectando lentamente 5 ml de PBS helada -/- a través del ventrículo derecho del corazón. Retire el pulmón izquierdo.</li>
	<li>Secar el pulmón izquierdo durante 72 h a 58 oC para eliminar el exceso de agua.</li>
	<li>Procesar el tejido pulmonar seco como en Radu y Chernoff 20138, y medir las absorbancias a 620 nm y 740 nm.</li>
</ol>6. Histología pulmonar
<ol><li>Canine la tráquea siguiendo los pasos 4.1–4.5.</li>
	<li>Para fijar la presión de los pulmones a 20 cm H2O, utilice un soporte de anillo y una abrazadera para elevar una jeringa de 60 ml equipada con tubo controlado por válvula y llena de una solución fijativa selecta (por ejemplo, fijador de zinc) de modo que el menisco de la solución fijativa esté 20 cm por encima de la Pulmones.</li>
	<li>Fije el tubo al catéter y abra el valor. Llene lentamente los pulmones con fijadores hasta que dejen de inflarse.</li>
	<li>Retire el catéter 3/4 de la salida de la tráquea. Ate la tráquea con sutura antes de retirar completamente el catéter para minimizar la pérdida de fijador.</li>
	<li>Retire los pulmones y el corazón en bloque. NOTA: Asegúrese de que los pulmones no estén perforados durante la extracción para retener el fijador infundido por presión.</li>
	<li>Fijar los pulmones durante 24 h en 25 ml de fijador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los pulmones fijos durante intervalos secuenciales de 20 minutos en PBS -/-, 30% etanol y 50% etanol.</li>
	<li>Después del último lavado, almacenar los pulmones en 70% etanol para el procesamiento histológico como en Eickmeier et al. 20139.</li>
</ol>

