Name: Sistema microdrive híbrido con sonda de optosilicio recuperable y tetroda para grabación de alta densidad de doble sitio en ratones en movimiento libre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a construir un microdrive híbrido con tetrodos y sonda de optosilicio recuperable para grabación de alta densidad en ratones en movimiento libre. Este sistema permite registrar señales neuronales y aplicar optogenética simultáneamente en múltiples regiones cerebrales.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de las Becas de Investigación en el Extranjero de la Ciencia (HO), el Programa de Académicos Dotados (TK), el Programa de Ciencia de la Frontera Humana (TK), la Fundación para la Investigación Cerebral (TK), la Adquisición de Ciencia sindicación y tecnología y Programa de Retención (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), y por The Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Investigator Research Grant (JY). Agradecemos a W. Marks por valiosos comentarios y sugerencias durante la preparación del manuscrito.

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo demuestra cómo construir e implantar una matriz híbrida de micromotores que permite el registro de actividades neuronales desde dos áreas cerebrales utilizando tetrodes ajustables independientes y una sonda de silicio en ratones que se comportan libremente. También demuestra experimentos optogenéticos y la recuperación de la sonda de silicio después de los experimentos. Mientras que la sonda de silicio ajustable33 o la implantación de la sonda de optosilicio36 ...

Es crucial entender cómo la actividad neuronal apoya el proceso cognitivo, como el aprendizaje y la memoria, investigando cómo diferentes regiones cerebrales interactúan dinámicamente entre sí. Para esclarecer la dinámica de la actividad neuronal subyacente a las tareas cognitivas, se ha llevado a cabo electrofisiología extracelular a gran escala en animales en movimiento libre con la ayuda de matrices de micromotores1,2,3, 4. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios tipos de matriz demicromotores para implantar electrodos en múltiples regiones cerebrales para ratas 5,6,7,8 y ratones9, 10 , 11 , 12. Sin embargo, los diseños actuales de microunidades generalmente no permiten el uso de múltiples tipos de sonda, lo que obliga a los investigadores a elegir un solo tipo de electrodo con beneficios y limitaciones específicas. Por ejemplo, las matrices de tetrodes funcionan bien para regiones cerebrales densamente pobladas como el hipocampo dorsal CA11,13, mientras que las sondas de silicio dan un mejor perfil geométrico para el estudio de las conexiones anatómicas14 , 15.
Tetrodes y sondas de silicio se utilizan a menudo para la grabación crónica in vivo, y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Se ha demostrado que los tetrodes tienen ventajas significativas en un mejor aislamiento de una sola unidad que los electrodos individuales16,17,además de la rentabilidad y la rigidez mecánica. También proporcionan mayores rendimientos de las actividades deuna sola unidad cuando se combinan con micromotores 8,18,19,20. Es esencial aumentar el número de neuronas simultáneamente registradas para entender la función de los circuitos neuronales21. Por ejemplo, se necesita un gran número de celdas para investigar pequeñas poblaciones de tipos de células funcionalmente heterogéneos, como22 relacionados con el tiempo o recompensar la codificación23 celdas. Se requieren números de celda mucho más altos para mejorar la calidad de decodificación de las secuencias de picos13,24,25.