<ol><li>Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaron%2C+RM+%22Harrison%27s+Principles+of+Internal+Medicine%2C+20e%22">Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e</a>. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).</li>
<li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+Patterns+of+Care%2C+and+Mortality+for+Patients+With+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome+in+Intensive+Care+Units+in+50+Countries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries.</a> The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>The ARDS Definition Task. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+The+Berlin+DefinitionThe+Berlin+Definition+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS.</a> The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).</li>
<li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).</li>
<li>Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+Proresolving+Mediators+in+Innate+and+Adaptive+Immune+Responses+in+Airway+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases.</a> Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maresin+1+biosynthesis+during+platelet-neutrophil+interactions+is+organ-protective%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526(2014).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+permeability+assessed+by+fluorescent-labeled+dextran+instilled+intranasally+into+mice+with+LPS-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062(2013).</li>
<li>Eickmeier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+reduces+mucosal+inflammation+and+promotes+resolution+in+a+murine+model+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury.</a> Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+isoforms+differentially+regulate+leukocyte+responses+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).</li>
<li>Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclooxygenase+2+Plays+a+Pivotal+Role+in+the+Resolution+of+Acute+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury.</a> Journal of Immunology. 174 (8), 5033(2005).</li>
<li>Colby, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D3+and+Aspirin-Triggered+Resolvin+D3+Are+Protective+for+Injured+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).</li>
<li>Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+by+polyisoprenyl+phosphates+in+neutrophil-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).</li>
<li>Mandell, L. A., Niederman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aspiration Pneumonia.</a> New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).</li>
<li>Seki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-inflammatory+and+proresolving+mediator+resolvin+E1+protects+mice+from+bacterial+pneumonia+and+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).</li>
<li>Abdulnour, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+is+produced+during+self-resolving+gram-negative+bacterial+pneumonia+and+regulates+host+immune+responses+for+the+resolution+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation.</a> Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).</li>
<li>Traber, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-epithelial+cross+talk+coordinates+synthesis+of+the+tissue-protective+cytokine+leukemia+inhibitory+factor+during+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia.</a> American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lung+epithelium+in+neutrophil+recruitment+during+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).</li>
<li>Acute Respiratory Distress Syndrome Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+with+Lower+Tidal+Volumes+as+Compared+with+Traditional+Tidal+Volumes+for+Acute+Lung+Injury+and+the+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+activates+xanthine+oxidoreductase+through+MAP+kinase-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).</li>
<li>Serhan, C. N., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+in+inflammation%3A+emergence+of+the+pro-resolving+superfamily+of+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de instilación intrabronal descrito aquí utiliza la cannulación selectiva del bronquio del tronco principal izquierdo para inculcar HCl en el pulmón izquierdo, lo que resulta en una lesión pulmonar aguda murina unilateral y autolimitada. Este modelo de lesión pulmonar de ácido murino representa de cerca la respuesta inflamatoria, histopatología y disfunción fisiológica que se observa en el ARDS humano, donde la aspiración de ácido gástrico es un factor precipitante o factorcontribuyente 4común. La exposición de las vías respiratorias murinas a un PCl de bajo pH da como resultado una mayor permeabilidad de la barrera alveolar-capilar, edema alveolar e infiltración profunda de neutrófilos en el lugar de la lesión. Estos eventos no se observan en el pulmón derecho no lesionado. Además, este modelo produce respuestas inflamatorias rápidas que alcanzan su punto máximo dentro de las 24 horas después de la instilación ácida, y comparte cambios en la expresión génica con ARDS humano, como la expresión diferencial de la fosfolipasa D isoforma10.
Aunque este modelo preclínico murino reproduce muchas de las características de ardo a nivel molecular, celular y tisular, no recapitula completamente el ARDS humano. La definición de ARDS incluye la afectación pulmonar bilateral3, mientras que el método de inscripción descrito aquí resulta por diseño en enfermedad pulmonar unilateral. Además, los animales no requieren ventilación mecánica continua, inmovilidad o sedación parenteral. Los resultados presentados aquí (vide supra) y otros lugares6,9,11,12,13 demuestran que la lesión pulmonar unilateral inducida por ácido reproduce la mayoría de las señas de identidad patológicas de ARDS al tiempo que proporciona la oportunidad única de utilizar el pulmón derecho como control interno y para estudiar la fase de resolución de esta enfermedad. Como tal, el modelo discutido aquí modela la patobiología ARDS, pero también permite la investigación mecanicista de las respuestas fundamentales del tejido pulmonar a las lesiones y los mecanismos de resolución que pueden ser relevantes para abordar esta importante enfermedad.
La instilación de HCl representa una lesión pulmonar aguda directa, por lo que está modelando aspectos de la fisiopatología asociada con la neumonitis por aspiración. Además, el insulto pulmonar izquierdo inicial en este modelo se genera utilizando HCl estéril en lugar de contenido gástrico cargado de bacterias visto en algunos eventos de aspiración humana que también pueden conducir a neumonía14. En los seres humanos, la aspiración de bacterias patógenas puede dar lugar a neumonía bacteriana secundaria que exacerba la respuesta inflamatoria aguda, prolongando la lesión pulmonar inicial y aumentando la susceptibilidad del paciente para desarrollar ARDS14. Esta posible limitación ha sido abordada por los investigadores que inculcaron deliberadamente bacterias patógenas Escherichia coli (E. coli)15 después de HCl estéril, este método se ha utilizado para investigar inflamación; La neumonía bacteriana unilateral puede ser inducida por la instilización selectiva del pulmón izquierdo de bacterias, como E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, y Streptococcus pneumoniae18 . El modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada descrito aquí también se puede utilizar para estudiar la lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI), una causa importante de aumento de la mortalidad en el ARDShumano 19. Los modelos animales experimentales de VILI suelen implicar ventilación mecánica en ratones ingenuos con volúmenes de marea que son mucho más altos que lo que se utiliza clínicamente para causar lesiones pulmonares (>15 ml/kg; ver trabajos anteriores20,21). Hacia un modelo más relevante clínicamente de VILI, la instilación de ácido intrabronal como se describe aquí puede utilizarse primero para inducir lesiones pulmonares no letales seguidas de ventilación mecánica en volúmenes de marea dentro del rango clínico (6-12 ml/kg). Este modelo hipotético animal puede permitir a los investigadores estudiar el VILI de una manera clínicamente relevante una vez desarrollado y validado. Juntos, estos modelos murinos destacan la versatilidad del método selectivo de instilación intrabronquial para generar insultos pulmonares unilaterales que se asemejan mucho a patologías asociadas con enfermedades pulmonares humanas.
Además de permitir la instilación selectiva de varios agentes nocivos en el pulmón izquierdo, la técnica de instilación intrabronal después de la traqueotomía no requiere entrenamiento prolongado, tiempo de procedimiento prolongado o equipo complejo, y en manos experimentadas causa una angustia mínima a los animales. A pesar de esto, pueden ocurrir varios problemas durante el procedimiento selectivo de instilación de HCl que pueden afectar los resultados experimentales. La cannulación inadecuada del bronquio del tallo principal izquierdo puede dar lugar a una lesión pulmonar bilateral que disminuye la supervivencia de ratones experimentales y confunde el uso del pulmón derecho como un control interno no lesionado. Esto se puede evitar mediante la pesca del catéter lo suficiente hacia el pulmón izquierdo durante la cannulación hasta que se alcance la resistencia. Después de la inyección de HCl, se debe inyectar un bolo de aire, extraer rápidamente el catéter y llevar la placa quirúrgica en posición vertical a un ángulo de 60o. Estos pasos son cruciales para asegurar que el ácido llegue a las vías respiratorias distales del pulmón izquierdo y previene el reflujo de ácido en el pulmón derecho y la tráquea, que puede causar lesiones proximales. Dentro de las 24 h después de la instilación, la lesión en el pulmón izquierdo es difusa con un edema pulmonar extenso, que afecta tanto al pulmón izquierdo distal como proximal.
Durante el desarrollo del método en ratones adultos adultos de 8-12 semanas de edad, 2,5 ml/kg de HCl intrabronal produjo una lesión pulmonar aguda sustancial pero subletal; dosis más bajas de HCl no dieron lugar a lesiones pulmonares reproducibles y homogéneas. Aunque no hemos realizado este modelo en ratones más jóvenes (por ejemplo, de 3-6 semanas de edad) o mayores (por ejemplo, 10-14 meses de edad), anticipamos que la dosificación basada en el peso de HCl dará lugar a una lesión pulmonar fenotipo similar a lo que se observa en ratones de 8-12 semanas de edad. Recomendamos que los investigadores valoren las dosis de HCl para lograr el grado deseado de lesión pulmonar antes de realizar experimentos con ratones en extremos de peso.
Este procedimiento selectivo de instilación ácida ofrece un modelo murino no letal de inflamación del tejido estéril que reduce la necesidad de cuidados de apoyo, como la ventilación mecánica. Con la supervivencia prolongada de los ratones lesionados, la inflamación inducida por ácido stiene suficiente tiempo para resolverse. La fase de resolución de este modelo se ha utilizado para identificar mediadores de lípidos bioactivos endógenos regulados temporalmente, llamados mediadores pro-resolución (SPR) especializados, como lipoxina A4 (LXA4),decolora 1 (MaR1) y resolvins6 ,11,12,16. La administración de EMM exógenas a ratones lesionados acelera la resolución de lesiones pulmonares inducidas por ácido al amortiguar los mecanismos inflamatorios y promover la catabase del tejido pulmonar lesionado. Estos EPYME promueven el aclaramiento del edema alveolar12, aumentan la eferocytosis de los neutrófilos apoptóticos por macrófagos reclutados16, y aceleran la reepitelización de las vías respiratorias y alvéolos12 para reducir la vascular fugas e hipoxia tisular. En un modelo de lesión pulmonar inducida por patógenos, 15-epi-resolución D1 también exhibió acciones antimicrobianas a través del aumento de la fagocitosis bacteriana por macrófagos y el aclaramiento bacteriano mejorado del pulmón infectado16. La investigación de estos mecanismos de resolución endógenas proporciona información sobre posibles estrategias terapéuticas novedosas para pacientes con ARDS5.
Para estudiar mejor la regulación espaciotemporal de los mecanismos de resolución, se necesitan modelos experimentales in vivo. Los modelos de lesiones pulmonares agudas deben incluir respuestas inflamatorias agudas relevantes y disfunción orgánica con compromiso de resolución del huésped que promueva procesos moleculares y celulares. Estos mecanismos pueden cuantificarse utilizando los índicesderesolución 22 establecidos. El método selectivo de instilación intrabronal para generar lesiones pulmonares agudas unilaterales ha demostrado ser útil a este respecto para sondear mediadores y vías de resolución endógena. Estudios futuros que profundizan nuestra comprensión de estos procesos de resolución activa tienen la promesa de conducir a agonistas terapéuticos que imitan las bioacciones de los mediadores lipídicos endógenos para mejorar la resolución de la inflamación y mitigar la morbilidad mortalidad por sades y otras enfermedades pulmonares importantes.