Los tetrodes, sin embargo, tienen una desventaja en el registro de células distribuidas espacialmente, como en la corteza o el tálamo. A diferencia de los tetrodes, las sondas de silicio pueden proporcionar distribución espacial e interacción de potenciales de campo locales (LFP) y actividades de espiga dentro de una estructura local14,26. Las sondas de silicio multivástago aumentan aún más el número de sitios de grabación y permiten la grabación en estructuras individuales o vecinas27. Sin embargo, tales matrices son menos flexibles en el posicionamiento de los sitios de electrodos en comparación con los tetrodios. Además, se requieren algoritmos complejos de clasificación de picos en sondas de alta densidad para extraer información sobre los potenciales de acción de los canales vecinos para reflejar los datos adquiridos por los teturos28,29,30. Por lo tanto, el rendimiento general de las unidades individuales es a menudo menor que los tetrodes. Además, las sondas de silicio son desventajosas debido a su fragilidad y alto costo. Por lo tanto, la elección de tetrodes frente a las sondas de silicio depende del objetivo de la grabación, que es una cuestión de si se prioriza la obtención de un alto rendimiento de unidades individuales o perfiles espaciales en los sitios de grabación.
Además de registrar la actividad neuronal, la manipulación optogenética se ha convertido en una de las herramientas más potentes en neurociencia para examinar cómo los tipos y/o vías celulares específicos contribuyen a las funciones del circuito neural13,31, 32,33. Sin embargo, los experimentos optogenéticos requieren una consideración adicional en el diseño de la matriz de micromotores para conectar el conector de fibra a las fuentes de luz de estimulación34,35,36. A menudo, la conexión de fibra óptica requiere una fuerza relativamente grande, lo que puede conducir a un cambio mecánico de la sonda en el cerebro. Por lo tanto, no es una tarea trivial combinar una fibra óptica implantable con matrices de micromotores convencionales.
Por las razones anteriores, los investigadores están obligados a optimizar la selección del tipo de electrodo o a implantar una fibra óptica dependiendo del objetivo de la grabación. Por ejemplo, los tetrodes se utilizan para lograr un mayor rendimiento unitario en el hipocampo1,13, mientras que las sondas de silicio se utilizan para investigar el perfil de profundidad laminar de áreas corticales, como la corteza entorrinal medial (MEC)37. Actualmente, se han notificado micromotores para la implantación simultáneade tetrodes y sondas de silicio para ratas 5,11. Sin embargo, es extremadamente difícil implantar múltiples tetrodios y sondas de silicio en ratones debido al peso de las microunidades, espacio limitado en la cabeza del ratón y requisitos espaciales para diseñar el micromotor para emplear diferentes sondas. Aunque es posible implantar sondas de silicio sin micromotor, este procedimiento no permite el ajuste de la sonda y reduce la tasa de éxito de la recuperación de sondas de silicio12,38. Además, los experimentos optogenéticos requieren consideraciones adicionales en el diseño de matrices de micromotores. Este protocolo demuestra cómo construir e implantar una matriz de micromotores para la grabación crónica en ratones en movimiento libre, lo que permite la implantación de nueve tetrodes ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable. Esta matriz de micromotores también facilita los experimentos optogenéticos y la recuperación de la sonda de silicio.