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SADe) es una causa importante de insuficiencia respiratoria aguda1. Es una enfermedad común y letal o incapacitante que ocurre en el 10% de todos los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos en todo el mundo2. Según la definición3de Berlín, el ARDS se define por la aparición aguda de insuficiencia respiratoria hipoxémica (<1 semana) e infiltrados pulmonares bilaterales en radiografías torácicas que no se explican por insuficiencia cardíaca4. La patobiología subyacente se caracteriza por una respuesta inflamatoria excesiva. El pulmón puede lesionarse directamente, como neumonía o con aspiración de ácido gástrico, o indirectamente, como en sepsis o después de múltiples transfusiones de sangre4. Tras el insulto inicial, la patogénesis de la ARDS progresa en tres fases: fases exudativas, proliferativas y fibrosas1. Estas fases se caracterizan por distintos mecanismos moleculares y celulares inmunes y de reparación que determinan el pronóstico para los pacientes con Síndrome de SIS. La atención de apoyo sigue siendo el pilar para los pacientes con SDR; actualmente, no existen tratamientos farmacológicos eficaces para la SADR,por lo que es urgente una nueva investigación sobre esta devastadora condición 4.
La desregulación de la respuesta inmunitaria innata durante la fase exudativa contribuye a la aparición aguda de la sARAS y la insuficiencia respiratoria asociada1. Potente mediador proinflamatorio que orquesta las respuestas inmunitarias iniciales, lo que conduce a la interrupción de la barrera alveolar-capilar, el edema alveolar difuso y la infiltración de neutrófilos en el sitio de la lesión del tejido pulmonar4. En ARDS, las señales de frenado ineficaces para la inflamación aguda predisponen a la insuficiencia pulmonar y pueden retrasar la catabase oportuna del tejido pulmonar lesionado5. Para ello, la investigación preclínica sobre los mecanismos endógenos de iniciación y pro-resolución del SADE puede descubrir nuevas estrategias terapéuticas. Dicha investigación requiere modelos experimentales in vivo autolimitados de lesión pulmonar aguda que se asemejen mucho a las características de la ARDS humana, permitiendo el interrogatorio de los mecanismos subyacentes a las fases de iniciación y resolución de la lesión tisular.
El modelo murino presentado aquí produce una lesión pulmonar aguda directa que demuestra los procesos patobiológicos cardinales de la ARDS exudativa, a saber, la interrupción de la barrera alveolar-capilar e la infiltración de neutrófilos. El método se basa en la instilación intrabronal selectiva de HCl a través de la cannulación del bronquio del tronco principal izquierdo, localizando la lesión y la respuesta inflamatoria al pulmón izquierdo; el pulmón derecho no lesionado se puede utilizar como un control interno para determinaciones selectas de lesión e inflamación tisular. Además, la lesión pulmonar unilateral no es letal y revela un programa de resolución. Esto ofrece una ventana distinta en la resolución de la inflamación pulmonar que se puede aprovechar para la identificación de mediadores endógenos pro-resolución y mecanismos celulares y para abrir nuevas vías terapéuticas para ARDS que enfatiza la fisiología de la resolución y Farmacología.

<table><tbody><tr><td>10x Fijador de Zinc</td><td>BD Biosciences</td><td>552658</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Sutura de seda trenzada</td><td>Especialidades Quirúrgicas</td><td>SP118</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4" Safelet Desechable Catéter I.V.</td><td>Excel</td><td>26751</td><td></td></tr><tr><td>33 mm, 0.22 &; unidad de filtro de jeringa</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4" de largo dentado de curva ligera Pinza de Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de Graefe de curva completa dentada de punta larga de 4"</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>4.5 " Tijeras de micro disección Roboz</td><td></td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>6" Portaagujas de madera crile</td><td>Roboz</td><td>RS-7860</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 60 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo FITC-Ly6G</td><td>antiratón Thermo Fisher Scientific</td><td>11-9668-82</td><td>Se puede utilizar el fluoróforo preferido</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón PE-Ly6G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-9668-82</td><td>Se puede utilizar el fluoróforo preferido</td></tr><tr><td>Esterilizador</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>perlas Betadine Solution Swabstick</td><td>Betadine</td><td>67618-153-01</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5</td></tr><tr><td>Microplaca transparente de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbeccos sin tecnologías de Ca2+ o Mg+</td><td>life</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Cortaúñas</td><td></td><td></td><td></td>eléctricas</tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla</td><td></td><td></td><td></td>térmica</tr><tr><td>Ácido clorhídrico, 37%</td><td>Millipore-Sigma</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry-Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas (640, 720 nm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>P200</tr><tr><td>Puntas de pipeta P200</td> Sonda <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>pH Soporte de anillo con abrazadera</td><td></td><td></td><td></td>de extensión</tr><tr><td>Almohadillas de preparación de alcohol estéril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Cortina de ratón estéril de 8" x 8" con adhesivo ovalado Fenestración</td><td>Steris</td><td>88VCSTF</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo estériles</td><td>Kimberly-Clark</td><td>56890</td><td></td></tr><tr><td>Cortina de remolque estéril</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Recubierta de cera 4-0 Sutura de seda trenzada</td><td>Covidien</td><td>SS733</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>AKORN</td><td></td><td>NDC: 59399-111-50</td></tr></tbody></table>

un modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada por la instilación unilateral de ácido intrabronal

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

La instilación intrabronal selectiva del ácido clorhídrico (HCl) al bronquio del tronco principal izquierdo murino causa lesiones agudas del tejido con hallazgos histopatológicos similares al síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (ARDS). El edema alveolar resultante, el daño de la barrera alveolar-capilar y la infiltración de leucocitos afectan predominantemente al pulmón izquierdo, preservando el pulmón derecho como un control no lesionado y permitiendo que los animales sobrevivan. Este modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada permite la investigación de mecanismos de resolución de tejidos, como la eferocittosis de macrófagos de neutrófilos apoptoticos y la restitución de la integridad de la barrera alveolar-capilar. Este modelo ha ayudado a identificar funciones importantes para los agonistas de resolución, incluidos los mediadores pro-resolución (SEMP) especializados, proporcionando una base para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para los pacientes con SRAS.

La instilación selectiva intrabronal de HCl da como resultado una lesión pulmonar aguda unilateral
El método de insinfección intrabronquial selectiva de HCl en el bronquio del tronco principal izquierdo se ilustra en la Figura 1A. La consecuente lesión pulmonar aguda implica todo el pulmón izquierdo, y tras la administración intravenosa de EBD y perfusión pulmonar, la EBD permaneció sólo en el pulmón izquierdo (Figura1B). Se cuantificó la extravasación de EBD en el pulmón izquierdo y se constató que aumentaba significativamente en relación con la inscriplación selectiva falsa (Figura1C;adaptada de Abdulnour et al. 20146). En respuesta a una lesión pulmonar, los leucocitos circulantes se diáparte en el tejido inflamado. En este modelo, los neutrófilos vasculares sufren migración transendotelial hacia el intersticio pulmonar lesionado. Neutrófilos intersticiales acumulados en el pulmón izquierdo 24 h después de la instilación de HCl, en contraste con el pulmón derecho donde se observan pocos neutrófilos intersticiales (Figura1D). Estos resultados indican que el método selectivo de instilación intrabronquial del tronco principal izquierdo dio lugar a una lesión pulmonar aguda murina que se localizó en gran medida en el pulmón izquierdo y produjo cambios patológicos que también se ven con el SADe, incluido el aumento brecha de barrera alveolar-capilar e infiltración de neutrófilos.
La lesión pulmonar aguda unilateral permite la investigación de mecanismos de resolución
Para estudiar la fase de resolución de los ratones con lesión pulmonar aguda inducida por ácido deben ser capaces de sobrevivir al insulto inicial. Distinta de la HCl intratraqueal, la instilación en solo el bronquio del tronco principal izquierdo conduce a una lesión autolimitada con supervivencia uniforme en ratones sanos. Los pulmones se pueden obtener de ratones en los primeros o más tarde en los puntos de tiempo como en la Figura 2A. La histología pulmonar muestra lesión tisular e inflamación a nivel orgánico y celular con inflamación exudativa 24 h después de la lesión caracterizada por edema alveolar marcado e infiltración de neutrófilos en el pulmón izquierdo. Tenga en cuenta que no hay ninguna lesión significativa o afluencia de leucocitos en el pulmón derecho de control no lesionado (Figura2A). 72 h después de lesiones, edema e infiltrados celulares disminuyen sustancialmente, lo que representa una fase exudativa resolutiva. Los neutrófilos alveolares pueden ser monitoreados por citometría de flujo (CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+) obtenidopor lavado pulmonar entero. Los neutrófilos aumentan en el pulmón izquierdo 24 h después de la lesión inicial y disminuyen sustancialmente a 48 y 72 h (Figura2B). Si se investigan los puntos de tiempo posteriores, los números de neutrófilos volverán a la línea de base y se pueden estudiar los mecanismos en fases posteriores de catabasis, como las respuestas fibroproliferativas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2.jpg"> Figura 1: La instilación selectiva intrabronal de HCl produce una lesión pulmonar unilateral definida por la violación de la barrera alveolar y la infiltración de neutrófilos. (A) Representación de la cannulación del bronquio del tronco principal izquierdo murino para la instilación selectiva de HCl en el pulmón izquierdo. (B) Pulmones rectos derecho (RL) e izquierdos (LL) expuestos a la instilación selectiva de ácidos y perfundidos tras el tinte azul de Evan intravenoso. (C) Cuantificación del tinte azul intersticial de Evan a partir de pulmón homogeneizado y perfundido 24 h después de una lesión ácida o control falso; figura adaptada de Abdulnour et al. 20146. Los valores representan la media de sem, donde n a 5. *p &lt; 0.05, Mann-Whitney U Test. (D) Citometría de flujo representativa de intravascular (I.V.; fluoróforo 1) e intersticial (I.S.; fluoróforo 2) neutrófilos como porcentaje del total de CD45+ células en el pulmón procesado 24 h después de una lesión ácida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig2.jpg"> Figura 2: La lesión pulmonar aguda unilateral se autoresolven. (A) Histología representativa H&amp;E (10x) de los pulmones izquierdos obtenidos de ratones ingenuos (0 h) o ratones 24, 48, 72 h después de la lesión, junto con el pulmón derecho asociado del mismo ratón (Barra de escala de 250 m). (B) Citometría de flujo representativa de neutrófilos alveolares (Ly6G+ CD11b+) obtenida del lavado pulmonar entero como porcentaje del total de CD45+ células en ratones o ratones ingenuos (0 h) 24, 48 y 72 h después de una lesión ácida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La instilación selectiva de ácido intrabronal en el pulmón izquierdo en ratones da lugar a una lesión pulmonar aguda unilateral y autolimitada que modela el síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (ARDS) inducido por la aspiración de ácido gástrico.

Un modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada por la instilación unilateral de ácido intrabronal

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...