<table><tbody><tr><td>#00-90 tornillo</td><td>J.I. Morris</td><td>#00-90-1/8</td><td>tornillos EIB</td></tr><tr><td>#0-80 tuerca</td><td></td> de <td>latón B00DGB7CT2 para sujetar el soporte de la férula de fibra</td><td></td></tr><tr><td>#0-80 tornillo</td><td>Piezas pequeñas</td><td>B000FMZ57G</td><td>Tornillo de metal de latón para montaje del conector de la sonda, soporte de férula de fibra y cono de protección</td></tr><tr><td>Tubos de polieteretercetona de 22 Ga Piezas</td><td>pequeñas</td><td>SLPT-22-24</td><td>para sujetar a la lanzadera, tubo de acero inoxidable de 23 Ga de diámetro interior de 0,025 pulgadas</td></tr><tr><td></td><td>Piezas pequeñas</td><td>HTX-23R</td><td>para tetrodo</td></tr><tr><td>Alambre de acero inoxidable de 23 Ga</td><td>Piezas pequeñas</td><td>HTX-23R-24-10</td><td>para alambre de soporte en forma de L</td></tr><tr><td>Alambre de acero inoxidable de 26 Ga</td><td>Piezas pequeñas</td><td>GWX-0200</td><td>para postes guía</td></tr><tr><td>Alambre de acero inoxidable de 30 Ga</td><td>Piezas pequeñas</td><td>HTX-30R</td><td>para tetrode</td></tr><tr><td>Paquete de software CAD 3D</td><td>Dassault Syst&egrave; Impresora</td> 3D mes <td>SolidWorks 2003</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FormLab</td><td>Form2</td><td></td></tr><tr><td>Tubos aislantes de poliimida de 5,5 milésimas de pulgada</td><td>HPC Medical</td><td>72113900001-012</td><td></td></tr><tr><td>cinta de papel de aluminio</td><td>Tyco Tyco</td><td>Tyco Adhesives 617022</td> para <td>el cono de blindaje alternativo</td></tr><tr><td>pasta conductora</td><td>YSHIELD</td><td>HSF54</td><td>para cono</td></tr> <tr><td>de blindajetornillos personalizados para microaccionamiento de sonda de silicona</td><td>AMT</td><td>UNM1.25-HalfMoon</td><td>tornillo inoxidable de media luna, 1,5 mm de diámetro, 300 y micro; Tornillos</td></tr><tr><td>personalizados de paso de rosca m para Tetrode Microdrive</td><td>AMT</td><td>Yamamoto_0000-160_9mm</td><td>tornillo inoxidable ranurado, 0,5 mm de diámetro, 160 y micro; Paso de rosca M, hecho a medida por encargo para nuestro diseño</td></tr><tr><td>acrílico dental</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>resina para modelos dentales</td><td>FormLab</td><td>RS-F2-DMBE-02</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta rotativa Dremel</td><td>Dremel</td><td>modelo 800</td> a broca <td>amoladora</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tool</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>placa de interfaz eléctrica</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-Narrow</td><td></td></tr><tr><td>epoxi</td><td>Devcon</td><td>GLU-735.90</td><td>5 minutos</td></tr><tr><td>ungüento epoxi para los ojos</td><td>Dechra</td><td>Puralube Ungüento oftálmico</td><td>para evitar que los ojos de los ratones se sequen durante la cirugía</td></tr><tr><td>lámina de pulido de fibra</td><td>Thorlabs</td><td>LFG5P</td><td>para pulir las</td></tr><tr><td>pinzas finas</td> de fibra óptica <td>Protech International</td><td>15-368</td><td>para cargar/recuperar la sonda de silicona</td></tr><tr><td>oro pines</td><td>Neuralynx</td><td>EIB Pines Pequeño</td><td></td></tr><tr><td>cable</td><td>de tierra A-M Systems</td><td>781500</td><td>0.010 pulgadas alambre de plata desnudo</td></tr><tr><td>preamplificador de headstage</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36</td><td></td></tr><tr><td>medidor de impedancia</td><td>BAK electronics</td><td>Modelo IMP-2</td><td>1 kHz frecuencia de prueba</td></tr><tr><td>aceite mineral</td><td>ZONA</td><td>36-105</td><td>para lubricar tornillos y alambres fibra</td></tr><tr><td>óptica</td><td>Doric</td><td>MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de grabación</td><td>Neuralynx</td><td>Digital Lynx 4SX</td><td></td></tr> trazador <tr>de<td>fibra rubí</td><td>Thorlabs</td><td>S90R</td><td>para cortar la</td></tr><tr><td>grasa de silicona</td> de fibra óptica <td>Fine Science Tool</td><td>29051-45</td><td></td></tr><tr><td>sonda de silicio</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-Edge-5mm-20-177</td><td>Fig. 3, 4A, 4B, 5</td></tr><tr><td>sonda de silicona</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-6mm-50-177</td><td>Fig. 4C</td></tr> solución de <tr><td>lavado de sonda de silicona</td><td>Alcon</td><td>AL10078844</td><td>limpiador de lentes de contacto</td></tr><tr><td>lubber de silicona</td><td>Smooth-On</td><td>Dragon Skin 10 FAST</td><td>para la preparación de moldes de microdrive</td></tr><tr><td>pintura plateada</td><td>GC electronic</td><td>22-023</td><td>impresión de plata II recubrimiento, utilizado para cables de tierra</td></tr><tr><td>tornillo de cráneo</td><td>Otto Frei</td><td>2647-10AC</td><td>0,8 mm de diámetro, 0,200 mm de paso</td></tr><tr><td>de rosca tijeras quirúrgicas estándar</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>aparato estereotáxico</td><td>Kopf</td><td>Modelo 942</td><td></td></tr><tr><td>superpegamento</td><td>Loctite</td><td>LOC230992</td> para aplicar a las pinzas quirúrgicas de <td>los postes guía</td></tr><tr><td></td><td>ROBOZ</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Tetrode Twister</td><td>Jun Yamamoto</td><td>TT-01</td><td></td></tr><tr><td>Cables de tetrodo</td><td>Sandvik</td><td>PX000004</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema microdrive híbrido con sonda de optosilicio recuperable y tetroda para grabación de alta densidad de doble sitio en ratones en movimiento libre

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

Las grabaciones neuronales multirregionales pueden proporcionar información crucial para comprender las interacciones de escala de tiempo fino entre varias regiones cerebrales. Sin embargo, los diseños de microunidades convencionales a menudo solo permiten el uso de un tipo de electrodo para grabar desde una o varias regiones, lo que limita el rendimiento de grabaciones de una sola unidad o perfil de profundidad. También a menudo limita la capacidad de combinar grabaciones de electrodos con herramientas optogenéticas para apuntar a la vía y / o actividad específica del tipo de célula. Aquí se presenta una matriz de microunidades híbridas para ratones en movimiento libre para optimizar el rendimiento y una descripción de su fabricación y reutilización de la matriz de microunidades. El diseño actual emplea nueve tetrodes y una sonda de optosilicio implantada en dos áreas cerebrales diferentes simultáneamente en ratones que se mueven libremente. Los tetrodes y la sonda de optosilicio son ajustables independientemente a lo largo del eje dorsoventral en el cerebro para maximizar el rendimiento de las actividades unitarias y oscilatorias. Esta matriz de micromotores también incorpora una configuración para la manipulación optogenética ligera y mediadora para investigar las respuestas y funciones específicas del tipo regional o celular de los circuitos neuronales de largo alcance. Además, la sonda de optosilicio se puede recuperar y reutilizar de forma segura después de cada experimento. Debido a que la matriz de microunidades consta de piezas impresas en 3D, el diseño de microunidades se puede modificar fácilmente para adaptarse a varios ajustes. Se describe por primera vez el diseño de la matriz de micromotores y cómo conectar la fibra óptica a una sonda de silicio para experimentos de optogenética, seguido de la fabricación del paquete de tetrodes y la implantación de la matriz en un cerebro de ratón. El registro de los potenciales de campo locales y el pico de unidad combinado con la estimulación optogenética también demuestran la viabilidad del sistema de matriz de micromotores en ratones que se mueven libremente.

La matriz de micromotores fue construida en 5 días. La cronología de la preparación de micromotores se describe en la Tabla2. Usando este micromotor, se implantaron nueve tetrodes y una sonda de silicio en el hipocampo CA1 y MEC del ratón [21 semanas de edad/29 g de peso corporal macho pOxr1-Cre (fondo C57BL/6)], respectivamente. Este ratón transgénico expresa Cre en las neuronas piramidales de capa III meC. El ratón se inyectó con 200 nL de AAV5-DIO-ChR2-YFP (titer: 7.7 x 1012 gc/mL) en el ME...

Este protocolo describe la construcción de una matriz híbrida de micromotores que permite la implantación de nueve tetrodios ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable en dos regiones cerebrales en ratones que se mueven libremente. También se ha demostrado un método para recuperar y reutilizar de forma segura la sonda de optosilicio para múltiples propósitos.