El método intragu bronquial selectivo es significativo porque ofrece a los investigadores un modelo reproducible y no letal para el estudio de la lesión pulmonar aguda, una de las principales causas del síndrome de dificultad respiratoria aguda en humanos. La ventaja de la técnica selectiva intra bronquial es la localización de la respuesta inflamatoria al pulmón izquierdo ofreciendo el pulmón derecho como un control no lesionado y minimizando la angustia animal. Demostrar este procedimiento estará Alexander Tavares, un técnico y estudiante pregraduado en nuestro laboratorio.Para preparar 0,1 ácido clorhídrico normal, añadir 11 mililitros de agua doble destilada a una botella de vidrio ámbar, seguido de la adición lenta de un mililitro de ácido normal al 37%12. A continuación, agregue lentamente cuatro mililitros de un caldo de trabajo ácido normal en 35 mililitros de agua destilada doble en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilice una sonda de pH electrónica para medir el pH de la solución de stock normal 0,1, valorando a un pH de 1,1 utilizando hidróxido de sodio o solución de stock ácido según sea necesario a un volumen final de 40 mililitros.Antes de comenzar el procedimiento, filtre de uno a dos mililitros de la solución ácida a través de un filtro estéril de 0,22 microlitros en un tubo de microcentrífuga estéril y confirme la falta de respuesta al reflejo del dolor en un ratón anestesiado. El uso de pinzas eléctricas en golpes lentos hacia abajo afeite suavemente el área quirúrgica en la superficie ventral del ratón debajo de la barbilla en la región cervical de la garganta. Retire cualquier cabello suelto y frote la piel expuesta con tres solución consecutiva de 10%povidona-yodo y 70%hisopos de alcohol isopropílico.Cuando la piel haya sido preparada, coloque el ratón en la posición supina en una tabla quirúrgica limpia y cubra al animal con una cortina quirúrgica estéril. Haz una abertura longitudinal de 0,5 centímetros en la piel por encima de la tráquea y las glándulas salivales, y usa fórceps serrados ligeramente curvados para retraer cuidadosamente la piel. Separe suavemente las glándulas salivales para exponer los músculos traqueales y use fórceps serrados ligeramente curvados para separar suavemente los músculos paratraqueales.Elimina la fascia que rodea la tráquea hasta que los anillos cartilaginosos de la tráquea estén completamente expuestos, y usa fórceps serrados completamente curvados para trabajar el tejido conectivo entre la retrotraquea y la retrofascia. Deslice los fórceps serrados completamente curvados detrás de la tráquea y levante la tráquea. Una vez que la punta de los fórceps esté detrás de la tráquea, agarre una pieza de 10 a 15 centímetros de sutura de seda trenzada de 4-0 con las puntas de los fórceps y tire de la sutura detrás de la tráquea para que haya una longitud uniforme a cada lado.La placa quirúrgica se puede girar para acercar el área quirúrgica a la mano dominante para los siguientes pasos. A continuación, tire suavemente de los extremos de la sutura hacia la parte anterior del ratón, y mantenga los extremos en su lugar. Para la cánula del bronquio del tronco principal izquierdo, exponga la aguja de un angiocatéter de calibre 24 por 3/4 pulgadas e inserte el lado biselado de la aguja hacia arriba en la región interior de la tráquea entre el primer y segundo anillos traqueales.Cuando la punta de la aguja se pueda visualizar dentro del lumen traqueal, suelte la sutura y avance la cánula sobre la aguja en la traquea que se inclina hacia el lado posterior izquierdo del ratón. Cuando se encuentren resistencias, retire la aguja. Una vez que la cánula esté en su lugar, sujete firmemente el puerto de inyección para evitar que el catéter se desplace y asegure una punta de micropipeta P-200 dentro del puerto.A continuación, infunda 50 microlitros de la solución de ácido normal 0,1 filtrada en el catéter, seguido de un volumen igual de aire. Este paso requiere una manipulación precisa de la cánula, mientras que las vías respiratorias están obstruidas, y deben completarse rápida y suavemente para restaurar el flujo de aire adecuado y minimizar el daño de las vías respiratorias. Retire rápidamente el catéter e incline la placa quirúrgica en un ángulo de 60 grados.Después de 30 segundos, poner la placa quirúrgica plana, y quitar la sutura de detrás de la tráquea. A continuación, utilice una sutura de seda trenzada recubierta de cera 4-0 para cerrar la incisión de la piel con dos o tres puntos de sutura. La lesión pulmonar aguda resultante de la instilación del ácido intra bronquial involucra todo el pulmón izquierdo.De hecho, después de la administración intravenosa de tinte azul Evans y perfusión pulmonar, el tinte se detecta sólo dentro del pulmón izquierdo. La cuantificación de la extravasación del tinte en el pulmón izquierdo aumenta significativamente en relación con la instilación selectiva falsa. Los neutrófilos intersticiales se acumulan en el pulmón izquierdo 24 horas después de la instilación del ácido en contraste con el pulmón derecho en el que se observan pocos neutrófilos intersticiales.La histología pulmonar revela lesión tisular e inflamación a nivel de órganos y celulares con inflamación exudativa 24 horas después de la lesión, como se caracteriza por un edema alveolar marcado y una infiltración de neutrófilos dentro del pulmón izquierdo. Tenga en cuenta que la falta de lesión significativa o la afluencia de leucocitos en el pulmón derecho de control no lesionado. 72 horas después de la lesión, el edema y los infiltrados celulares disminuyen sustancialmente representando una fase exudativa de resolución.Según lo evaluado por la citometría de flujo, los neutrófilos alveolares aumentan en el pulmón izquierdo 24 horas después de la lesión inicial, y disminuyen sustancialmente a las 48 y 72 horas. Es importante visualizar el catéter en la tráquea antes de avanzar. Angulo la cánula hacia el bronquio del tronco principal izquierdo durante la inserción y siga la instilación ácida con 50 microlitros de aire.Se pueden realizar análisis de líquidos de lavado broncoalveolar, histología pulmonar, fenotipado de células inmunitarias por citometría de flujo, imágenes de ratón en vivo y pruebas de función pulmonar para evaluar la inflamación y la resolución. El desarrollo de este modelo auto limitado de lesión pulmonar aguda ha permitido a los investigadores hacer contribuciones significativas al campo de la biología de la resolución. Recuerde que el ácido clorhídrico concentrado es peligroso y que debe ser manejado en una capucha química que lleve el equipo de protección personal adecuado.