Sistema microdrive híbrido con sonda de optosilicio recuperable y tetroda para grabación de alta densidad de doble sitio en ratones en movimiento libre

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

Nuestro diseño híbrido de micromotores permite a los experimentadores no sólo grabar desde múltiples regiones cerebrales, sino también elegir diferentes tipos de electrodos para optimizar el rendimiento y la estabilidad. Combinamos nueve tetrodos, una sonda lineal de silicio y fibra óptica que son ajustables y reutilizables en una matriz de micromotores para experimentos in vivo con ratones en movimiento libre. Esta técnica se puede adaptar fácilmente a otros animales más grandes como ratas o marmotas.Las sondas de silicio son extremadamente frágiles. Tenemos que tener cuidado al tratar con las sondas, por ejemplo, al adaptar la fibra óptica y al girar el conjunto del volante en el micromotor. La matriz de micromotores consta de cinco partes.Para preparar el tornillo de micromotor para la sonda de silicio primero 3D imprimir un patrón de plástico de la micromotora y colocar la cinta alrededor del patrón para hacer una pared temporal alrededor del patrón. Vierta el gel de silicio líquido en el patrón y elimine las burbujas de aire con un suave temblor. Cuando el silicio se haya curado, retire cuidadosamente el molde de gel de silicio del patrón.A continuación, utilice una amoladora giratoria para cortar longitudes de 18 y 9,5 mm de tubo de alambre de acero inoxidable de calibre 23 y utilice la amoladora para áspera la parte superior de 2 a 3 mm de los tubos. Aplique un pequeño volumen de aceite de silicio a un tornillo personalizado y ajuste los tubos y atornille el molde. Vierta el acrílico dental en el molde y utilice una jeringa para eliminar cualquier burbuja de aire alrededor de los tubos y el tornillo.Cuando el acrílico dental se haya curado completamente, retire el tornillo de micromotor del molde y utilice alicates para doblar 6 mm desde un extremo de la punta del alambre de 18 mm hasta un ángulo de 60 grados. Con una herramienta de torneado, gire el tornillo de micromotor para comprobar la calidad y, a continuación, instale el tornillo de micromotor en el cuerpo de la matriz de micromotores y gire el tornillo para comprobar si es capaz de moverse hacia arriba y hacia abajo sin problemas. Para preparar el volante para la sonda de silicio utilice tijeras afiladas para cortar dos longitudes de 5 mm de PEEK y alinear los tubos a ambos lados de la lanzadera.Pegue los tubos a la lanzadera con epoxi y aplique un pequeño volumen de aceite de silicio a los postes guía. Cuando el epoxi se haya secado, coloque el volante sobre los postes guía del cuerpo de la matriz de micromotores para comprobar la calidad. El volante debe moverse suavemente sin fricción excesiva.Para preparar el optorode utilice un cortador Rubi para cortar un trozo de fibra óptica a 21 mm de longitud y moler la punta de fibra hasta que esté plana y brillante. Cuando la punta esté lista, coloque suavemente la fibra óptica en la parte frontal de la sonda de silicio de 200 a 300 micrómetros por encima de la parte superior de los sitios de electrodos y asegure temporalmente la fibra con cinta transparente y luego pegue la fibra óptica a la base de la sonda de silicio con un pequeño volumen de epoxi y permita que el epoxi se cure durante cinco horas. Para fijar el volante a la sonda de silicio, aplique un pequeño volumen de epoxi en la parte posterior de la base de la sonda de silicio y sostenga suavemente la parte inferior del volante contra la base de la sonda de silicio durante dos o tres minutos para evitar la formación de un hueco entre el volante y la base de la sonda de silicio.Cuando el epoxi se haya curado completamente, sostenga la ranura de la lanzadera con pinzas finas y utilice un microscopio para colocar cuidadosamente los tubos del volante en los postes guía del cuerpo principal. Gire el tornillo para insertar el tornillo de micromotor en el orificio del tornillo e inserte la punta del tubo en forma de L en la ranura del cabezal del volante para enganchar la sonda de silicio y el tornillo