a-model-self-limited-acute-lung-injury-unilateral-intra-bronchial

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un modelo murino de lesión pulmonar inducida por ventilador es una herramienta importante para el estudio de una lesión pulmonar...

La presión de la ventilación controlada para inducir la lesión pulmonar aguda en ratones

Hemos desarrollado un modelo de lesión pulmonar en ratón mediante inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo imita la lesión pulmonar durante la neumonía y es clínicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

Este protocolo induce una lesión pulmonar aguda en un ratón que tiene una estrecha fidelidad a la patogenia de la neumonitis ácida observada en los humanos. Generamos una lesión pulmonar aguda no letal máxima de pH bajo y tenemos en cuenta las diferencias en la estructura respiratoria anatómica entre roedores y humanos utilizando una traqueostomía abierta junto con la liberación de presión circunferencial.

La traqueostomía abierta ácido gástrico aspiración modelo murino de lesión pulmonar aguda Resultados en máxima no letal aguda lesión pulmonar

Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Describimos un modelo de síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) inducido por ácido clorhídrico en lechones que reciben sedación con agentes halogenados, isoflurano y sevoflurano, a través de un dispositivo utilizado para la sedación de cuidados intensivos inhalados. Este modelo se puede utilizar para investigar los mecanismos biológicos de los agentes halogenados en la lesión y reparación pulmonar.

Entrega de agente halogenado en modelo porcino de síndrome de dificultad respiratoria aguda a través de un dispositivo tipo unidad de cuidados intensivos

Una combinación de lavado con surfactante con solución salina al 0,9% (35 ml/kg de peso corporal, 37 °C) y ventilación de alto volumen corriente con PEEP baja para causar lesión pulmonar inducida por ventilador moderado (VILI) da como resultado un síndrome experimental de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Este método proporciona un modelo de lesión pulmonar con capacidad de reclutamiento baja / limitada para estudiar el efecto de varias estrategias de ventilación durante períodos...

El agotamiento del surfactante combinado con ventilación perjudicial da como resultado un modelo reproducible del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA)

El presente protocolo describe un modelo de lesión pulmonar en ratones que utilizan ácido oleico para imitar el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Este modelo aumenta los mediadores inflamatorios en el edema y disminuye la distensibilidad pulmonar. El ácido oleico se utiliza en forma de sal (oleato) ya que esta forma fisiológica evita el riesgo de embolia.

Modelo murino del síndrome de dificultad respiratoria aguda inducido por ácido oleico

Este manuscrito describe el establecimiento de un modelo infeccioso de neumonía en ratones y la respectiva caracterización de la resolución de lesiones junto con métodos para el crecimiento de bacterias y la instilación intratraqueal. También se describe un enfoque novedoso que utiliza citometría de flujo de alta dimensión para evaluar el panorama inmunitario.

Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Aprende a inducir lesión pulmonar aguda unilateral en ratones mediante instilación intrabronquial selectiva de ácido. Este modelo reproducible permite estudiar la inflamación y su resolución en el pulmón izquierdo.

Un modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada por la instilación unilateral de ácido intrabronal

Explorar más videos