de micromotor. A continuación, corte dos tornillos número 0 a una longitud de rosca de 3,5 mm y muele las puntas para eliminar las rebabas.Coloque el soporte del conector de la sonda en el cuerpo de la matriz e inserte el conector eléctrico de la sonda de silicio en el soporte. Inserte los tornillos número 0 para sujetar el soporte del conector de la sonda. Utilice epoxi para fijar el conector de la sonda de silicio en el soporte teniendo cuidado de no pegar la sonda al cuerpo de la matriz de micromotores.Para fijar el soporte de la férula a la sonda de opto-silicio y al cuerpo de la matriz de micromotores, corte dos tornillos número 0 a una longitud de rosca de 6 mm y muele las puntas. Moler el exterior de dos tuercas de tornillo de la máquina número 0 para hacer tuercas hexagonales pequeñas con diámetros exteriores de 2,5 a 3 mm e insertar el tornillo número 0 en el componente A del soporte. Pegue las cabezas de tornillo con epoxi.Aplique un pequeño volumen de grasa de silicio a los componentes A y B para reducir la fricción con el cuerpo. Utilice pinzas inversas para insertar temporalmente el componente A en el cuerpo y coloque el componente B en los tornillos del componente A.Thread las tuercas personalizadas en los tornillos y utilice alicates para apretar las tuercas para fijar el soporte de la férula en el cuerpo. Inserte la férula de fibra en la ranura del soporte de la férula de fibra teniendo cuidado de que la férula de fibra se pegue de 4 a 5 mm fuera del soporte.Aplique una pequeña cantidad de epoxi entre la férula y la ranura del soporte. Cuando el epoxi esté curado, afloje las tuercas y gire el tornillo de micromotor para comprobar el movimiento suave del volante y del portabas y luego confirme que la punta de la sonda se retrae completamente en el cuerpo cuando el soporte de la férula está en la posición superior y los tubos del volante todavía están asociados con los postes de guía. Para fijar el cono protector, fije dos tornillos de 3,5 mm de número 0 desde el exterior del cono para mantener el micromotor en su lugar.La matriz de micromotores se puede configurar en un plazo de cinco días si la construcción se completa de acuerdo con la línea de tiempo descrita en la tabla. Después de que el rendimiento de comportamiento de ajuste de tetrodo se puede probar en una pista lineal y en un campo abierto. En ambos tipos de experimentos se permite que el ratón explore libremente durante aproximadamente 30 minutos, mientras que las señales electrofisiológicas se registran sin ruido severo relacionado con el movimiento durante toda la sesión de grabación.La estimulación de la luz se puede realizar en la corteza entorrinal medial para estimular las neuronas medial de la capa 3 de la corteza entorrinal que se proyectan hasta el subcampo CA1 del hipocampo. Las actividades de pico espontáneo y los potenciales de campo locales se registran a partir de los tetrodos y la sonda de silicio cuando el ratón está durmiendo. En este experimento representativo, los potenciales de campo izquierdo registrados en los tetrodos demostraron grandes actividades de ondulación que sugerían que todos los tetrodos se colocaron en las proximidades de la capa de células piramidales CA1.Las actividades de respuesta inducidas por la luz en este ensayo se observaron por primera vez en la corteza entorhinal medial seguidas de actividades dentro de CA1 con 13 a 18 milisegundos de latencia. Tenga cuidado de insertar la sonda de opto-silicio en el cuerpo del micromotor en un entorno libre de electrostático. El cono de protección se puede reemplazar con materiales como una hoja de papel y cinta adhesiva.Esto disminuirá la velocidad del micromotor hasta en un 20%Nuestro diseño de micromotor proporciona opciones flexibles para la combinación efectiva de electrodos de grabación para medir y manipular múltiples regiones cerebrales e investigar la dinámica e interacciones de diferentes estructuras cerebrales.

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Investigación

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Neurociencia

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